韋雪梅， 邱 霓， 熊 燕

(廣州醫(yī)科大學藥學院，廣州蛇毒研究所，廣東 廣州 511436)

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高脂飼養(yǎng)致小鼠胰島素抵抗對脂肪肝形成的影響*

韋雪梅▲， 邱 霓▲， 熊 燕△

(廣州醫(yī)科大學藥學院，廣州蛇毒研究所，廣東 廣州 511436)

目的： 探討高脂飼養(yǎng)致小鼠脂肪肝形成的機制。方法：隨機將8周雄性C57BL/6J小鼠分成高脂飼養(yǎng)組(給予含60%卡路里的高飽和脂肪酸飼養(yǎng))和正常對照組，飼養(yǎng)12周。監(jiān)測體重、肝重、血甘油三酯、血總膽固醇、血糖和血胰島素水平，通過高胰島素正葡萄糖鉗夾實驗反映胰島素敏感性，HE染色、蘇丹IV染色及肝脂含量反映肝組織脂質沉積情況，確定高脂飼養(yǎng)致小鼠脂肪肝的形成。通過Western blot法檢測磷酸化胰島素受體底物1(IRS1)和蛋白激酶B(Akt)水平反映胰島素信號通路激活情況，檢測固醇調節(jié)元件結合蛋白1(SREBP-1)和脂肪酸合成酶(FAS)蛋白水平反映肝內脂質合成的情況。結果：高脂飼養(yǎng)組小鼠體重及肝重較正常對照組小鼠明顯增加。與正常對照組相比，高脂組血和肝組織內甘油三酯和總膽固醇含量顯著升高，血清胰島素水平升高，葡萄糖輸注率減少，磷酸化IRS1和Akt水平降低。肝組織HE染色可見高脂組肝細胞胞漿內充滿大量脂肪空泡，蘇丹IV染色可見肝細胞內存在大量大小不一的紅色脂滴；SREBP-1和FAS蛋白水平明顯升高。給予外源性油酸干預原代正常肝細胞48 h，磷酸化IRS1和Akt水平呈濃度依賴性減低，而SREBP-1和FAS蛋白表達明顯升高。結論：高脂飼養(yǎng)導致小鼠肝臟發(fā)生胰島素抵抗，并通過激活SREBP-FAS脂肪合成途徑，促進肝臟脂質沉積，從而誘發(fā)脂肪肝。

胰島素抵抗； 脂肪肝； 高脂飲食

隨著全球肥胖人數(shù)的劇增，因肥胖所致的一系列代謝性疾病的發(fā)生率也隨之增加[1]。飲食習慣的改變，大量高脂、高糖食物的攝入，導致營養(yǎng)過剩，是誘發(fā)肥胖的重要因素。胰島素抵抗(insulin resis-tance,IR)是肥胖的主要特征之一，也是代謝性疾病如2 型糖尿病、心血管疾病、非酒精性脂肪肝等發(fā)展過程中重要的病理基礎[2]。

肥胖患者脂肪組織內脂肪分解代謝活動旺盛，使細胞內甘油三酯(triglyceride，TG)分解釋放游離脂肪酸(free fatty acids，F(xiàn)FA)增加，血液的游離脂肪酸水平升高，導致大量的游離脂肪酸進入肝臟和骨骼肌組織中，導致肝臟脂質沉積，促進脂肪肝的形成[3]。脂肪肝作為肝臟疾病的重要病理過程，如不及時治療，可能加重并發(fā)生肝組織纖維化，甚至肝硬化。肝臟是胰島素作用的主要靶器官之一；大量臨床資料顯示，幾乎所有肥胖伴脂肪肝患者都存在周圍組織和肝臟的胰島素抵抗，且胰島素抵抗的嚴重程度與脂肪肝的病情進展密切相關[4-5]，但胰島素抵抗促脂肪肝形成的分子機制仍未完全闡明，因此深入探討胰島素抵抗所致脂肪肝形成的分子機制，將有助于預防和治療肥胖所致脂肪肝的形成。

