周玉波， 扶招弟， 周麗芬， 陳慶梓， 楊春濤， 李建華

(廣州醫(yī)科大學(xué)生理教研室，廣東 廣州 511436)

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硫化氫對(duì)臭氧致小鼠氣道炎癥的影響*

周玉波▲， 扶招弟▲， 周麗芬， 陳慶梓， 楊春濤， 李建華△

(廣州醫(yī)科大學(xué)生理教研室，廣東 廣州 511436)

目的： 研究硫化氫(H2S)對(duì)臭氧(O3)暴露所致小鼠氣道炎癥的影響，并探究其機(jī)制。方法: 32只C57BL/6小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照(control)組、O3組、硫氫化鈉(NaHS)+O3組以及 NaHS組。第1、3、5 天將O3組和NaHS+O3組小鼠置于2.14 mg/m3O3環(huán)境中暴露3 h，同時(shí)control組和NaHS組置于新鮮空氣中暴露3 h。每次暴露前30 min，NaHS+O3組和NaHS組小鼠腹腔注射N(xiāo)aHS(14 μmol/kg)。末次暴露24 h后測(cè)定小鼠氣道反應(yīng)性，收集支氣管肺泡灌洗液用于炎性細(xì)胞計(jì)數(shù)和總蛋白測(cè)定，收集肺組織標(biāo)本行HE染色觀察形態(tài)改變。測(cè)定肺組織中IL-6、IL-8、丙二醛(MDA)和NF-κB p65蛋白水平。結(jié)果：與control組相比，O3組的氣道反應(yīng)性、炎性細(xì)胞數(shù)、總蛋白濃度和炎癥評(píng)分，以及IL-6、IL-8、MDA和NF-κB p65蛋白水平明顯增高，NaHS+O3組則明顯低于O3組。結(jié)論：H2S顯著減輕了O3暴露所致氣道炎癥反應(yīng)，可能與抑制脂質(zhì)過(guò)氧化和降低NF-κB表達(dá)相關(guān)。

硫化氫； 臭氧； 氣道炎癥

臭氧(ozone，O3)是最常見(jiàn)的空氣污染物之一，主要由機(jī)動(dòng)車(chē)廢氣在陽(yáng)光照射下形成。早期研究發(fā)現(xiàn)正常人短期內(nèi)吸入O3可以導(dǎo)致肺功能下降、氣道反應(yīng)性增加以及出現(xiàn)氣道炎癥反應(yīng)[1-2]。近年研究發(fā)現(xiàn)O3引起的肺損傷主要與氧化應(yīng)激和氣道炎癥相關(guān)[3]。硫化氫(hydrogen sulfide，H2S)是一種新型氣體信號(hào)分子，可以調(diào)控氧化與抗氧化平衡，抑制炎癥反應(yīng)，參與慢性阻塞性肺疾病、哮喘、急性肺損傷等多種呼吸系統(tǒng)疾病的病理生理過(guò)程[4-6]。H2S對(duì)O3暴露致小鼠氣道炎癥的作用及作用機(jī)制迄今鮮有報(bào)道。本研究在O3暴露前，給予外源性H2S供體硫氫化鈉(sodium hydrosulfide，NaHS)預(yù)處理，觀察H2S預(yù)處理對(duì)O3暴露致小鼠氣道炎癥的干預(yù)效果，同時(shí)初步探討其相關(guān)分子機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 動(dòng)物

C57BL/6小鼠，SPF級(jí)，雌雄各半，8～10周，20～22 g，由廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)為SCXK(粵)2013-0002。所有動(dòng)物均飼養(yǎng)于廣州醫(yī)科大學(xué)SPF級(jí)動(dòng)物房，環(huán)境溫度22～24 ℃，濕度40%～70%，12 h光照控制，可自由進(jìn)食進(jìn)水。

