趙 楊 薛 晶 張建偉 申興斌

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科，河北 承德 067000)

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1 承德醫(yī)學(xué)院

胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白6在乳腺癌組織中的表達(dá)及意義

趙 楊 薛 晶1張建偉 申興斌

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科，河北 承德 067000)

目的 觀察胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白(IGFBP)-6在乳腺癌組織中的表達(dá)及意義。方法 對(duì)60例乳腺癌、60例乳腺纖維腺瘤、60例乳腺增生癥的標(biāo)本采用免疫組化法檢測(cè)IGFBP-6蛋白的表達(dá)情況，并用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)方法檢測(cè)乳腺癌、乳腺纖維腺瘤以及乳腺增生癥中IGFBP-6的基因表達(dá)情況。結(jié)果 乳腺癌組織中IGFBP-6蛋白的表達(dá)量明顯低于乳腺纖維腺瘤及乳腺增生癥中蛋白的表達(dá)情況(P<0.05)，且乳腺纖維腺瘤中IGFBP-6蛋白的表達(dá)量低于乳腺增生癥(P<0.05)；而在IGFBP-6 mRNA表達(dá)方面，乳腺癌高于乳腺纖維腺瘤及乳腺增生癥(P<0.01)，乳腺纖維腺瘤高于乳腺增生癥(P<0.01)。結(jié)論 IGFBP-6的表達(dá)水平可作為乳腺癌患者的預(yù)后及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況的相關(guān)因素，且可作為乳腺癌發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后的重要因素。

乳腺癌；胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白6；免疫組織化學(xué)；逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白(IGFBP)-6對(duì)胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)-Ⅱ有高度的親和力，并可調(diào)節(jié)IGF-Ⅱ的活性。IGFBP-6可作為潛在的抗癌靶點(diǎn)，具有正向調(diào)節(jié)與抗增殖同步效應(yīng)。體內(nèi)外研究證實(shí)IGFBP-6對(duì)某些腫瘤(乳腺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、肺癌、橫紋肌肉瘤等)細(xì)胞的生長(zhǎng)起到抑制作用〔1,2〕。乳腺癌轉(zhuǎn)移與否是患者死亡的主要原因，所以對(duì)患者的評(píng)定顯得尤其重要。在國(guó)內(nèi)外對(duì)于IGFBP-6與乳腺癌的研究尚未有明確報(bào)道，本研究通過(guò)免疫組化方法及逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)檢測(cè)乳腺癌組織中IGFBP-6的表達(dá)及其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2013年4月至2014年2月承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科乳腺癌手術(shù)切除石蠟標(biāo)本60例，年齡26～73(中位49.5)歲，所選乳腺癌均為浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌患者，且病理組織學(xué)分型為I級(jí)10例，Ⅱ級(jí)37例，Ⅲ級(jí)13例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者28例，29例患者腫瘤的大小≤2.5 cm，乳腺纖維腺瘤患者60例，年齡16～54歲(中位33歲)；乳腺增生癥患者60例，年齡21～60(中位43)歲。并同時(shí)將離體標(biāo)本在最短時(shí)間內(nèi)剪取50～100 g組織放在-80℃冰箱中以用于RT-PCR。所有標(biāo)本均經(jīng)病理主任醫(yī)師確診，癌癥患者術(shù)前未接受過(guò)任何形式的放化療治療。

1.2 免疫組化法檢測(cè)各種乳腺組織IGFBP-6蛋白的表達(dá)情況 采用免疫組化SP法檢測(cè)IGFBP-6蛋白的表達(dá)。選取經(jīng)處理好的蠟塊標(biāo)本進(jìn)行連續(xù)4 μm厚的切片，并采用防脫片玻片進(jìn)行常規(guī)脫水、脫蠟處理，消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性及檸檬酸抗原修復(fù)后，用正常血清封閉，依次加入一抗、二抗，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色、蘇木素復(fù)染、反藍(lán)后觀察結(jié)果。根據(jù)乳腺癌、乳腺纖維腺瘤、乳腺增生癥三個(gè)組的結(jié)果分別進(jìn)行對(duì)照分析并判斷結(jié)果。

