任吉祥 劉 爽 孫 洋 周慶偉

(長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，吉林 長(zhǎng)春 130021)

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新型腫瘤抑素對(duì)C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞抑制作用的影響

任吉祥 劉 爽1孫 洋1周慶偉2

(長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，吉林 長(zhǎng)春 130021)

目的 探討新型腫瘤抑素對(duì)C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖及Caspase-3蛋白表達(dá)的影響。方法 采用CCK-8檢測(cè)不同濃度的新的腫瘤抑素對(duì)C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖并用Western印跡檢測(cè)對(duì)Caspase-3蛋白的表達(dá)。結(jié)果 新的腫瘤抑素作用C6膠質(zhì)瘤24 h空白對(duì)照組與卡莫司汀組比較差異有顯著性(P<0.05)，與其他實(shí)驗(yàn)組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);48 h空白組與卡莫斯汀組、1 500、2 000 μg/ml組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；72 h時(shí)空白對(duì)照組與卡莫斯汀組、1 500、2 000 μg/ml組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。空白對(duì)照組與卡莫司汀組、1 500、2 000 μg/ml組比較Caspase-3蛋白表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。結(jié)論 新型腫瘤抑素可能通過(guò)調(diào)控Caspase-3蛋白表達(dá)抑制C6腫瘤細(xì)胞增殖。

新的腫瘤抑素；C6神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤

研究表明，膠質(zhì)瘤常浸潤(rùn)人腦重要功能區(qū)或附近區(qū)域，手術(shù)無(wú)法將腫瘤完全切除，術(shù)后易復(fù)發(fā)，放、化療雖可殺傷腫瘤細(xì)胞，但同時(shí)亦會(huì)損傷部分正常腦組織，會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的全身不良反應(yīng)，臨床治療效果不佳〔1〕。生物活性肽是一類活性較高的化合物，因其結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、分子量小，易透過(guò)血管屏障等特點(diǎn)，甚至能夠通過(guò)細(xì)胞滲透直接進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，克服了目前很多藥物不能直接進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)等問(wèn)題〔2，3〕。本文探討新的腫瘤抑素對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 材料 C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞(購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所),卡莫司汀(中國(guó)天津金耀藥業(yè)有限公司，批號(hào)：1407011)。DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清、TRIS-base、Bis Acrylamide、Acrylamide、Glycine、Bradford蛋白質(zhì)定量試劑盒、兔抗-caspase-3、HRP 羊抗兔IgG、抗β-actin(武漢博士德生物工程有限公司)；CCK-8溶液(碧云天生物技術(shù)研究所)。倒置光學(xué)顯微鏡 NiKon ECLIPSE 80i(日本尼康公司)；二氧化碳培養(yǎng)箱(日本三樣電機(jī)株式會(huì)社制造，產(chǎn)品型號(hào)：NCO-15AC)；AN YANG 超凈臺(tái)(蘇州安洋科技發(fā)展有限公司，型號(hào)：BSC-BOOⅡB2)；酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(中國(guó)北京普朗新有限公司，DNM-9602)。

1.2 方法

1.2.1 CCK-8檢測(cè)不同濃度的新型腫瘤抑素對(duì)C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤增殖的影響 取對(duì)數(shù)期細(xì)胞，胰酶消化后制成細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)調(diào)整至1×104/ml；接種至96孔板；實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分為空白對(duì)照組、卡莫司汀組(0.391 mg/ml)、新型腫瘤抑素(1 000、1 500、2 000 μg/ml)組,每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，細(xì)胞貼壁后，除空白對(duì)照組外，每組加入不同的藥物，37℃、5%CO2孵育；分別在加藥24、48、72 h時(shí)每孔加入CCK-8溶液20 μl，放置孵箱孵育1 h后，采用酶標(biāo)儀檢測(cè)OD值。

1.2.2 Western印跡檢測(cè)不同濃度的新的腫瘤抑素對(duì)Caspase-3蛋白表達(dá)的影響 取對(duì)數(shù)期細(xì)胞，胰酶消化后制成細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)調(diào)整為3×105/ml，細(xì)胞接種至6孔板，隨機(jī)分為空白對(duì)照組、卡莫司汀組(0.391 mg/ml)、新型腫瘤抑素(1 000、1 500、2 000 μg/ml)組,每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，細(xì)胞貼壁后，除空白對(duì)照組外，每組加入不同濃度的藥物，置37℃，5%CO2孵育，孵育48 h取出6孔板，提取蛋白；電泳后，在恒定電流200 mA條件下轉(zhuǎn)膜90 min；轉(zhuǎn)膜結(jié)束后用5%脫脂奶粉常溫?fù)u床封閉1 h；棄去封閉液，加入一抗(1∶300稀釋)；置于4℃孵育過(guò)夜；TBST洗膜15 min，共3次；加入二抗(1∶3 000稀釋)，常溫?fù)u床搖1 h；TBST洗膜15 min，共3次；加入顯影液；用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析檢測(cè)目的蛋白Caspase-3表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS18.0軟件行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 CCK-8檢測(cè)不同濃度的新型腫瘤抑素對(duì)C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤增殖的影響 24 h時(shí)只有空白對(duì)照組與卡莫司汀組比較有顯著差異(P<0.05)，與其他組比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，其余組間比較也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)：48 h時(shí)空白對(duì)照組與卡莫斯汀組、1 500、2 000 μg/ml組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；72 h時(shí)空白對(duì)照組與卡莫斯汀組、1 500、2 000 μg/ml組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖1,表1。

