馬長春 徐 平 魏 媛 虎 力 溫佩彤 張 潮

(上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海 201203)

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預(yù)防性電針對不同月齡大鼠骨骼肌形態(tài)和腓腸肌中AKT、mTOR、p70S6K蛋白表達的影響

馬長春1徐 平 魏 媛2虎 力 溫佩彤 張 潮

(上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海 201203)

目的 探討預(yù)防性電針對不同月齡大鼠骨骼肌形態(tài)和IGF/AKT通路下與蛋白合成相關(guān)蛋白表達的影響。方法 雄性SD大鼠30只，隨機分為正常對照組、電針組，各組又分為8月正常組(8 MN)，14月齡正常組(14 MC)、16月齡正常組(16 MC)、14月齡電針6個月組(14 MEA6)、16月齡電針6個月組(16MEA6)和16月齡電針8個月組(16MEA8)。麻醉后快速取腓腸肌HE染色并測量骨骼肌橫截面積，Western印跡測定大鼠腓腸肌中AKT、mTOR、p70S6K和p-p70S6K相關(guān)蛋白表達。結(jié)果 14MEA6、16MEA6組SD大鼠腓腸肌的肌肉濕重/體重比值顯著升高；電針預(yù)防性干預(yù)的14MEA6、16MEA6組細胞核中心化、肌纖維小角化變少，骨骼肌橫截面積顯著升高；預(yù)防性電針首先通過AKT或磷酸化AKT表達上調(diào)，活化了p70S6K促進骨骼肌蛋白合成翻譯。結(jié)論 預(yù)防性電針干預(yù)增齡性大鼠骨骼肌萎縮的較佳月齡為8月齡，較佳干預(yù)周期為6個月。預(yù)防性電針干預(yù)減緩增齡性大鼠骨骼肌萎縮與IGF-1/AKT通路有關(guān)，并促進了骨骼肌蛋白合成。

預(yù)防性電針；骨骼肌萎縮；低頻電針

電針療法是治療骨骼肌萎縮的有效手段。已有相關(guān)報道，針刺對糖尿病大鼠、Cardiotoxin肌肉損傷大鼠和低頻電針對慢性腎病CKD所致小鼠骨骼肌萎縮的比目魚肌、腓腸肌和趾長伸肌的肌肉重量較對照組有明顯增加〔1，2〕。本文測定大鼠腓腸肌中與骨骼肌蛋白合成相關(guān)蛋白的表達，研究其作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物、主要試劑及儀器設(shè)備 健康6月齡雄性SD大鼠，36只，體質(zhì)量(420±20)g，清潔級，由上海西普爾-必凱實驗動物有限公司提供，動物許可證號：SCXK(滬)2013-0016。老年大鼠固定裝置(上海中醫(yī)藥大學(xué)自制)，針灸針(0.25 mm×25 mm，無錫佳健醫(yī)療器械公司)。GAPDH(美國Abcam公司)，AKT、P70S6K/p-p70S6(均購于美國賽信通公司)，mTOR(Abcam公司)。天平(BT-214)，美國Denver公司；石蠟切片機(RM2235)，美國Leicacm公司；OLYMPUS光學(xué)顯微鏡(CX21)，賴氏科技(上海)有限公司。離心機(MICRO 17TR)，韓國Hanil公司；搖床(TS-92)(其林貝爾)；電泳儀(MV-3)和轉(zhuǎn)膜儀(ST-2)(J-MAX)；PCR儀(2720型)(美國ABI公司)；電泳槽(Mupid 2plus)(日本TAKARA公司)；凝膠成像系統(tǒng)(EUV-LDUV)(韓國KoreaBiotech公司)。

1.2 動物分組和造模 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后，隨機分為正常對照組3個組(分別從6月齡飼養(yǎng)至8、14、16月齡)：8月正常組(8MN組)、14月齡正常組(14MC組)、16月齡正常組(16MC組)；電針組分為3個組(分別從8月齡電針干預(yù)至14、16月齡，從10月齡電針6個月)：14月齡電針6個月組(14MEA6組)、16月齡電針6個月組(16MEA6組)和16月齡電針8個月組(16MEA8組)。各組大鼠均自由飲水和飲食，室溫(25±1)℃，光照明暗各12 h。

