欒海云

(濱州醫(yī)學院，山東 煙臺 264003)

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左卡尼汀對D-半乳糖聯(lián)合亞硝酸鈉致衰老小鼠學習記憶功能的影響

欒海云

(濱州醫(yī)學院，山東 煙臺 264003)

目的 觀察左卡尼汀對D-半乳糖聯(lián)合亞硝酸鈉致衰老小鼠學習記憶的影響。方法 50只小鼠隨機分成對照組、模型組和左卡尼汀低、中、高劑量組(0.25、0.5、1.0 g·kg-1·d-1)，共5組。采用D-半乳糖聯(lián)合亞硝酸鈉復制衰老模型，實驗6 w后檢測小鼠學習記憶功能，測定腦中皮層和海馬組織超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性及丙二醛(MDA) 含量。結(jié)果 模型組小鼠空間學習記憶功能下降，逃避潛伏期延長；腦組織SOD、GSH-Px活性降低，MDA 含量增高。左卡尼汀組能改善模型組小鼠的學習記憶能力，顯著提高腦組織SOD、GSH-Px活性，降低MDA 水平，且呈劑量依賴性。結(jié)論 左卡尼汀可以改善衰老小鼠的學習記憶障礙，其機制可能與其抗氧化作用有關(guān)。

左卡尼??；衰老；學習記憶；抗氧化作用

左卡尼汀(LC)是一種廣泛存在于機體組織中的氨基酸。它的主要功能是參與哺乳動物體內(nèi)的能量代謝，尤其是脂類的代謝〔1〕。課題組前期已經(jīng)成功建立了D-半乳糖引起的衰老小鼠的動物模型，考察了LC的抗氧化作用〔2〕。本研究通過建立D-半乳糖小鼠衰老模型，觀察LC對衰老小鼠的認知能力及腦內(nèi)抗氧化能力的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑 D-半乳糖(Sigma公司)，LC原料藥(東北制藥總廠提供)，谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)及丙二醛(MDA)試劑盒( 南京建成生物工程研究所)，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 實驗動物 分組與給藥昆明種小鼠50只，16周齡SPF級，雄性，體重(25±5)g，由山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司動物中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(魯)2005-0017。實驗前禁食12 h，自由飲水。隨機分為5組，每組10只，對照組，D-gal模型組，LC低、中、高劑量組。除對照組外，其他小鼠每日頸背部皮下注射D-gal 200 mg/kg聯(lián)合亞硝酸鈉45 mg/kg，每日1次，連續(xù)6 w，對照組頸背部皮下注射等體積生理鹽水。從第5周開始，LC組繼續(xù)注射D-gal的同時，分別注射0.25、0.5、1.0 g/kg LC，對照組與模型組注射等量的生理鹽水。

1.3 行為學檢測

1.3.1 定位航行實驗 實驗歷時5 d，每天分上午、下午兩段，每段2次，每次訓練小鼠分別從4個不同的標記點入水，將小鼠面向池壁放入水中。儀器將自動記錄小鼠尋找并爬上平臺的路線圖及尋找平臺所需時間(逃避潛伏期)。若小鼠入水后60 s內(nèi)未能找到或爬上平臺，則將其引到平臺上，這時潛伏期記為60 s，讓小鼠停留10 s，再放回籠中。每次訓練間隔60 s。

1.3.2 空間搜索實驗 在第5天訓練結(jié)束后撤去平臺，然后任選一個入水點將小鼠面向池壁放入水中，記錄小鼠在60 s內(nèi)第一次經(jīng)過原平臺的時間(潛伏期)，小鼠在60 s內(nèi)經(jīng)過平臺的次數(shù)以及在原平臺所在象限內(nèi)逗留的時間。

1.4 測定指標及方法 行為學實驗結(jié)束24 h后，眼球取血，隨后頸部脫臼處死，在冰袋上快速分離小鼠腦組織、胸腺和脾臟，并用冰冷生理鹽水清洗后濾紙吸干并稱重，計算小鼠的臟器指數(shù)：臟器指數(shù)= 臟器質(zhì)量(mg)/體重(g)。在冰袋上分離海馬和皮層，并用預冷的生理鹽水制成10%組織勻漿，4 000 r/min 4℃離心10 min，取上清液分裝于離心管中，-20℃冰箱凍存待分析。所有指標測定嚴格按照試劑盒說明進行。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS15.0統(tǒng)計學分析軟件行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 LC對衰老小鼠胸腺和脾臟指數(shù)的影響 與對照組比較，模型組的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)均有顯著性降低(P<0.05)；與模型組比較，LC低、中、高劑量組的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)均有顯著升高(P<0.05，P<0.01)，且呈劑量依賴性。見表1。

表1 各組小鼠臟器指數(shù)比較

與對照組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05，3)P<0.01

2.2 Morris 水迷宮試驗

2.2.1 定位航行實驗 各組小鼠在學習期間，逃避潛伏期呈縮短趨勢，表明小鼠在5 d的游泳訓練中，尋找平臺有一定的空間學習記憶能力，不過各組的學習記憶能力有所差別。模型組小鼠逃避潛伏期較其他組明顯延長，說明其出現(xiàn)明顯的空間學習記憶障礙；而LC各組小鼠逃避潛伏期介于對照組和模型組之間，說明LC能提高衰老模型小鼠的空間學習記憶能力，見表2。

