林旭紅， 王丹丹， 王慧超， 李玉霞 ， 楊瑞林

(河南大學 1淮河醫(yī)院檢驗科，轉化醫(yī)學中心， 2醫(yī)學院，淮河醫(yī)院心內科， 3第一附屬醫(yī)院腎內科，河南 開封 475000)

?

CXCR4在潰瘍性結腸炎小鼠蛋白C系統(tǒng)變化中的作用*

林旭紅1▲， 王丹丹2▲， 王慧超3△， 李玉霞1， 楊瑞林1

(河南大學1淮河醫(yī)院檢驗科，轉化醫(yī)學中心，2醫(yī)學院，淮河醫(yī)院心內科，3第一附屬醫(yī)院腎內科，河南 開封 475000)

目的： 蛋白C系統(tǒng)(PCS)是血管內皮功能重要的介導者，而微血管內皮細胞是參與潰瘍性結腸炎(UC)最重要的非免疫細胞，本研究旨在探討趨化因子受體CXCR4在UC病理過程中PCS變化的作用。方法: 動物實驗分為對照組和UC模型組，進行大體積分、組織病理學積分及潰瘍指數評估；測定各組結腸組織和血漿中髓過氧化物酶(MPO)、環(huán)氧合酶-2(COX-2)、基質細胞衍生因子-1α(SDF-1α)和單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)的mRNA水平及活性；檢測各組結腸CXCR4、β-arrestin、p-JNK、內皮細胞蛋白C受體(EPCR)和血栓調節(jié)蛋白(TM)的水平及分布；觀察蛋白C(PC)和蛋白S(PS)的活性。分離、培養(yǎng)、鑒定結腸微血管內皮細胞，分為對照組、SDF-1α組、CXCR4沉默組和CXCR4過表達組，觀察各組細胞EPCR、TM、β-arrestin和p-JNK的蛋白水平，以及PC、PS和激活的蛋白 C (APC)活性。結果: 與對照組比，模型組小鼠大體積分、組織病理學積分及潰瘍指數升高(P<0.05)。結腸組織和血漿MPO、COX-2、SDF-1α和MCP-1 mRNA水平和活性顯著升高(P<0.01)。結腸組織CXCR4、β-arrestin和p-JNK的蛋白水平上調，EPCR表達下調，血漿PC和PS活性明顯降低(P<0.05或P<0.01)。CXCR4過表達進一步加重SDF-1α對結腸黏膜微血管內皮細胞PCS的抑制，同時進一步升高β-arrestin和p-JNK的蛋白水平(P<0.05)。結論: UC時PCS被抑制，CXCR4參與其中，其可能的機制是 CXCR4在UC病理過程中介導趨化因子通過β-arrestin-JNK信號通路進一步影響血管內皮細胞功能，從而抑制PCS。

CXCR4； 潰瘍性結腸炎； 蛋白C系統(tǒng)； 血栓形成

目前潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis，UC)的病因及發(fā)病機制尚未闡明，研究表明，UC患者演變中常處于明顯的高凝狀態(tài)，主要表現為微血栓形成及微循環(huán)障礙[1-2]，導致病情惡化。因此有學者認為，UC導致的病理異常不僅局限于經典免疫細胞，也涉及一些非免疫細胞，如微血管內皮細胞[3]。

內皮細胞損傷在UC患者的凝血系統(tǒng)激活中有重要作用，而蛋白C系統(tǒng)(protein C system，PCS)是血管內皮功能重要的介導者，直接影響凝血-抗凝機制的動態(tài)平衡[4]。故深入探討UC病理的PCS變化及其機制，尋找新的藥物治療靶點具有重大理論與臨床意義。本課題組前期研究顯示，UC發(fā)病時PCS被抑制，其可能的機制是巨噬細胞通過分泌促炎細胞因子/趨化因子進一步影響血管內皮細胞功能，從而抑制PCS，但是這種升高的趨化因子是通過何種途徑影響PCS目前還不清楚。

