姚新亮 閆成蕓 張 韓 魯雪麗 萬(wàn)琪琳

(河南大學(xué)淮河醫(yī)院心內(nèi)科，河南 開(kāi)封 475000)

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他汀類(lèi)藥物對(duì)心肌缺血再灌注心肌細(xì)胞Bax和Bcl-2表達(dá)的調(diào)控

姚新亮 閆成蕓 張 韓 魯雪麗 萬(wàn)琪琳

(河南大學(xué)淮河醫(yī)院心內(nèi)科，河南 開(kāi)封 475000)

目的 探討他汀類(lèi)藥物對(duì)心肌缺血再灌注心肌細(xì)胞基因Bax和Bcl-2的調(diào)控作用。方法 選取30只清潔級(jí)SD大鼠為研究對(duì)象，將該組大鼠用計(jì)算機(jī)軟件編制的隨機(jī)分配表隨機(jī)分為三組，假手術(shù)組、缺血再灌注組、缺血性再灌注組+阿托伐他汀干預(yù)組，每組10只。假手術(shù)組每日給予2 ml的0.9%的氯化鈉溶液；治療組每日給予2 ml的0.9%的氯化鈉溶液；干預(yù)組為缺血性再灌注組+阿托伐他汀干預(yù)組每日給予阿托伐他汀。以上大鼠灌胃3d后制作心肌缺血再灌注模型，模型成功后處死。采用免疫組化測(cè)定Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)、TUNEL法測(cè)定心肌細(xì)胞凋亡、RT-PCR檢測(cè)Bcl-2和Bax mRNA的表達(dá)情況。結(jié)果 治療組和干預(yù)組大鼠的心肌細(xì)胞均呈現(xiàn)不同程度的心肌細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，AI明顯升高，均高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。但干預(yù)組大鼠的心肌凋亡指數(shù)AI低于治療組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。治療組和干預(yù)組的Bcl-2和Bax mRNA的表達(dá)以及相關(guān)蛋白的表達(dá)顯著高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。但干預(yù)組的Bcl-2 mRNA的表達(dá)以及相關(guān)蛋白的表達(dá)顯著高于治療組，Bax mRNA及相關(guān)蛋白的表達(dá)顯著低于治療組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 他汀類(lèi)藥物對(duì)心肌缺血再灌注的心肌細(xì)胞具有保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與上調(diào)Bcl-2的水平和下調(diào)Bax的水平有關(guān)。