1.3 動物干預(yù)方法 采用自制老年大鼠固定裝置固定，參照《實驗針灸學(xué)》對足三里和腎俞定位。用0.25 mm×25 mm毫針針刺雙側(cè)足三里和腎俞穴，接華佗牌G6805-Ⅱ型號電針儀，采用疏密波，頻率2 Hz，強度以大鼠四肢輕微抖動為度，通電時間為15 min，隔日電針1次，每周3次，3 w后休息1 w為1個療程。正常對照組不進行電針，但與電針組一樣固定。

1.4 標本采集 末次電針48 h后，用2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉SD大鼠，迅速完整剝離SD大鼠腓腸肌、比目魚肌的肌組織，用電子天平分別稱重，根據(jù)總體重、腓腸肌和比目魚肌濕重計算相對重量比值。將腓腸肌標本約1 cm×1 cm×1 cm固定于4%多聚甲醛溶液，準備包埋、石蠟切片，用于形態(tài)學(xué)觀察。

1.5 組織病理學(xué)檢測 每組取6只大鼠腓腸肌HE染色切片供圖像分析，每張切片隨機取5個視野，觀察是否出現(xiàn)肌纖維圓形化、細胞核中心化和肌纖維小角化。每個切面在400倍視野下隨機拍攝5個視野，每個視野隨機選取5個相鄰的肌纖維，檢測橫截面積，取平均值。

1.6 Western印跡測定大鼠腓腸肌中AKT、mTOR、p70S6K和p-p70S6K相關(guān)蛋白表達 取腓腸肌組織50 mg，粉碎后高速離心，按照BCA蛋白定量試劑盒說明測定蛋白濃度。用分光光度計測定蛋白濃度，加入6倍藍色電泳上樣緩沖液60 μl，將蛋白在沸水中煮5 min后，取20 μl上樣至SDS-PAGE膠加樣孔。用PVDF膜，電壓100 V，置于冰浴中轉(zhuǎn)膜2 h。將5 g脫脂奶粉加入到100 ml TBS緩沖液配制5%封閉液，將膜置于封閉液中搖擺30 min后，用封閉液將膜立即放入稀釋好的AKT、mTOR、p70S6K和p-p70S6K一抗，并置于搖床上均勻搖擺，4℃過夜，用TBS-T洗3次，每次5 min。用封閉液將膜立即放入稀釋好的二抗(1∶1 500的比例)中，放置在搖床上室溫內(nèi)均勻搖擺2 h，用TBS-T洗3次，每次5 min。將膜置于紅外熒光掃描成像系統(tǒng)上掃描。GAPDH為內(nèi)參。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS19.0軟件，多組計量資料使用單因素方差分析法(one-way ANOVA)。

2 結(jié) 果

2.1 預(yù)防性電針干預(yù)后不同月齡骨骼肌濕重比變化 14MC、16MC組SD大鼠比目魚肌的肌肉濕重/體重比值均明顯下降(P<0.01)，其中16MC組下降最明顯，其次是14MC組；14MEA6組SD大鼠比目魚肌的肌肉濕重/體重比值明顯升高(P<0.05)；14MC組和16MEA6組SD大鼠腓腸肌的肌肉濕重/體重比值均顯著下降(P<0.01)，其中14MC組下降最為明顯；14MEA6組SD大鼠腓腸肌的肌肉濕重/體重比值顯著升高(P<0.01)；16MEA6組SD大鼠腓腸肌的肌肉濕重/體重比值明顯升高(P<0.05)，見表1。

2.2 不同月齡大鼠腓腸肌微觀形態(tài)影響 見圖1。8MN組大鼠腓腸肌纖維排列整齊、緊密；14MC和16MC組大鼠腓腸肌表現(xiàn)為肌纖維萎縮的表型，如肌排列松散、大小差異較大，肌纖維圓形化、細胞核中心化和肌纖維小角化現(xiàn)象多見；14ME6組、16MEA6組和16MEA8組與相應(yīng)月齡對照組相比，肌纖維萎縮或退行性改變較輕。

與8MN組〔(61 126.88±4 688.30)μm2〕相比，14MC組〔(39 676.04±9 116.34)μm2〕和16MC組〔(33 530.06±6 855.22)μm2〕腓腸肌纖維平均橫截面積顯著下降(P<0.01)；與14MC組相比，14MEA6組腓腸肌纖維平均橫截面積〔(54 033.98±5 399.76)μm2〕顯著升高(P<0.01)；與16MC組相比，16MEA6組〔(45 925.96±6 670.04)μm2〕、16MEA8組〔(48 420.31±6 293.39)μm2〕腓腸肌纖維平均橫截面積顯著升高(P<0.01)。