趨化因子受體是一類G蛋白偶聯受體(G protein-coupled receptor，GPCR)，在指示炎細胞遷入各種損傷或受感染的器官過程中起重要作用。在UC活動期，其它趨化因子受體呈現明顯增高的趨勢，而CXCR4在UC中的作用尚無統(tǒng)一認識。Michihide等[5]認為黏膜的CXCR4+IgG漿細胞通過FcγR介導的CD14巨噬細胞激活導致人類UC。UC患者的CXCR4表達明顯高于對照組[6]。動物實驗也表明CXCR4拮抗劑AMD3100減輕實驗性結腸炎小鼠的結腸損傷[7]，阻斷CXCR12/CXCR4可減輕嚙齒動物的實驗性結腸炎[8]。而最近的一項研究指出[9]，CXCR4過表達導致TNBS結腸炎大鼠骨髓間充質干細胞動員、植入炎癥結腸，作為免疫系統(tǒng)抗炎和免疫調節(jié)的成分。因此CXCR4在UC病理過程中是否介導趨化因子導致的PCS改變還有待進一步研究。本研究應用4%硫酸葡聚糖鈉(dextran sulfate sodium，DSS)誘導的UC模型及分離的結腸微血管內皮細胞，進一步觀察CXCR4介導的PCS改變，探討UC病理機制的可能信號通路。

材 料 和 方 法

1 動物及分組

6～8周(20～25 g)C57 BL/6J小鼠20只(雌雄各半)，購自河南大學實驗動物中心，標準條件下[溫度(23±2 )℃，濕度60%]適應性飼養(yǎng) 1 周，自由飲水飲食。動物隨機分為對照組和UC 組，實驗前禁食不禁水12 h。小鼠所有操作程序獲得河南大學醫(yī)學倫理委員會批準。

2 實驗方法

2.1 模型的制備 以飲用水配制4% DSS，連續(xù)飲用 7 d，對照組連續(xù)飲用飲用水7 d，每天同一時間觀察記錄一般情況、體重和大便，并采用疾病活動指數(disease activity index，DAI)，即公認的“實驗性結腸炎”嚴重程度的重要指標[10]進行大體積分。具體積分標準參照Murano 等[11]的方法(表1)，以上三者積分總和除以3，得到一個總的臨床積分，即為每只小鼠的DAI，數值介于0 (健康)～4(DSS誘導的結腸炎的最大積分)之間。

表1 DAI評分標準

2.2 組織病理學評估及潰瘍指數評估 造模結束后處死各組動物，取 1 cm 的近端結腸進行常規(guī)蘇木素-伊紅(HE)染色，顯微鏡觀察其組織學變化。每個組織標本選 5 張切片，每個切片隨機選擇4 個視野，根據 Siegmund 等[12]的方法進行組織學積分(表2)。2個亞積分相加，總積分介于0(無改變)～6(具有廣泛細胞浸潤和組織損傷的最高積分)之間。潰瘍指數評估參照Nirmal 等[13]的方法，即潰瘍區(qū)域通過將肉眼觀察病灶大小進行總和評估，損傷的總區(qū)域表示為占結腸總表面積的百分比。

表2 組織學評分標準

2.3 Real-time PCR法檢測結腸組織髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)、環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)、基質細胞衍生因子-1α(stromal cell-derived factor-1α，SDF-1α)和單核細胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)的mRNA水平 將結腸組織勻漿后提取組織總RNA，測定濃度后，經逆轉錄，應用real-time PCR試劑盒，將cDNA進行擴增，每個標本做復孔檢測。引物設計用Primer Premier 5.0軟件。