他汀類(lèi)藥物；心肌缺血再灌注；心肌細(xì)胞；Bax；Bcl-2

心肌缺血再灌注損傷是冠狀動(dòng)脈搭橋術(shù)、冠狀動(dòng)脈溶栓術(shù)以及介入治療中常見(jiàn)的嚴(yán)重并發(fā)癥，對(duì)患者的預(yù)后有較大影響〔1〕。他汀類(lèi)藥物是臨床常用的降脂藥物，此外，還具有免疫調(diào)節(jié)和影響細(xì)胞凋亡的作用；而且阿托伐他汀在心血管保護(hù)方面也具有明顯效果〔2〕。但目前，他汀類(lèi)藥物抵抗心肌缺血再灌注損傷細(xì)胞凋亡的具體機(jī)制尚不完全清楚。本研究通過(guò)觀察他汀類(lèi)藥物對(duì)心肌缺血再灌注心肌細(xì)胞Bax和Bcl-2表達(dá)的調(diào)控作用，分析他汀類(lèi)藥物對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 健康雄性Sprague-Dauley(SD)大鼠，30只，清潔級(jí)，體重(250±20)g，由河南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物環(huán)境設(shè)施，晝夜明暗交替時(shí)間：12 h/12 h。飼料喂養(yǎng)，飲水為自來(lái)水瓶裝后高壓滅菌。動(dòng)物自由采食和飲水；每周換兩次經(jīng)高壓滅菌的松木刨花墊料。飼養(yǎng)室內(nèi)每周用0.5%新潔爾滅水溶液噴霧消毒1次。隨機(jī)分為假手術(shù)組、缺血再灌注組、缺血再灌注+阿托伐他汀干預(yù)組，每組10只。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 試劑 阿托伐他汀購(gòu)自輝瑞制藥有限公司，Bax、Bcl-2鼠抗人單克隆抗體和辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的羊抗小鼠IgG抗體購(gòu)自美國(guó)Santa公司。原位末端標(biāo)記(TUNEL)細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京寶賽生物技術(shù)有限公司；10%中性甲醛；鏈霉親和素-生物末復(fù)合物(SABC)免疫組化試劑盒均購(gòu)自武漢博士德生物公司；RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Fast EvaGreen?qPCR Master Mix購(gòu)自美國(guó)Roche公司；2×PCR Mix 購(gòu)自西安潤(rùn)德生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。Trizol、dNTPs (10 mmol/L)、隨機(jī)引物(25 pmol/μl)、逆轉(zhuǎn)錄酶、Taq 酶、雙氧水(ddH2O)購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2.2 相關(guān)儀器 浙江金華益迪醫(yī)療設(shè)備廠，輪轉(zhuǎn)式石蠟切片機(jī)；黃石市恒豐醫(yī)療器械有限公司，恒溫培養(yǎng)箱；麥克奧迪，BA400光學(xué)顯微鏡；成都泰盟科技有限公司，HX-300動(dòng)物人工呼吸機(jī)等。

1.3 模型的制備 假手術(shù)組每日給予2 ml 0.9%氯化鈉溶液；缺血再灌注組，每日給予2 ml 0.9%氯化鈉溶液；缺血再灌注+阿托伐他汀干預(yù)組每日給予阿托伐他汀(40 mg溶解于10 ml 0.9%NaCl溶液中，灌藥劑量為體重(mg/kg)×70 kg×0.018/200 g)，以上大鼠均灌喂3 d后制作大鼠心肌缺血再灌注模型。制備方法：將大鼠水合氯醛腹腔麻醉(10 ml/kg)，仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，接心電監(jiān)護(hù)儀監(jiān)測(cè)心電變化，用針形電極插入大鼠四肢皮下記錄Ⅱ?qū)?lián)心電圖。頸部正中切口，氣管插管，接人工呼吸機(jī)(頻率55次/min，潮氣量1.5 ml/100 g，自左側(cè)3～4肋間開(kāi)胸，暴露心臟，于冠狀動(dòng)脈左前降支起始0.2 cm處穿線(以0號(hào)線結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支)。待呼吸、血壓平穩(wěn)15 min后，在結(jié)扎線與血管之間穿一直徑2 mm、長(zhǎng)5 mm的硅膠管。30 min后剪斷絲線使血流再通，取出硅膠管。灌注120 min(假手術(shù)組僅穿線不結(jié)扎)，同步觀察肢體導(dǎo)聯(lián)心電圖、頸動(dòng)脈血壓。之后處死動(dòng)物，取出心臟。結(jié)扎成功標(biāo)志：結(jié)扎線遠(yuǎn)端左心室前壁心肌顏色發(fā)紺，同步心電圖Ⅱ?qū)?lián)表現(xiàn)為ST段抬高或R波高聳。制模成功標(biāo)志：松開(kāi)結(jié)扎線以恢復(fù)冠狀動(dòng)脈血量，左心室前壁由發(fā)紺逐漸紅潤(rùn)，抬高的ST段下降二分之一〔3〕。