1.3 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)檢測(cè)IGFBP-6 mRNA表達(dá)情況 用Trizol一步法提取RNA，用反轉(zhuǎn)錄酶AMV將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，IGFBP-6基因上游引物：5'CgA ggg gCT CAA ACA CTC TAC3'，下游引物：5'gCC AAC ACC AAC ACT CTT TC3'，擴(kuò)增產(chǎn)物339 bp；β-actin為內(nèi)參基因，其上游引物：5'AgC ggg AAA TCg TgC gTg AC3'，下游引物：5'ACA TCT gCT ggA Agg Tgg AC3'，擴(kuò)增產(chǎn)物:453 bp。取擴(kuò)增產(chǎn)物4 μl用0.4 g瓊脂糖與20 ml TBS配成凝膠電泳，通過(guò)溴乙啶(EB)染色后，在紫外熒光數(shù)字成像儀下照相，并進(jìn)行吸光度定量分析，以每例IGFBP-6與相應(yīng)β-actin擴(kuò)增產(chǎn)物條帶累積吸光度(IOD)的比值作為IGFBP-6 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 試劑 IGFBP-6購(gòu)自英國(guó)Abcam公司(1∶100稀釋)、DAB顯色劑來(lái)自福建邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司購(gòu)買(mǎi)，實(shí)驗(yàn)所需無(wú)水、乙醇、二甲苯均為分析純均由承德附屬醫(yī)院病理科提供，Trizol試劑購(gòu)自Invitrogen公司，IGFBP-6基因和β-actin均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.5 結(jié)果分析 通過(guò)顯微鏡高倍鏡對(duì)5個(gè)視野進(jìn)行觀察，按照陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)計(jì)算：>50%為3分，26%～50%為2分，11%～25%為1分，≤10%計(jì)為0分；按照著色的強(qiáng)度：棕黃色為3分，黃色為2分，淡黃色為1分，不著色為0分；兩種類(lèi)型相加做出陰陽(yáng)性判斷：6分為()，4～5分為()，2～3分為(+)，<2分為(-)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件行秩和檢驗(yàn)、t檢驗(yàn)和方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 乳腺組織中IGFBP-6蛋白的表達(dá) 在乳腺組織中IGFBP-6表達(dá)的陽(yáng)性部位主要位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，表現(xiàn)為棕黃色，見(jiàn)圖1。在三種乳腺組織中,乳腺癌患IGFBP-6的表達(dá)低于乳腺增生癥和乳腺纖維腺瘤的表達(dá)水平(P<0.01)，且乳腺增生癥與乳腺纖維腺瘤患者的IGFBP-6的表達(dá)水平無(wú)明顯差異(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 乳腺組織中IGFBP-6蛋白的表達(dá)(n=60,n)

與乳腺癌組比較：1)P<0.01

圖1 IGFBP-6在乳腺組織中的表達(dá)(DAB，×400)

2.2 IGFBP-6蛋白表達(dá)與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系 乳腺癌標(biāo)本中IGFBP-6蛋白與患者的年齡和乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管的不同組織學(xué)分級(jí)中的表達(dá)無(wú)明顯差異(P>0.05)；在腫瘤病灶較大且有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌中IGFBP-6的蛋白表達(dá)顯著低于腫瘤病灶較小及無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 IGFBP-6蛋白表達(dá)與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系(n)

2.3 各種乳腺組織中IGFBP-6 mRNA的表達(dá) IGFBP-6 mRNA在乳腺癌組的表達(dá)(0.39±0.05)高于乳腺纖維腺瘤組(0.60±0.05)及乳腺增生癥組(0.89±0.03,P<0.05,P<0.01),且乳腺纖維腺瘤組中的表達(dá)明顯高于乳腺呢增生癥組(P<0.01)。見(jiàn)圖2。

1：1 000 bp DNA Marker；2:乳腺增生癥組；3：乳腺纖維腺瘤組；4:乳腺癌組圖2 IGFBP-6 mRNA在乳腺組織中的表達(dá)

2.4 IGFBP-6 mRNA表達(dá)與乳腺癌臨床病理指標(biāo)間的關(guān)系 60例乳腺癌標(biāo)本中IGFBP-6 mRNA與患者的年齡(0≤49歲組0.92±0.05，>49歲組0.92±0.05)和乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管的不同組織學(xué)分級(jí)中的表達(dá)(Ⅰ組0.89±0.05，Ⅱ組0.93±0.02，Ⅲ組0.92±0.03)無(wú)明顯差異(P>0.05)；在腫瘤病灶較大(0.96±0.03)且有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(0.91±0.04)的乳腺癌中IGFBP-6 mRNA表達(dá)顯著高于腫瘤病灶較小(0.85±0.03)及無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(0.83±0.04)的乳腺癌患者(P<0.05)。