2.4 ELISA法測定血漿MPO、COX-2、SDF-1α和MCP-1的水平 按照商家提供的試劑盒說明書，用ELISA法測定血漿MPO、COX-2、SDF-1α和MCP-1的水平。

2.5 免疫組織化學法檢測小鼠結腸CXCR4、β-arrestin、p-JNK、內皮細胞蛋白C受體(endothelial protein C receptor，EPCR)和血栓調節(jié)蛋白(thrombomo-dulin，TM)的分布及蛋白水平 切片脫蠟至水化，3% H2O2阻斷內源性過氧化物酶，微波修復抗原后，分別與 CXCR4、β-arrestin、p-JNK、EPCR和TM 的 I 抗 (Santa Cruz) 4 ℃孵育過夜，滴加 II 抗及辣根過氧化物酶標記鏈霉卵白素工作液，二氨基聯苯胺 (3,3’-diaminobenzidine，DAB) 顯色，棕褐色反應產物代表抗原定位。

2.6 Western blot法檢測小鼠結腸CXCR4、β-arrestine、p-JNK、EPCR和TM的蛋白水平 制備組織樣品，運用 BCA 蛋白定量法對蛋白質濃度進行測定； 配制合適濃度的分離膠和5%的濃縮膠并上樣，行SDS-PAGE 分離蛋白，恒流250 mA轉膜1.5 h，5% 牛奶(TBST 配制)室溫封閉 60～90 min，加 I抗雜交，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜，加入酶標 II 抗，室溫孵育 60 min，TBST 洗膜，ECL發(fā)光液曝片，用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)設置參數，使用化學發(fā)光成像儀進行拍照，最后根據Marker位置及蛋白分子量比對結果。

2.7 免疫比濁法測定小鼠血漿蛋白C(protein C，PC)和蛋白S(protein S，PS)的活性 應用 STAGO 全自動血凝儀微量管測定小鼠血漿 PC和PS的活性，試劑為配套 PC和PS試劑。

2.8 結腸黏膜微血管內皮細胞的分離、培養(yǎng)及鑒定 以酶消化法分離組織，培養(yǎng)在含20%優(yōu)質胎牛血清(HyClone)、1×105U/L注射用青霉素、0.1 g/L注射用鏈霉素、肝素、內皮細胞生長因子、0.584 g/L谷氨酰胺的MCDB131培養(yǎng)基，觀察植塊及細胞貼壁情況，每12 h觀察 1 次。經過局部消化處理、差速黏附處理后得到純化的細胞，傳代培養(yǎng)，取第3代對數生長期的細胞懸液接種到預先放置有蓋玻片的6孔板中，待細胞基本長成單層后，4%多聚甲醛室溫固定，滴加兔抗鼠Ⅷ因子抗體4 ℃過夜，滴加辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG工作液，DAB試劑盒顯色，蘇木素復染，50%緩沖甘油封片，鏡檢。鏡下觀察3個有代表性的視野，各觀察100個細胞，計算陽性細胞率。

2.9 發(fā)色底物法檢測SDF-1α對微血管內皮細胞激活的蛋白 C(activated protein C,APC)活性的影響 血管內皮細胞與SDF-1α (50 μg/L)共孵育24 h，以冷TBS(含 50 mmol/L Tris-HCl、120 mmol/L NaCl、2.7 mmol/L KCl和3 g/L BSA)洗滌細胞3次，并加入200 nmol/L小鼠PC(Enzyme Research Laboratories)600 U/L，37 ℃孵育 1 h，用發(fā)色底物進行APC活性測定。

2.10 過表達CXCR4結腸黏膜微血管內皮細胞的構建 用細胞核電穿孔儀(Lonza)轉染pCMV6-hCXCR4質粒入細胞，造成結腸黏膜微血管內皮細胞過表達CXCR4，Western blot法分析EPCR、TM、β-arrestin和p-JNK表達的改變，用免疫比濁法檢測細胞上清液中PC和PS的活性，用發(fā)色底物法檢測APC的活性。