2.3 干預(yù)性電針對AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR、p70S6K和p-p70S6K蛋白表達的影響 與14MC組相比，14MEA6組p-mTOR和p70S6K表達均顯著上升(P<0.01)，p-AKT和p-p70S6K表達明顯上升(P<0.05)；與16MC組相比，16MEA6組AKT值顯著上升(P<0.01)，p-p70S6K值明顯上升(P<0.05)；16MEA8組AKT、 p70S6K和p-p70S6K值明顯上升,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)； mTOR值上升顯著,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見圖2，圖3。

表1 各組SD大鼠總體重、比目魚肌和腓腸肌濕重/體重比值比較±s)

與16MC組比較：1)P<0.05；與14MC組比較：2)P<0.05,3)P<0.01；與8MN組比較：4)P<0.01

圖1 不同月齡大鼠腓腸肌微觀形態(tài)(HE染色，×400)

與14MC組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與8MN組比較：3)P<0.05圖2 預(yù)防性電針干預(yù)后14月齡大鼠骨骼肌信號蛋白p-AKT、p-mTOR、p70S6K和p-p70S6K表達變化

與16MC組比較：1)P<0.05，2)P<0.01圖3 預(yù)防性電針后16月齡大鼠骨骼肌信號蛋白AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR、p70S6K和p-p70S6K表達變化

3 討 論

生物體衰老的進程中，自然衰老的各組織和器官時間起點并不完全一致，肌肉可以算做衰老發(fā)生的最早器官。國內(nèi)已有研究報道，15月齡SD大鼠已出現(xiàn)明顯衰老跡象〔11〕。 這與本研究的腓腸肌形態(tài)結(jié)果相符，本文中14月齡和16月齡已經(jīng)有不同程度的衰老萎縮跡象。有研究指出〔2〕，阻抗訓(xùn)練能夠增加CKD骨骼肌萎縮小鼠肌肉重量。本研究中，預(yù)防性電針干預(yù)后比目魚肌和腓腸肌的濕重/體重比值均有不同程度的升高，提示14ME6組、16MEA6組和16MEA8組肌纖維萎縮或退行性改變較輕，另外，電針組大鼠骨骼肌橫截面積顯著升高，提示8月齡SD大鼠預(yù)防性電針6、8個月可有效地緩解大鼠骨骼肌衰老。肌萎縮在很多情況下都有一個共同的機制〔3〕，與蛋白質(zhì)合成有關(guān)的IGF-1受體/AKT/mTOR/p70S6K通路是影響肌肉萎縮的重要通路之一。IGF-1激活在調(diào)節(jié)骨骼肌的生長方面起著關(guān)鍵作用，其水平隨著年齡的增長而下降。當(dāng)肌肉受損后修復(fù)時，肌肉能分泌IGF-1，使肌細胞增殖和分化，促進肌肉的再生〔4〕。Akt是IGF-1通路的下游效應(yīng)因子，能夠加強骨骼肌蛋白合成并抑制骨骼肌蛋白降解，最終達到增加骨骼肌蛋白質(zhì)量的目的〔5〕。有研究表明〔6，7〕，IGF-1的下游PI3K/Akt/mTOR信號通路對骨骼肌蛋白生成有重要影響。mTOR信號是肌肉穩(wěn)態(tài)平衡、肌肉再生和肥大等各個階段的關(guān)鍵因子〔8〕。mTOR能夠激活并直接影響肌細胞蛋白的合成，可通過磷酸化下游靶物包括核搪體S6蛋白激酶(p70S6K)和真核翻譯起始因子eIF4E結(jié)合蛋白促使蛋白合成增加和翻譯起始〔9〕。研究表明，通過抑制mTOR的活性或減少AKT/mTOR信號通路的內(nèi)源性因子〔10〕，都能有效抑制蛋白合成。換言之，激活mTOR或增加AKT/mTOR信號通路的內(nèi)源性因子，就能夠增加蛋白合成。與這一結(jié)果一致，本研究提示從8月齡預(yù)防性電針6個月能夠促進骨骼肌蛋白的合成，從10月齡預(yù)防性電針干預(yù)6個月能夠激活A(yù)KT/mTOR信號通路，可能使p70S6K進一步磷酸化，最終對骨骼肌蛋白合成起到促進作用；另外，從8月齡開始預(yù)防性電針干預(yù)10個月也同樣可以激活A(yù)KT/mTOR信號通路，使p70S6K進一步磷酸化，對骨骼肌蛋白合成起到促進作用。

1 季傳婷，徐 平，陳新旺.針刺對糖尿病大鼠骨骼肌磷酸化蛋白激酶B、天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-3蛋白表達的影響〔J〕.針刺研究，2012；37(2)：104-7.