1.4 相關(guān)檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.4.1 免疫組化測(cè)定Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá) 將剪下的缺血區(qū)心肌經(jīng)4%甲醛固定48 h后(pH7.4)，將組織修塊，采用石蠟包埋，標(biāo)本經(jīng)4 μm連續(xù)切片，室溫放置30 min后，切片常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度酒精水化，消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性。一部分用于TUNEL法檢測(cè)凋亡細(xì)胞；一部分用于免疫組化染色；一部分用于免疫組化檢測(cè)Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)情況。嚴(yán)格按照試劑盒的操作說(shuō)明進(jìn)行。用已知心臟組織陽(yáng)性切片作為陽(yáng)性對(duì)照，PBS代替一抗作陰性對(duì)照。免疫組化的結(jié)果判定：光學(xué)顯微鏡下觀察，隨機(jī)選擇10個(gè)具有代表意義的高倍視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù) 100 個(gè)細(xì)胞的陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)，判斷表達(dá)程度。Bax定位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，Bcl-2定位于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核。陽(yáng)性細(xì)胞染色呈棕黃色或棕褐色。免疫陽(yáng)性率=免疫細(xì)胞陽(yáng)性數(shù)/(免疫細(xì)胞陽(yáng)性數(shù)+免疫細(xì)胞陰性數(shù))×100%。

1.4.2 RT-PCR檢測(cè)Bcl-2和Bax mRNA 采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Real-Time PCR)檢測(cè)，按照RNA fast200說(shuō)明書(shū)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。首先采用Total RNA提取液提取總RNA，按照TAKARA試劑盒將總 RNA逆轉(zhuǎn)成cDNA并保存于-20℃冰箱，采用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度及純度，主要步驟有勻漿、分相、沉淀、清洗、溶解、RNA濃度測(cè)定，然后制備反應(yīng)液，按 Fermentas 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)、Real-Time PCR反應(yīng)(共35個(gè)循環(huán))，PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠(含0.5%溴乙啶)電泳分離，以β-actin作為內(nèi)參照，反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)Real-Time PCR的擴(kuò)增曲線和熔解曲線，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。用ABI7500 FAST型熒光定量PCR儀檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。PCR引物序列采用primer express2.0軟件嚴(yán)格按照相關(guān)原則設(shè)計(jì)。

1.4.3 心肌細(xì)胞凋亡的檢測(cè) 將制備好的組織切片采用TUNEL試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行標(biāo)記染色，光學(xué)顯微鏡下觀察。凋亡細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色，正常細(xì)胞質(zhì)呈藍(lán)色。高倍鏡下每張切片隨機(jī)選取10個(gè)視野，分別計(jì)算每個(gè)視野的凋亡細(xì)胞核細(xì)胞總數(shù)，凋亡指數(shù)(AI)=視野內(nèi)凋亡細(xì)胞個(gè)數(shù)/視野內(nèi)所有心肌細(xì)胞個(gè)數(shù)×100%，將以上10個(gè)視野的AI取平均值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS15.0軟件，計(jì)數(shù)資料多組間比較采用單因素方差分析，兩組比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 各組Bcl-2、Bax蛋白及mRNA表達(dá) 心肌缺血再灌注組和阿托伐他汀組的Bcl-2、Bax蛋白及mRNA表達(dá)顯著高于假手術(shù)組(P<0.05)。但阿托伐他汀組的Bcl-2 蛋白及mRNAGE DP 顯著高于缺血再灌注組，Bax蛋白及mNRA表達(dá)顯著低于缺血再灌注組(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 三組大鼠Bcl-2和Bax 蛋白表達(dá)比較

與假手術(shù)組相比:1)P<0.05；與缺血再灌注組相比:2)P<0.05；下表同

2.2 心肌細(xì)胞凋亡的檢測(cè)情況 缺血再灌注組和阿托伐他汀組大鼠的心肌細(xì)胞均呈現(xiàn)不同程度的心肌細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，AI明顯升高〔(34.87±2.39)%、(20.82±1.95)%〕，均高于假手術(shù)組〔(4.39±1.84)%〕(P<0.05)。但阿托伐他汀組大鼠的心肌AI低于缺血再灌注組(P<0.05)。高倍鏡下觀察心肌缺血再灌注后凋亡細(xì)胞數(shù)明顯增加(棕色)，缺血再灌注組顯現(xiàn)大量的凋亡細(xì)胞，阿托伐他汀組較缺血再灌組凋亡細(xì)胞數(shù)明顯下降，僅見(jiàn)少數(shù)散在的凋亡細(xì)胞。見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡情況