2.11 沉默CXCR4的內皮細胞的建立 采用Invitrogen的Lentivirus系統(tǒng)，先合成用于沉默CXCR4的sh-CXCR4及作為對照的sh-scrambled載體，與病毒包裝載體(pMDLg/pRRE、 pRSV-REV和pMD2-VSVG)共轉染HEK293細胞，并于48 h后收集上清，過濾后測滴度。病毒感染LS174T細胞的同時，加入8 mg/L polybrene (Sigma)，72 h后Western blot法分析EPCR、TM、β-arrestin和p-JNK表達的改變，用免疫比濁法檢測細胞上清液中PC和PS的活性，發(fā)色底物法測定細胞上清液中APC的活性。實驗中設置感染GFP病毒孔檢測基因敲除效率。

2.12 Western blot法檢測 SDF-1α對微血管內皮細胞EPCR、TM 表達的影響 調整微血管內皮細胞濃度為 5×107/L，融合的單層細胞分別與50 μg/L TNF-α、1×105U/L IL-6 共培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)結束后離心取細胞上清液。用BCA蛋白定量法對蛋白質濃度進行測定，余方法同2.6。

3 統(tǒng)計學處理

應用SPSS 11.5軟件對資料進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數±標準誤(mean±SEM)表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析檢驗，方差分析后的兩兩比較采用 SNK-q檢驗，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學顯著性。

結 果

1 體重、結腸長度、脾重及大體積分

如圖1所示，與對照組相比，UC 組小鼠的體重明顯減輕，結腸長度明顯縮短，脾重明顯增加，大體積分明顯升高，差異均具有統(tǒng)計學顯著性(P<0.05)。

2 組織病理積分及潰瘍指數

HE染色結果表明，UC組小鼠的結腸組織黏膜受損，陷窩結構破壞，黏膜下充血、水腫，中性粒細胞、巨噬細胞等炎癥細胞浸潤。與對照組比較，UC組的病理組織學積分顯著增加，潰瘍指數明顯增高(P<0.05)，見圖2。

3 結腸組織及血漿MPO、COX-2、SDF-1α和MCP-1水平的變化

由圖3可見，正常小鼠結腸組織MPO、COX-2、SDF-1α和MCP-1的mRNA表達均處于較低水平，DSS造模后明顯升高，與對照組比較差異有統(tǒng)計學顯著性(P<0.05或P<0.01)；血漿中MPO、COX-2、SDF-1α和MCP-1的活性也比對照組的低水平明顯升高(P<0.01)。

4 結腸組織CXCR4、β-arrestin、p-JNK、EPCR和TM的蛋白水平的變化

免疫組化結果顯示，對照組小鼠的結腸組織表達豐富的EPCR和TM，陽性表達主要位于黏膜及黏膜下層微血管內皮細胞，而CXCR4、β-arrestin和p-JNK顯色微弱；在DSS模型小鼠，EPCR的表達明顯下調，TM未改變，CXCR4、β-arrestin和p-JNK的蛋白水平卻明顯升高(P<0.05)，見圖4。

Figure 1.The parameters of the pathological impairment and macroscopic score in DSS-induced ulcerative colitis (UC) mice. A: macroscopical changes of the UC mice; B: comparison of body weight, spleen weight, colon length and macroscopic score. Mean±SEM.n=10.*P<0.05vscontrol.

圖1 結腸炎小鼠組織損傷情況及大體積分

Figure 2.The histopathological scores in DSS-induced ulcerative colitis (UC) mice (HE staining). Mean±SEM.n=10.*P<0.05vscontrol group.

圖2 結腸組織HE染色及組織積分和潰瘍指數

Figure 3.The cytokine and chemokine mRNA levels and activity in the colon and plasma. A: the mRNA expression of cytokines and chemokines in the mouse colonic tissues; B: the activity of cytokines and chemokines in the mouse plasma. Mean±SEM.n=10.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖3 結腸組織及血漿MPO、COX-2、SDF-1α和MCP-1的mRNA水平及活性

Figure 4.The protein levels of CXCR4, β-arrestin, p-JNK, EPCR and TM in the colon observed by immunohistochemical staining. A: CXCR4, β-arrestin, and p-JNK in the colon； B: EPCR and TM in the colon.