本研究擬以高脂飼養(yǎng)致肥胖小鼠和經油酸處理的原代小鼠肝細胞為模型，觀察高脂對肝臟組織及肝細胞胰島素敏感性及脂質形成的影響，以探討肥胖致胰島素抵抗誘導脂肪肝形成的分子機制。

材 料 和 方 法

1 抗體和試劑

胰島素受體底物1(insulin receptor substrate 1,IRS1)、p-Akt(Ser473)和Akt抗體購自Cell Signaling Technology；p-IRS1(Tyr632)抗體購自 Santa Cruz; HRP 標記的山羊抗兔 IgG、HRP 標記的山羊抗鼠 IgG、ECL 超敏發(fā)光液和BCA蛋白檢測試劑盒購自碧云天公司；油酸(oleic acid，OA)購自Sigma。

2 實驗方法

2.1 高脂飼養(yǎng)小鼠模型的建立 30只 8周齡雄性 C57BL/6J小鼠購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心，適應性飼養(yǎng) 1 周后，隨機分為正常對照(control)組和高脂飼養(yǎng)(high-fat diet，HFD)組，分別給予10%卡路里普通飼料和60%卡路里的高脂飼料喂養(yǎng)12周，每周記錄體重變化。實驗用普通飼料和高脂飼料均購買于廣東省實驗動物中心。

2.2 高胰島素正葡萄糖鉗夾試驗 高脂飼養(yǎng)第10周末，2組小鼠用10%的水合氯醛(按1 mL/300 g小鼠體重)經腹腔注射麻醉后，行頸靜脈埋管術，待小鼠恢復1周。在第12周鉗夾前1天晚給予小鼠禁食不禁水12 h；鉗夾當天通過Harvard微量注射泵分別以25 mU/kg的初始濃度和4 mU·kg-1·min-1的維持濃度，持續(xù)120 min靜脈泵入胰島素，同時以30%葡萄糖液持續(xù)靜脈泵入。每10 min通過鼠尾靜脈測定1次血糖值，及時調節(jié)葡萄糖溶液的輸注速度，以維持正常血糖水平。待血糖值穩(wěn)定后，記錄最后1 h內葡萄糖輸注速率以評價胰島素敏感性[6]。

2.3 血糖、血胰島素、血脂和肝臟脂質的測定 雄性小鼠眼球取血，血液凝固后，以3 000 r/min，4 ℃離心10 min分離血清，-80 ℃保存。血清采用南京建成生物工程研究所的總膽固醇(total cholesterol，TC)和TG含量測定試劑盒進行檢測。血清胰島素按照武漢華美生物有限公司的小鼠胰島素ELISA檢測試劑盒進行檢測。血糖采用電子感應法，用Roche的優(yōu)越血糖儀測定鼠尾靜脈血糖濃度。

小鼠處死后，迅速取出肝臟并置于液氮中，隨后在-80 ℃保存。取出約30 mg肝臟組織，于300 mL生理鹽水中剪碎并勻漿；12 000 r/min、4 ℃離心10 min后取上清到另一離心管內。用BCA法測定蛋白濃度并調整各樣本至統(tǒng)一濃度。測量方法同血脂測定。

2.4 HE染色 小鼠頸椎脫臼法處死后迅速取出肝臟組織，稱重后取部分肝組織以10%的甲醛溶液固定，制作常規(guī)石蠟切片，行HE染色，在Leica光學顯微鏡下進行觀察并拍照。

2.5 蘇丹Ⅳ染色 小鼠頸椎脫臼法處死后迅速取出部分肝臟組織包埋于OCT中，于冰凍切片機中進行連續(xù)切片，厚度為5 μm。將冰凍切片置于丙二醇中靜止2 min后，置于蘇丹Ⅳ染色缸內染色20 min；然后，將玻片分別置于85%乙醇、50%丙二醇中分化，用蘇木精細胞核復染1 min，封片后在Leica光學顯微鏡下觀察并拍照。