2 季傳婷，徐 平，謝 龍.針刺對Cardiotoxin 肌肉損傷大鼠MyoD表達的影響〔J〕.南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報 2012；15(2)：136-8.

3 Jonathan P，Gumucio C，Mendias L.Atrogin-1，MuRF-1，and sarcopenia〔J〕.Endocrine，2013；43(1)：12-21.

4 Zanou N，Gailly P.Skeletal muscle hypertrophy and regeneration：interplay between the myogenic regulatory factors(MRFs) and insulin-like growth factors(IGFs) pathways〔J〕.Cell Mol Life Sci，2013；70(21)：4117-30.

5 Lai KM，Gonzalez M，Poueymirou WT，etal.Conditional activation of akt in adult skeletal muscle induces rapid hypertrophy〔J〕.Mol Cell Biol，2004；24(21)：9295-304.

6 Laplante MP，Sabatini DM.mTOR signaling in growth and disease〔J〕.Cell，2012；149(2)：274-93.

7 曾凡星，朱 晗，趙 華，等.外源性IGF-1對大鼠運動骨骼肌mTOR及下有信號的影響〔J〕.北京體育大學(xué)學(xué)報，2011；34(4)：471-84.

8 Drummond MJ，Rasmussen BB.Leucine-enriched nutrients and the regulation of mammalian target of rapamycin signalling and human skeletal muscle protein synthesis〔J〕.Curr Opin Clin Nutr Metab Care，2008；11：222-6.

9 Li W，Tan D，Zhang Z，etal.Activation of Akt-mTOR-p70S6K pathway in angiogenesis in hepatocellular carcinoma〔J〕.Oncol Rep，2008；20(4)：713-9.

10 Sandri M.Signaling in muscle atrophy and hypertrophy〔J〕.Physiology，2008；23(1)：160-70.

〔2015-11-12修回〕

(編輯 李相軍)

The effect of preventive electroacupuncture on the morphology of musculoskeletal system of different month'age rats and the expressions of gap-associated protein under the pathway IGF/AKT

MA Chang-Chun, XU Ping, WEI Yuan,et al.

Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China

Objective To observe the effect of preventive electroacupuncture on the morphology of musculoskeletal system of different month'age rats and protein synthesis expression of gap-associated protein under the pathway IGF/AKT.Methods 30 SD rats were randomly divided into control and electroacupuncture groups, with 15 rats in each group. The control group was divided into 3 subgroup according to the month'age, namely 8/14/16 month; the electroacupuncture group was divided into 3 subgroup, 14/16/16 month'age. And the intervention was accordingly determined as 6/6/8 months. After anesthetization, the rats were proceeded with HE staining on musculus gastrocnemius to test the cross sectional area. Western blot was used to test the expressions of AKT, mTOR, p70S6K and p-p70S6K.Results The muscle wet weight/body weight ratio was significantly increased in 14MEA6, 16MEA6 rats. The centralization of cell nuclei and the keratinization of muscle fiber were decreased while the cross sectional area was increased in the preventive electroacupuncture groups. The preventive electroacupuncture was first raised by AKT or phosphorylated AKT expression and the activated p70S6K promoted the skeletal muscle protein synthesis.Conclusions The appropriate month'age of amyotrophy rat for preventive electroacupuncture is 8 months and the intervention duration is 6 months. The effect of preventive electroacupuncture for the aging amyotrophy rat is associated with the pathway IGF/AKT and the preventive electroacupuncture is effective for promoting protein synthesis of rat muscle protein.

Preventive electroacupuncture; Amyotrophy; Low frequency electroacupuncture

國家自然科學(xué)基金面上項目(81373755)；國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項目(81403470)

1 長春中醫(yī)藥大學(xué) 2 東營市勝利油田中心醫(yī)院

徐 平(1952-)，女，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事針灸與骨骼肌代謝性疾病、中醫(yī)教育研究。

馬長春(1973-)，男，副教授，博士，主要從事針灸與骨骼肌代謝性疾病研究。

R2

A

1005-9202(2016)19-4683-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.19.005