圖4 結腸組織CXCR4、β-arrestin、p-JNK、EPCR和TM的蛋白水平

Western blot實驗結果表明，與對照組比較，EPCR的表達降低(P<0.05)，CXCR4、β-arrestin和p-JNK的蛋白水平升高(P<0.05)，TM表達未改變，見圖5。

Figure 5.The protein levels of CXCR4, β-arrestin, p-JNK MAPK, EPCR and TM in the colon detected by Western blot. Mean±SEM.n=10.*P<0.05vscontrol group.

圖5 結腸組織CXCR4、β-arrestin、p-JNK MAPK、EPCR和TM的蛋白水平

5 血漿PC和PS活性的改變

對照組小鼠血漿PC和PS的活性分別為(118.3±17.9)%和(95.7±19.4)%,UC組分別降低至(60.4±13.4)%和(69.6±18.1)%，與對照組比較差異均具有統(tǒng)計學顯著性(P<0.05或P<0.01)，見圖6。

Figure 6.The activity of PC and PS in the plasma. Mean±SEM.n=10.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖6 血漿PC和PS的活性觀察

6 SDF-1α對結腸黏膜微血管內皮細胞EPCR、TM表達及PC、PS、APC活性的影響

正常結腸黏膜微血管內皮細胞呈“鋪路石”樣改變，經兔抗鼠Ⅷ因子抗體染色后呈陽性表達，表明細胞培養(yǎng)成功。經SDF-1α刺激后，正常結腸黏膜微血管內皮細胞表達EPCR的水平下調，TM表達無明顯變化，PC、PS和APC的活性降低，提示在細胞水平，CXCR4反向調節(jié)PCS活性；進一步觀察CXCR4沉默的結腸黏膜微血管內皮細胞，發(fā)現SDF-1α不影響其表達EPCR和TM水平，也不影響細胞上清液PC、PS和APC的活性；而在CXCR4過表達結腸黏膜微血管內皮細胞，SDF-1α對EPCR的抑制作用更明顯，對細胞上清液PC、PS和APC活性的抑制也更明顯，與對照組比較，差異具有統(tǒng)計學顯著性(P<0.05),見圖7。

7 SDF-1α對結腸黏膜微血管內皮細胞β-arrestin及p-JNK蛋白水平的影響

如圖7所示，與SDF-1α共孵育后，正常結腸黏膜微血管內皮細胞的β-arrestin及p-JNK蛋白水平均較對照組明顯上調(P<0.05)；在CXCR4沉默的結腸黏膜微血管內皮細胞，SDF-1α不影響其β-arrestin及p-JNK的水平，而在CXCR4過表達的結腸黏膜微血管內皮細胞，SDF-1α對β-arrestin及p-JNK的上調作用更明顯(P<0.05)。

Figure 7.The effect of SDF-1α on the activity of PCS and the protein levels of β-arrestin and p-JNK in the colonic mucosal microvascular endothelial cells. A: cultured mouse colonic mucosal microvascular endothelial cells; B: the cells were identified by factor VIII staining; C: the effect of SDF-1α on the protein expression of EPCR and TM; D: the effect of SDF-1α on the activity of PC, PS and APC; E: the effect of SDF-1α on the protein levels of β-arrestin and p-JNK. Mean±SEM.n=10.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsSDF-1α group.

圖7 SDF-1α對結腸黏膜微血管內皮細胞PCS活性及β-arrestin、p-JNK蛋白水平的影響

討 論

PCS是體內主要的抗凝系統(tǒng)[3]，由TM、EPCR、PC和PS等組成，凝血酶與TM結合啟動，可將PC激活為APC，APC在游離PS存在的條件下，抑制凝血因子Ⅴ和Ⅷ的活化，阻止血栓形成。有研究表明，CD和UC患者的PCS缺失[14]，因此，炎性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)患者的高凝狀態(tài)不僅與炎癥過程相關，而且與抗凝系統(tǒng)失調有關。