3 討 論

心肌缺血再灌注損傷是指缺血的心肌組織恢復(fù)血供時(shí)，導(dǎo)致再灌注區(qū)心肌細(xì)胞及局部血管網(wǎng)顯著的病理生理變化〔4〕。心肌缺血再灌注不僅能夠?qū)е录?xì)胞壞死，還能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。心肌細(xì)胞凋亡是引起心室重塑、心律失常以及心功能不全的重要原因。因此，減少心肌細(xì)胞凋亡有助于改善心肌缺血再灌注損傷的預(yù)后。近年來(lái)，有研究發(fā)現(xiàn)采用藥物預(yù)處理能夠有效抑制心肌缺血再灌注的心肌細(xì)胞凋亡，減少心肌梗死面積〔5〕。孟紅等〔6〕報(bào)道，短期的阿托伐他汀能夠清除缺血再灌注損傷大鼠的自由基，干預(yù)Fas蛋白表達(dá)，減少心肌細(xì)胞凋亡。孫曉靖等〔7〕研究顯示，阿托伐他汀能夠減輕急性損傷大鼠的心肌細(xì)胞凋亡，改善左室重塑，機(jī)制與促進(jìn)Bax/Bcl-2趨于平衡有關(guān)。

本研究提示阿托伐他汀有抑制心肌細(xì)胞凋亡的作用，與上述學(xué)者的研究結(jié)果基本一致。心肌缺血再灌注損傷受眾多因素的影響，其中一個(gè)重要的作用機(jī)制就是細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡受到細(xì)胞內(nèi)促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白的調(diào)控，當(dāng)兩種蛋白比例失衡時(shí)容易引發(fā)細(xì)胞凋亡〔8〕。Bcl-2蛋白發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡的作用，Bax表達(dá)水平增高時(shí)促進(jìn)細(xì)胞凋亡，細(xì)胞內(nèi)Bax/Bcl-2比值決定細(xì)胞是生存還是凋亡。本研究結(jié)果顯示，心肌缺血再灌注大鼠，Bax/Bcl-2比值上升，因此表現(xiàn)為細(xì)胞凋亡明顯增多。

通過(guò)藥物干預(yù)凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，調(diào)控細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)途徑，以減少細(xì)胞凋亡，可能會(huì)成為治療心血管疾病的重要途徑〔9〕。經(jīng)過(guò)阿托伐他汀干預(yù)后，對(duì)抗細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能與上調(diào)Bcl-2水平和下調(diào)Bax水平有關(guān)。高鳳敏等〔10〕研究顯示，阿托伐他汀預(yù)處理能夠抑制缺血再灌注大鼠的脂質(zhì)過(guò)氧化損傷，增強(qiáng)抗氧化酶的活性，減少心肌細(xì)胞凋亡，認(rèn)為這種心肌保護(hù)作用與抑制了半胱氨酸蛋白酶(Caspases)-3和Caspases-8蛋白的表達(dá)、提高NF-κB表達(dá)有關(guān)。由此可見(jiàn)，阿托伐他汀對(duì)抗心肌凋亡的機(jī)制是多方面的，在下一步的實(shí)驗(yàn)中筆者還將展開(kāi)更深入的研究。

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〔2015-12-19修回〕

(編輯 袁左鳴)

萬(wàn)琪琳(1962-)，女，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，主要從事冠心病、老年病學(xué)研究。

姚新亮(1983-)，男，碩士，主治醫(yī)師，主要從事冠心病研究。

R54

A

1005-9202(2016)19-4726-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.19.024