圖1 各時(shí)間C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤增殖鏡下改變(×10)

表1 CCK-8檢測(cè)不同濃度的新型腫瘤抑素對(duì)C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤增殖的影響

與空白對(duì)照組比較：1)P<0.05；與卡莫司汀組比較：2)P<0.05

2.2 Western印跡檢測(cè)不同濃度的新型腫瘤抑素對(duì)Caspase-3蛋白表達(dá)的影響 卡莫斯汀組(1.53±0.01)、1 500 μg/ml(0.96±0.00)、2 000 μg/ml新型腫瘤抑素組(0.50±0.01)Caspase-3蛋白表達(dá)均有所下調(diào)，與空白對(duì)照組(2.09±0.01)比較有顯著差異(P<0.05)。1 000 μg/ml新型腫瘤抑素組Caspase-3表達(dá)量為1.33±0.01。

3 討 論

腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞在很多生物學(xué)特性上都很相似,當(dāng)藥物作用于腫瘤細(xì)胞時(shí),通常正常細(xì)胞也會(huì)受到很大的影響。選擇性抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)或誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞進(jìn)入凋亡途徑是目前癌癥研究的熱點(diǎn)和主流。腫瘤細(xì)胞是一類代謝率高且生長(zhǎng)迅速的細(xì)胞，在腫瘤細(xì)胞中,很多與細(xì)胞增殖和遷移相關(guān)的通路都被過(guò)度激活,這提示在腫瘤細(xì)胞中存在大量可供選擇的位點(diǎn)〔4〕。本研究表明作用48 h新形腫瘤抑素對(duì)C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)有抑制作用并成一定的劑量依賴性。Caspase-3 是介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的一類蛋白水解酶是哺乳動(dòng)物細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵蛋白酶，參與細(xì)胞凋亡的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，在膠質(zhì)瘤的惡性進(jìn)展中也發(fā)揮重要作用〔5〕。Caspase-3需在活化狀態(tài)下能參與細(xì)胞凋亡〔6〕。Caspase-3蛋白酶激活機(jī)制非常復(fù)雜,受多種因素調(diào)控,存在不同的活化途徑。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，卡莫斯汀組、新型腫瘤抑素1 500、2 000 μg/ml組均能顯著下調(diào)Caspase-3蛋白表達(dá)，說(shuō)明小分子肽可能通過(guò)抑制Caspase-3蛋白表達(dá)從而抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。

1 張婧婧.Angiopep-2介導(dǎo)的雙靶向納米載體的研究及其在大鼠C6膠質(zhì)瘤MR顯像中的價(jià)值〔D〕.合肥：安徽醫(yī)科大學(xué),2015.

2 何平均，倪淑欣，王文權(quán)，等.抗腫瘤寡肽類藥物研究進(jìn)展〔J〕.中國(guó)醫(yī)藥生物技術(shù)，2009;4(4):288-90.

3 邱曉燕.抗菌肽的免疫功能和應(yīng)用前景〔J〕.生物學(xué)通報(bào)，2002;37(1):24-5.

4 瞿家桂.神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞致瘤性相關(guān)基因、抗腫瘤藥物以及健康人群認(rèn)知功能的研究〔D〕.合肥：中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué),2014.

5 蔡風(fēng)景,徐朝陽(yáng),陳峻嚴(yán),等.雷公藤甲素對(duì)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡及TNF-α、NF-κb和Caspase-3表達(dá)的影響〔J〕.中藥藥理與臨床,2013(6):14-7.

6 呂 軍,楊連粵.Caspase-3與肝癌細(xì)胞凋亡〔J〕.華夏醫(yī)學(xué),2004;17(5):839-41.

〔2016-05-13修回〕

(編輯 郭 菁)

1 吉林大學(xué)藥學(xué)院 2 吉林大學(xué)再生醫(yī)學(xué)研究所

周慶偉(1959-)，男，教授，主要從事藥理學(xué)研究。

任吉祥(1977-)，男，副教授，主要從事中醫(yī)內(nèi)科腦病臨床研究。

R73

A

1005-9202(2016)19-4705-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.19.014