本研究采用DSS結腸炎模型，發(fā)現模型小鼠的大體積分和組織學積分顯著增高，組織及血漿MPO、COX-2、SDF-1ɑ、MCP-1 等趨化因子水平明顯升高，提示本實驗模型復制成功。而與此同時，隨著DSS小鼠炎癥程度的加重，PCS活性明顯受抑，主要表現為血漿PC、PS的活性降低，結腸組織EPCR蛋白表達降低；經SDF-1α刺激后，結腸黏膜微血管內皮細胞以上指標均降低，且APC活性被抑制，提示趨化因子升高與PCS可能存在某種關系，但這些升高的趨化因子究竟是通過何種途徑發(fā)揮作用，并進一步影響PCS活性，目前還未見相關報道。

CXCR4屬于CXCR類趨化因子受體，是趨化因子SDF-1α的特異性GPCR，其在UC發(fā)病中的作用尚未明確。本研究發(fā)現，在整體水平，DSS模型小鼠的PCS被抑制的同時，其結腸黏膜CXCR4表達明顯升高，在體外，經SDF-1α刺激，結腸黏膜微血管內皮細胞PCS也被抑制，細胞實驗提示CXCR4沉默不影響SDF-1α對結腸黏膜微血管內皮細胞PCS的抑制作用，而CXCR4過表達則加重這種抑制能力。這些結果提示CXCR4可能參與UC小鼠PCS抑制的病理過程。

為進一步探討CXCR4對PCS抑制的可能機制，我們檢測了相關信號通路蛋白。眾所周知，炎癥反應取決于胞內信號通路的激活，絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)是高度保守的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶家族，其主要成員包括細胞外信號調節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinases，ERK)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)和p38。多項研究表明，過度激活的MAPK與UC進展相關，代表了新的抗炎治療的靶點[15-19]。我們前期研究結果表明，p-p38 MAPK和p-ERK水平在UC小鼠的表達并無明顯改變，本實驗中p-JNK卻明顯升高，細胞實驗也得出了相似的結果，表明JNK激活參與調節(jié)UC時PCS的改變。

β-arrestin作為支架蛋白聯系GPCR與激酶介導的信號轉導通路，參與GPCR激活的ERK、JNK3和p38 MAPK信號轉導通路的調節(jié)，是GPCR信號轉導通路的負調節(jié)者[20-21]。最近有研究顯示β-arrestin信號通路在UC中發(fā)揮重要作用[22]，但其與MAPK信號通路的關系尚無定論。細胞培養(yǎng)模型顯示，β-arrestin 對MAPK信號兼具正性、負性調節(jié)作用[23]，既然MAPK信號通路是UC模型炎癥信號關鍵的介導者，而β-arrestin對MAPK又有調節(jié)作用，因此我們推測β-arrestin-MAPK信號通路參與調節(jié)UC時PCS的變化。本研究動物實驗發(fā)現，模型組β-arrestin與p-JNK表達均較對照組明顯上調，體外經SDF-1α刺激后，微血管內皮細胞β-arrestin與p-JNK表達也上調，且這種上調作用在CXCR4過表達細胞更明顯，而這一結果與PCS被抑制的趨勢一致，以上體內外實驗均證實β-arrestin-JNK信號通路參與調節(jié)UC時PCS的變化。

綜上所述，本實驗初步證實CXCR4可能在UC病理過程中介導趨化因子進一步影響血管內皮細胞功能，從而抑制PCS。其機制可能涉及趨化因子-β-arrestin-JNK信號通路。本文通過闡明CXCR4在UC小鼠PCS變化中的作用，不僅為UC發(fā)病機制提供理論依據，也為UC相關相關藥物的開發(fā)開辟新途徑。

[1] Z?ller B, Li XJ, Sundquist J, et al. Autoimmune diseases and venous thromboembolism: A review of the literature[J]. Am J Cardiovasc Dis, 2012, 2(3):171-183.