2.2.2 空間探索試驗 與對照組小鼠比較，模型組小鼠在原平臺所在象限搜索時間縮短，穿越原平臺次數(shù)減少(P<0.05，P<0.01)，表明模型組小鼠的空間記憶能力受到嚴重損害；而LC治療組小鼠均能明顯增加小鼠在原平臺所在象限搜索時間，增加通過目標區(qū)域次數(shù)(P<0.05，P<0.01)，與模型組比較顯著(P<0.05，P<0.01)，表明LC各組小鼠的空間定位記憶能力較模型組有明顯改善，見表3。

表2 LC對衰老小鼠尋找平臺潛伏期能力的影響±s,s)

與對照組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與模型組比較：3)P<0.05，4)P<0.01，下表同

表3 LC對衰老小鼠空間探索能力的影響

2.3 LC對D-半乳糖小鼠皮層抗氧化能力的影響 模型組小鼠皮層中SOD、GSH-Px活性均明顯低于對照組降低(P<0.01或P<0.05)。LC各組小鼠皮層中SOD、GSH-Px活性相對于模型組明顯提高(P<0.01或P<0.05)。對照組、LC各組小鼠皮層中MDA含量，相對于模型組明顯降低(P<0.01或P<0.05)，并隨著LC劑量的增大MDA含量降低得更加明顯(P<0.01或P<0.05)，見表4。

2.4 LC對D-半乳糖致衰老小鼠海馬抗氧化能力的影響 模型組小鼠海馬中SOD、GSH-Px活性較對照組明顯降低，而LC各組小鼠海馬中SOD、GSH-Px活性相對于模型組明顯提高(P<0.01或P<0.05)。模型小鼠海馬中MDA 含量較對照組明顯升高，而LC各組MDA 含量較模型組明顯降低(P<0.01或P<0.05)，見表5。

表4 LC對衰老小鼠皮層SOD、GSH-Px活性及MDA含量的影響

表5 LC對衰老小鼠海馬SOD、GSH-Px活性及MDA 含量影響

3 討 論

機體衰老是個復雜的變化過程，現(xiàn)代科學認為自由基反應異常是衰老的主要原因。自由基是生物體新陳代謝過程中產(chǎn)生的一類具有氧化活性的帶負電的離子，其化學性質(zhì)相當活躍〔3〕。人們已經(jīng)意識到，自由基的產(chǎn)生和清除的動態(tài)平衡同人體的生理、病理、生長發(fā)育及疾病、衰老密切相關(guān)。D-半乳糖皮下注射后，其代謝產(chǎn)物半乳糖醇不能被進一步代謝而堆積在細胞內(nèi)，導致細胞腫脹，代謝紊亂，體內(nèi)活性氧水平升高，過量的氧自由基可引起神經(jīng)元細胞的損傷，造成動物學習記憶能力下降及機體衰老〔4〕。亞硝酸鈉進入體內(nèi)，使血紅蛋白氧化為高鐵血紅蛋白，從而失去攜氧能力，導致組織缺氧，引起大腦行為上障礙〔5〕。因此，本實驗采用D-半乳糖聯(lián)合亞硝酸鈉復制機體衰老相關(guān)疾病的模型。研究表明，胸腺、脾臟指數(shù)在一定程度上可間接反映衰老狀況〔6〕。本實驗結(jié)果表明LC有可能降低D-半乳糖引起的器官萎縮和退化，進而延緩腦衰老過程。LC能提高衰老模型小鼠的空間學習記憶能力。且本文提示LC能有效地劑量依賴性地清除衰老機體過多生成的自由基，減輕自由基的損傷效應，進而保護細胞免受氧化損傷，使機體各項生理功能得到明顯改善,起到延緩衰老的作用。

1 Strijbis K,Vaz FM,Distel B.Enzymology of the carnitine biosynthesis pathway〔J〕.IUBMB Life,2010;62(5):357-62.

2 欒海云，楊清寶，楊美子,等.左卡尼汀對衰老小鼠抗氧化作用的研究〔J〕.中國新藥雜志,2012;21(5):548-50.

3 陳 瑾.衰老的自由基機制〔J〕.中國老年學雜志,2004;24(7):677-9.

4 Cui X，Zuo PP，Zhang Q，etal.Chronic systemic D-galactose exposure induces memory loss，neurodegeneration，and oxidative damage in mice:protective effects of R-a-Lipoic acid〔J〕.J Neurosci Res，2006;84:647-54.

5 陳 莉,劉曉艷，黃日越,等.烏圓補血口服液對D-半乳糖和亞硝酸鈉所致癡呆模型小鼠生化指標的影響〔J〕.中國老年學雜志,2009;29(10):1206-8.

6 Foster PM,Auton TR.Application of benchmark dose risk assessment methodology to developmental toxicity:an industrial view〔J〕.Toxicol Lett,1995;82-3:555-9.

〔2015-05-01修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

欒海云(1979-)，女，副教授，碩士，主要從事抗衰老藥理研究。

R743

A

1005-9202(2016)19-4731-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.19.026