2.6 小鼠原代肝細胞的分離和培養(yǎng) 小鼠麻醉后，打開腹腔經下腔靜脈插管，先以流速為5.5 mL/min灌注D-Hanks液(含10 mmol/L HEPES和0.5 mmol/L EDTA， pH 7.4， 37 ℃)，待肝臟充分膨脹后，剪斷門靜脈；繼續(xù)灌流3 min 后，改用含0.1%胰蛋白酶的D-Hanks液灌注，流速為4.5 mL/min；見包膜下肝組織呈龜背狀裂開，取下肝臟，用4 ℃預冷PBS清洗肝臟，撕開包膜，制成肝細胞懸液。100目細胞篩過濾后，4 ℃、400 r/min離心5 min，棄上清，以含10% 胎牛血清的高糖DMEM重懸細胞，接種到6孔板中；5% CO2、37 ℃培養(yǎng)4 h后更換新鮮完全培養(yǎng)基，次日加藥處理。

2.7 Western blot實驗 取肝臟組織約30 mg，加入300 μL RIPA(含100 μmol/L PMSF)，用彎眼科剪剪碎組織，使用機械勻漿機勻漿后，12 000 r/min、4 ℃離心10 min，取上清；采用BCA法測蛋白濃度。取30 μg蛋白進行SDS-PAGE，濕轉法將蛋白條帶轉移到PVDF 膜上；用含5%脫脂奶粉封閉1 h 后依次加入 I 抗和 II 抗，洗膜后用ECL化學發(fā)光法顯影，通過ChemiDoxTMXRS+凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，使用ImageJ軟件進行灰度掃描。

3 統(tǒng)計學處理

利用SPSS 11.5 和Prism 5.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據處理和分析，所有數(shù)據均以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示。所有數(shù)據進行正態(tài)性檢驗。兩組樣本均數(shù)比較采用兩個獨立樣本的t檢驗，多組間均數(shù)比較用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 高脂飼養(yǎng)對小鼠體重、肝臟重量的影響

飼養(yǎng)12周后，高脂飼養(yǎng)組小鼠體重明顯超過正常對照組(P<0.01)；高脂飼養(yǎng)組小鼠肝臟重量也較正常對照組增加(P<0.05)。與正常對照組相比，高脂飼養(yǎng)組小鼠的肝臟質量/體重比也明顯增加(P<0.05)，見表1。

表1 高脂飲食組和正常對照組小鼠體重、肝重及肝重/體重的比較

Table 1.The body weight, liver weight and ratio of liver weight to body weight in control group and HFD group (Mean±SD.n=10)

GroupBodyweight(g)BeforeAfterLiverweight(g)Liverweight/bodyweightControl22．5±1．730．6±1．11．25±0．200．041±0．006HFD22．3±1．337．2±1．6??1．71±0．12?0．048±0．002?

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

2 高脂飼養(yǎng)對小鼠葡萄糖、胰島素及胰島素敏感性的影響

雖經高脂飼養(yǎng)12周后，高脂飼養(yǎng)組和正常對照組小鼠空腹血糖濃度無顯著差異，但高脂飼養(yǎng)組小鼠的血清胰島素水平比正常對照組升高近2倍(P<0.01)，見表2；同時，高胰島素正葡萄糖鉗夾實驗結果表明，高脂飼養(yǎng)組小鼠平均葡萄糖輸注率為(24.32±2.45) mg·kg-1·min-1，較正常對照組[(65.67±5.31) mg·kg-1·min-1]減低(P<0.01)，說明為維持正常血清葡萄糖水平，在給予同等水平外源性胰島素的情況下，高脂飼養(yǎng)組小鼠對外源性葡萄糖的處理能力僅為正常對照組的1/3水平(圖1)。上述結果表明高脂飼養(yǎng)的肥胖小鼠已處于胰島素抵抗階段。

Figure 1.The result of hyperinsulinemic englycemic clamp experiment. Mean±SD.n=6.**P<0.01vscontrol.