[2] Tolstanova G, Deng X, French SW, et al. Early endothelial damage and increased colonic vascular permeability in the development of experimental ulcerative colitis in rats and mice[J]. Lab Invest, 2012, 92(1):9-21.

[3] Lust M, Vulcano M, Danese S. The protein C pathway in inflammatory bowel disease: the missing link between inflammation and coagulation[J]. Trends Mol Med, 2008, 14(6):237-244.

[4] D’Alessio S, Genua M, Vetrano S. The protein C pathway in intestinal barrier function: challenging the hemostasis paradigm[J]. Ann N Y Acad Sci, 2012, 1258:78-85.

[5] Michihide U, Tadakazu H, Jun M, et al. Mucosal CXCR4+IgG plasma cells contribute to the pathogenesis of human ulcerative colitis through FcγR-mediated CD14 macrophage activation[J]. Gut, 2013, 62(12):1734-1744.

[6] Hosomi S, Oshitani N, Kamata N, et al. Increased numbers of immature plasma cells in peripheral blood specifically overexpress chemokine receptor CXCR3 and CXCR4 in patients with ulcerative colitis[J]. Clin Exp Immunol, 2011, 163(2):215-224.

[7] Xia XM, Wang FY, Xu WA, et al. CXCR4 antagonist AMD3100 attenuates colonic damage in mice with experimental colitis[J]. World J Gastroenterol, 2010, 16(23):2873-2880.

[8] Sakae M, Hiroshi N, Shuji Y, et al. Blockade of CXCL12/CXCR4 axis ameliorates murine experimental colitis[J]. J Pharmacol Exp Ther, 2008, 327(2):383-392.

[9] Liu X, Zuo D, Fan H, et al. Over-expression of CXCR4 on mesenchymal stem cells protect against experimental colitis via immunomodulatory functions in impaired tissue[J]. J Mol Histol, 2014, 45(2):181-193.

[10]張 忠， 程富勝， 賈 寧， 等. 小鼠潰瘍性結腸炎模型的建立及病理組織學比較[J]. 中國實驗動物學報, 2012, 20(6):69-72.

[11]Murano M, Maemura K, Hirata I, et al. Therapeutic effect of intracolonically administered nuclear factor κB (p65) antisense oligonucleotide on mouse dextran sulphate sodium (DSS)-induced colitis[J]. Clin Exp Immunol, 2000, 120(1):51-58.

[12]Siegmund B, Lehr HA, Fantuzzi G, et al. IL-1β-converting enzyme (caspase-1) in intestinal inflammation[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2001， 98(23):13249-13254.

[13]Nirmal SA, Dhikale RS, Girme AS, et al. Potential of the plantThespesiapopulneain the treatment of ulcerative colitis[J]. Pharm Biol, 2015, 53(9):1379-1385.

[14]Owczarek D, Cibor D, Saapa K, et al. Anti-inflammatory and anticoagulant properties of the protein C system in inflammatory bowel disease[J]. Pol Arch Med Wewn, 2012, 122(5):209-216.

[15]Wakeman D, Schneider JE, Liu J, et al. Deletion of p38-alpha mitogen-activated protein kinase within the intestinal epithelium promotes colon tumorigenesis[J]. Surgery, 2012, 152(2):286-293.

[16]Zhao X, Zhi F, Kang B, et al. Evaluation of p38 MAPK pathway as a molecular signature in ulcerative colitis[J]. J Proteome Res, 2011, 10(5):2216-2225.

[17]Kersting S, Behrendt V, Kersting J, et al. The impact of JNK inhibitor D-JNKI-1 in a murine model of chronic colitis induced by dextran sulfate sodium[J]. J Inflammation Res, 2013, 6(1):71-81.

[18]Reinecke K, Eminel S, Dierck F, et al. The JNK inhibitor XG-102 protects against TNBS-induced colitis[J]. PLoS One, 2012, 7(3):e30985.