3 討 論

目前全球乳腺癌發(fā)病率的增長(zhǎng)速度正以3%的速度遞增，而發(fā)病患者正趨于青年化〔3，4〕。乳腺癌的發(fā)生發(fā)展與體內(nèi)性激素受體及致癌基因的異常表達(dá)有關(guān)。胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)作為生長(zhǎng)因子在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中的研究正越來(lái)越受到重視，IGF信號(hào)系統(tǒng)主要是在細(xì)胞的增殖、生長(zhǎng)、分化、遷移和凋亡等調(diào)節(jié)方面發(fā)揮極為重要的作用〔5～7〕。IGFBP-6主要存在于血清和腦脊液以及身體其他一些細(xì)胞中，其表達(dá)主要受IGF-Ⅱ及其他激素的調(diào)節(jié)和控制。據(jù)研究表明在人的骨母細(xì)胞系中，IGFBP-6在維A酸的作用下表達(dá)水平呈增加趨勢(shì)〔8〕。對(duì)于IGFBP-6的認(rèn)識(shí)在IGFs家族中研究較少，其與胰島素樣結(jié)合蛋白家族的每個(gè)成員相同，IGFBP-6也屬于一種分泌蛋白，主要是通過(guò)與IGF-Ⅱ在血液與組織中結(jié)合從而發(fā)揮作用。對(duì)于IGFBP-6的結(jié)構(gòu)分析可以了解到其C端是由一個(gè)高度堿基化的氨基酸序列構(gòu)成〔9〕。

本研究結(jié)果表明IFGBP-6可能有抑制乳腺癌生長(zhǎng)的作用；腫瘤細(xì)胞不斷增殖的能力是惡性腫瘤生長(zhǎng)發(fā)展，浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的基本要素和先決條件。由此可知，IGFBP-6在乳腺癌組織中發(fā)揮著負(fù)向調(diào)節(jié)及抗增殖作用，根據(jù)國(guó)內(nèi)外的研究表明IGFBP-6通過(guò)對(duì)IGF-Ⅱ的促腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)從而抑制不同惡性腫瘤的生長(zhǎng)〔10，11〕，其中已在結(jié)腸癌、橫紋肌肉瘤、神經(jīng)母細(xì)胞、肺癌、骨肉瘤、鼻咽癌等惡性腫瘤中得到證實(shí)，IGFBP-6的表達(dá)與腫瘤的惡性程度成負(fù)相關(guān)〔12～18〕。

較IGFBP-6蛋白的表達(dá)相比，IGFBP-6 mRNA的表達(dá)情況正好相反，其原因可能是由于在mRNA翻譯過(guò)程中其出現(xiàn)問(wèn)題而使其沒(méi)有表達(dá)出蛋白的結(jié)果，另外其可能與IGFBP-6的非IGF依賴(lài)作用有關(guān)。現(xiàn)有研究表明：不能結(jié)合IGF的突變體和IGFBP-6野生型均可以活化P38MAPK通路，從而誘導(dǎo)結(jié)腸癌及橫紋肌肉瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移〔19〕；IGFBP-6也可抑制造骨細(xì)胞的分化，通過(guò)與細(xì)胞內(nèi)4(LMP)-1的作用實(shí)現(xiàn)〔20〕。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)免疫組織化學(xué)法和RT-PCR方法檢測(cè)出IGFBP-6在乳腺癌中的表達(dá)結(jié)果不一致。其中從免疫組化結(jié)果看發(fā)現(xiàn)IGFBP-6蛋白在胞質(zhì)中表達(dá)，而IGFBP-6 mRNA在乳腺癌的表達(dá)情況較乳腺其他組織高，考慮IGFBP-6 mRNA在“中心法則”中的翻譯有錯(cuò)誤，其是否可成為預(yù)測(cè)乳腺癌轉(zhuǎn)移和預(yù)后一個(gè)潛在的腫瘤標(biāo)志物，有待進(jìn)一步研究。

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〔2015-03-21修回〕

(編輯 安冉冉/曹夢(mèng)園)

申興斌(1969-)，男，碩士，碩士生導(dǎo)師，主任醫(yī)師，主要從事腫瘤機(jī)制方面研究。

趙 楊(1983-)，女，主治醫(yī)師，碩士，主要從事腫瘤機(jī)制方面研究。

R3

A

1005-9202(2016)19-4812-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.19.064