圖1 小鼠高胰島素正葡萄糖鉗夾實驗結果

3 高脂飼養(yǎng)致肝臟組織形態(tài)學變化

正常對照組小鼠肝臟被膜光滑，呈紅褐色，質地柔軟；而高脂飼養(yǎng)組小鼠肝臟色澤較正常組暗淡，偏向于黃色，質地偏硬。HE染色可見高脂飼養(yǎng)組小鼠出現(xiàn)不同程度的彌漫性肝細胞脂肪變性，表現(xiàn)為肝細胞的胞漿內充滿大量脂肪空泡。蘇丹IV染色結果顯示，對照組肝臟中未見明顯的脂滴沉積，而高脂飼養(yǎng)組小鼠肝臟中存在大量大小不一的紅色脂滴，進一步提示高脂導致小鼠肝臟內脂質沉積顯著增多,見圖2。

Figure 2.The HE staining (A) and Sudan IV staining (B) of the liver (×100).

圖2 肝臟組織HE染色圖和蘇丹IV染色圖

4 高脂飼養(yǎng)對小鼠血脂和肝脂的影響

高脂飼養(yǎng)顯著增加小鼠血清甘油三酯和總膽固醇濃度(P<0.01)，見表2。與病理形態(tài)學結果一致，高脂飼養(yǎng)組小鼠肝臟內甘油三酯和總膽固醇的含量明顯高于正常對照組小鼠(P<0.05)，見表3。

表2 高脂飼養(yǎng)組和正常對照組小鼠血清學相關指標的比較

Table 2.The serum biochemical indexes in the mice of control group and HFD group (Mean±SD.n=10)

GroupTG(mmol/L)TC(mmol/L)Insulin(mU/L)Glucose(mmol/L)Control0．62±0．322．27±0．559．56±2．315．55±0．18HFD1．48±0．50??3．37±0．60??17．44±4．03??5．82±0．33

**P<0.01vscontrol group.

表3 高脂飼養(yǎng)組和正常對照組小鼠肝臟脂肪相關指標的比較

Table 3.The contents of TG and TC in the liver of control group and HFD group (mmol/L. Mean±SD.n=10)

GroupTGTCControl3．17±0．952．51±0．27HFD4．94±1．14?2．82±0．14?

*P<0.05vscontrol group.

5 高脂飼養(yǎng)對小鼠肝臟組織胰島素信號通路的影響

高脂飼養(yǎng)小鼠出現(xiàn)胰島素抵抗的表現(xiàn)，肝臟作為胰島素的靶器官之一，是否也存在胰島素抵抗，我們隨后檢測了肝臟組織的胰島素信號通路關鍵蛋白——IRS1和Akt的磷酸化水平。與正常對照組相比，高脂飼養(yǎng)組小鼠肝臟內IRS1的第632位酪氨酸磷酸化水平明顯下調，表明高脂飼養(yǎng)小鼠肝臟對胰島素的反應性降低，見圖3。

6 高脂飼養(yǎng)對小鼠肝臟脂質合成的影響

為明確肝臟脂肪沉積的機制，我們檢測了脂質合成相關蛋白的表達，結果表明，高脂飼養(yǎng)顯著增加小鼠肝臟內脂肪酸從頭合成的關鍵蛋白固醇調節(jié)元件結合蛋白 1(sterol regulatory element-binding protein-1，SREBP-1)及其下游蛋白脂肪酸合成酶(fatty acid synthase，F(xiàn)AS)的表達，見圖4。

7 油酸促原代肝細胞胰島素抵抗及脂質合成

為進一步明確高脂致胰島素抵抗促脂肪肝形成的機制，我們采用酶消化法體外分離出8周正常雄性小鼠的肝臟細胞，并給予不同濃度油酸處理48 h。結果表明，隨著油酸濃度的增加，IRS1磷酸化水平下調，其下游信號分子Akt的磷酸化水平也隨之降低(圖5)，而肝細胞內SREBP-1和FAS的蛋白水平逐漸增加(圖6)。

Figure 3.The expression of insulin signaling proteins in the liver of control group and HFD group. Mean±SD.n=6.**P<0.01vswithout insulin；#P<0.05，##P<0.01vscontrol group.