[19]Schwanke RC, Marcon R, Meotti FC, et al. Oral administration of the flavonoid myricitrin prevents dextran sulfate sodium-induced experimental colitis in mice through modulation of PI3K/Akt signaling pathway[J]. Mol Nutri Food Res, 2013, 57(11):1938-1949.

[20]DeWire SM, Ahn S, Lefkowitz RJ, et al. Beta-arrestins and cell signaling[J]. Annu Rev Physiol, 2007, 69(1):483-510.

[21]Brown MD, Sacks DB. Protein scaffolds in MAP kinase signalling[J]. Cell Signal, 2009, 21(4):462-469.

[22]范 恒， 廖 奕， 唐 慶， 等. β-Arrestin信號轉導通路在炎癥性腸病發(fā)生過程中的作用機制[J]. 世界華人消化雜志, 2010, 18(29):3114-3120.

[23]Whalen EJ, Rajagopal S, Lefkowitz RJ. Therapeutic potential of β-arrestin- and G protein-biased agonists[J]. Trends Mol Med, 2011, 17(17):126-139.

(責任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Role of CXCR4 in changes of protein C system in ulcerative colitis mice

LIN Xu-hong1, WANG Dan-dan2, WANG Hui-chao3, LI Yu-xia1, YANG Rui-lin1

(1DepartmentofClinicalLaboratoryofHuaiheHospital,TranslationalMedicalCenter,2DepartmentofCardiologyofHuaiheHospital,SchoolofMedicine,3DepartmentofNephrology,theFirstAffiliatedHospital，HenanUniversity,Kaifeng475000,China.E-mail:uhchao@163.com)

AIM: To explore the role of chemokine receptor CXCR4 in the pathogenesis of protein C system (PCS) in ulcerative colitis (UC).METHODS:Invivo, the mice were divided into control group and UC group. The macroscopic score, microscopic score and ulcer index were assessed. The mRNA levels and activity of myeloperoxidase (MPO), cyclooxygenase-2 (COX-2), stromal cell-derived factor-1α (SDF-1α) and monocyte chemotactic protein 1 (MCP-1) both in colonic tissue and plasma were determined. The expression and location of CXCR4, β-arrestin, p-JNK, endothelial cell protein C receptor (EPCR) and thrombomodulin (TM) were detected. The activity of protein C (PC) and protein S (PS) was measured in each group.Invitro, mouse colonic microvascular endothelial cells were isolated, cultured and identified. Both CXCR4-overexpressing and CXCR4-silencing colonic mucosa microvascular endothelial cells were constructed. The effects of SDF-1α on the protein levels of EPCR, TM, β-arrestin and p-JNK， and on the activity of PC, PS and activated protein C (APC) were observed. RESULTS: Compared with control group, UC mice showed increased gross score, histopathological score and ulcer index (P<0.05). The mRNA levels and activity of MPO, COX-2, SDF-1α and MCP-1 in colon and plasma were increased (P<0.01). The protein levels of CXCR4, β-arrestin and p-JNK were up-regulated, EPCR expression was down-regulated in colon, and the activity of PC and PS in plasma was decreased (P<0.05 orP<0.01). CXCR4 overexpression further aggravated SDF-1α-induced PCS inhibition in colonic mucosa microvascular endothelial cells, and further up-regulated the protein levels of β-arrestin and p-JNK (P<0.05). CONCLUSION: PCS is inhibited in UC. CXCR4 is involved in the regulation of PCS inhibition by mediating chemokines and acting on colonic mucosa microvascular endothelial cells through β-arrestin-JNK pathway.

CXCR4; Ulcerative colitis; Protein C system; Thrombosis

1000- 4718(2016)10- 1854- 09

2016- 05- 19

2016- 08- 22

國家自然科學基金資助項目 (No.U1304802； No.81500430)

△通訊作者 Tel: 0371-22736820； E-mail: uhchao@163.com

▲并列第1作者

R363.2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.10.019

雜志網址： http://www.cjpp.net