圖3 肝臟組織胰島素信號通路相關蛋白表達情況

Figure 4.The expression of lipid synthesis proteins in the liver of control group and HFD group. Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vscontrol.

圖4 肝臟組織脂質合成通路相關蛋白表達情況

Figure 5.The expression of insulin signaling proteins in the primary hepatocytes incubated with oleic acid for 48 h. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol.

圖5 原代正常肝細胞油酸干預48 h后胰島素信號通路相關蛋白變化情況

討 論

本研究采用高飽和脂肪酸飲食飼養(yǎng)小鼠12周，發(fā)現(xiàn)小鼠體重及血脂水平高于正常對照組,提示高脂致肥胖小鼠模型建立成功；HE染色發(fā)現(xiàn)高脂飼養(yǎng)小鼠肝臟存在彌漫性肝細胞脂肪變性,表明高脂飼養(yǎng)致小鼠脂肪肝形成。目前高脂飲食致脂肪肝的機制仍不清楚。有研究報道，高脂飲食可導致胰島素抵抗，表現(xiàn)為空腹胰島素水平增加， 胰島素敏感性降低[7-8]。我們也觀察到高脂飼養(yǎng)小鼠的血胰島素水平增加，機體對外源性葡萄糖的清除能力明顯減弱，提示小鼠已存在胰島素抵抗的表現(xiàn)；也進一步證實本研究通過高飽和脂肪酸飼養(yǎng)致胰島素抵抗小鼠模型成功建立。

Figure 6.The expression of lipid synthesis proteins in the primary hepatocytes incubated with oleic acid for 48 h. Mean±SD.n= 3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol.

圖6 原代正常肝細胞油酸干預48 h后脂質合成相關蛋白變化情況

肥胖發(fā)生時，脂肪組織分解形成FFA的能力明顯增加，導致經過門靜脈輸送到肝臟的FFA增加[9]。高FFA水平能干擾胰島素在肝臟組織中與受體結合，顯著減低胰島素激活的IRS1酪氨酸磷酸化及下游信號分子Akt等活性，使胰島素的生物效應降低，發(fā)生胰島素抵抗[10]。本研究通過Western blot實驗檢測肝臟組織胰島素信號通路相關蛋白發(fā)現(xiàn)，高脂飼養(yǎng)組小鼠肝臟組織的IRS1酪氨酸磷酸化水平和下游Akt絲氨酸磷酸化水平顯著下降；另外，給予外源性油酸刺激原代肝細胞也發(fā)現(xiàn)，IRS1酪氨酸磷酸化水平和下游Akt絲氨酸磷酸化水平的活化呈劑量依耐性抑制，提示高脂不僅使小鼠發(fā)生全身胰島素抵抗，還導致肝臟組織胰島素信號轉導受損，胰島素敏感性降低。

在正?；A生理狀態(tài)下，肝內脂質僅有 5%來源于內源性脂質從頭合成途徑；然而，在病理狀態(tài)下如高脂環(huán)境，內源性脂質從頭合成途徑是肝內脂質沉積的一個重要來源[11]。SREBP是調節(jié)脂質從頭合成酶類表達的最重要的上游轉錄因子，其下游靶基因編碼的蛋白為肝臟脂質從頭合成的3個下游關鍵酶：乙酰輔酶 A 羧化酶(acetyl-CoA carboxylase，ACC)、FAS和硬脂酰輔酶A脫飽和酶(stearyl-CoA desaturase，SCD)[13]。本實驗觀察到，高脂飲食增加小鼠肝臟SREBP-1 蛋白及其下游 FAS 蛋白表達，這結果也表明高脂致脂肪肝的形成主要與肝臟內脂質從頭合成途徑過度激活有關。一直以來，肥胖致肝臟脂質沉積和胰島素抵抗之間的因果關系尚無定論；有研究者認為在脂肪肝形成過程中是先發(fā)生脂質的異常沉積再導致肝細胞發(fā)生胰島素抵抗，即所謂的“脂毒性”；也有研究者認為是因為發(fā)生了胰島素抵抗才導致脂質合成通路的異常激活，從而發(fā)生脂質的沉積[4, 10,13]。另外，IRS1/Akt信號通路對SREBP-1的作用在不同組織也存在差異。有報道證實，在HaCaT cells中，磷酸化的Akt可直接激活SREBP-1，促進脂肪酸合成[14]；而在骨骼肌和肝臟中，磷酸化的Akt則主要通過激活腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate-activated protein kinase，AMPK)信號通路而抑制SREBP-1的活化[15-17]。在本研究中觀察到，給予外源性油酸刺激原代肝細胞，導致IRS1/Akt胰島素信號轉導受抑制，在尚未出現(xiàn)明顯肝細胞內脂肪沉積之前，SREBP-1 蛋白及 FAS 蛋白表達已明顯升高，提示高脂飲食首先引起肝細胞內胰島素信號通路受損，進而激活肝細胞內脂質從頭合成信號通路，促使肝臟發(fā)生脂質沉積；但進一步的分子機制還有待后續(xù)深入研究。

綜上所述，長期高脂飲食導致機體脂肪代謝紊亂，血脂含量增加，機體及肝臟組織對胰島素敏感性下降，肝臟內脂質從頭合成通路被激活，可能是導致肝臟組織內脂質大量沉積，脂肪肝形成的主要原因。

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(責任編輯： 林白霜， 羅 森)

Effect of insulin resistance on fatty liver in high-fat diet-fed miceWEI Xue-mei, QIU Ni, XIONG Yan

AIM: To study the influence of insulin resistance on fatty liver in the mice fed with high-fat diet (HFD). METHODS: Male 8-week-old C57BL/6J mice were randomly divided into HFD group (with 60% calories by high saturated fatty acid) and control group (with chow diet).The mice in both groups were fed for 12 weeks. The body weight, liver weight, serum triglyceride (TG) and total cholesterol (TC), and blood glucose and insulin levels were measured. Hyperinsulinemic euglycemic clamp experiment was applied to reflect insulin sensitivity. The lipid deposition in the liver was analyzed by HE staining, Sudan IV staining and measurement of liver fat content. The phosphorylation levels of IRS1 and Akt, and the protein levels of SREBP-1 and FAS were determined by Western blot to reflect the activities of insulin signaling and lipid synthesis. RESULTS: Compared with control group, the body weight and liver weight were significantly increased in HFD group. TG and TC contents in serum and liver tissues were remarkably increased in HFD group. High-fat diet induced insulin resistance, as evidenced by increased serum insulin levels, reduced glucose infusion rate and decreases in IRS1 and Akt phosphorylation levels. In livers of HFD group, HE staining showed that the cytoplasm of hepatocytes was filled with vacuoles. Sudan IV staining also displayed that many different sizes of red lipid drops existed in the hepatocytes, and the protein levels of SREBP-1 and FAS were significantly increased. In primary normal hepatocytes with exogenous oleic acid intervention for 48 h, the phosphorylation levels of IRS1 and Akt were reduced, and the protein expression of SREBP-1 and FAS was significantly increased in a dose-dependent manner. CONCLUSION: Feeding with HFD leads to insulin resistance, resulting in activation of lipid synthesis and accumulation of lipid deposition in the liver, thus inducing fatty liver.

Insulin resistance; Fatty liver; High-fat diet

1000- 4718(2016)10- 1875- 06

2016- 04- 27

2016- 06- 20

中國博士后基金資助項目(No.2012M521590; No.2013T60792)；廣東省自然科學基金資金項目(No.s2013040014350)

△ 通訊作者 Tel: 020-37103273; E-mail: xiongyan2001@yahoo.com

▲ 并列第 1 作者

R363.2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.10.022

雜志網址： http://www.cjpp.net

(GuangzhouInstituteofSnakeVenomResearchandSchoolofPharmaceuticalSciences,GuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou511436,China.E-mail:xiongyan2001@yahoo.com)