2 主要試劑

NaHS(Sigma)，用生理鹽水溶解成1 mmol/L濃度；戊巴比妥鈉(天津市百世化工有限公司)；總蛋白提取試劑盒和BCA蛋白定量試劑盒(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)；快速瑞氏-姬姆薩復(fù)合染色液和丙二醛(malondialdehyde，MDA)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；小鼠IL-6和IL-8 ELISA 試劑盒(欣博盛生物科技有限公司)；抗NF-κB p65抗體和HRP標(biāo)記羊抗兔IgG(CST);抗GAPDH抗體(Bioword)；其它生化試劑均為進(jìn)口分裝或國(guó)產(chǎn)分析純。

3 主要方法

3.1 實(shí)驗(yàn)分組及模型建立 32只C57BL/6小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照(control)組、O3組、O3+NaHS組和NaHS組，每組8只。O3組和O3+NaHS組小鼠于第1、3、5天在2.14 mg/m3臭氧環(huán)境中暴露3 h，control組和NaHS組于相同環(huán)境下新鮮空氣暴露，暴露時(shí)禁食禁水。O3+NaHS組和NaHS組于O3暴露前30 min腹腔注射N(xiāo)aHS(14 μmol/kg)[6]。

3.2 亞甲基藍(lán)法測(cè)定內(nèi)源性H2S合成酶活性 末次O3暴露24 h后，肺組織按照25 mg：1 000 μL的比例加入生理鹽水，勻漿至肉眼下無(wú)明顯組織塊，12 000 r/min 離心10 min，收集上清液,亞甲基藍(lán)法測(cè)定內(nèi)源性H2S合成酶活性。

3.3 氣道反應(yīng)性的測(cè)定 末次O3暴露24 h后，使用BUXCO無(wú)創(chuàng)小動(dòng)物肺功能儀檢測(cè)各組小鼠的氣道反應(yīng)性。依次霧化吸入不同濃度(3.12、6.25、12.5、25和50 g/L)的氯化乙酰甲膽堿(methacholine，MCh)，測(cè)定相應(yīng)濃度下增強(qiáng)的呼氣間歇(enhanced pause，Penh)值。以吸入生理鹽水(normal saline，NS)時(shí)的Penh值為基值，用Penh/NS%(MCh 激發(fā)的 Penh 值/NS激發(fā)的Penh 值×100%)最大值和PC100(氣道反應(yīng)性升高為NS值2倍時(shí)的MCh激發(fā)濃度)綜合評(píng)價(jià)氣道反應(yīng)性。Penh/NS%最大值越大，氣道反應(yīng)性則越高；PC100值越小，氣道敏感性則越高。

3.4 支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)中白細(xì)胞總數(shù)及分類(lèi)計(jì)數(shù) 測(cè)定氣道反應(yīng)性后，戊巴比妥鈉麻醉小鼠，仰臥位固定，氣管插管，解剖分離出左肺后結(jié)扎左主支氣管，每次以0.4 mL PBS灌洗右肺，反復(fù)灌洗回收3次(回收率大于80%)，收集的BALF于4 ℃、1 500 r/min離心10 min，細(xì)胞用1 mL PBS重懸，吹打均勻后取10 μL于血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上進(jìn)行白細(xì)胞總數(shù)計(jì)數(shù)，余下的BALF于4 ℃、1 500 r/min離心10 min，棄上清，取細(xì)胞沉淀涂片，用姬姆薩染色法在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞分類(lèi)計(jì)數(shù)(每例隨機(jī)計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞)。得各類(lèi)細(xì)胞百分比，將其乘以白細(xì)胞總數(shù)即為各類(lèi)細(xì)胞數(shù)。

3.5 BCA法檢測(cè)BALF中總蛋白濃度 按上述方法收集BALF，按照試劑盒說(shuō)明檢測(cè)BALF中總蛋白濃度。

3.6 肺組織切片HE染色及分析 肺組織用4%多聚甲醛溶液固定，常規(guī)方法制備病理切片， HE染色后觀察肺組織病理變化。按照參考文獻(xiàn)的方法對(duì)HE染色肺部切片進(jìn)行炎癥反應(yīng)程度評(píng)分[7]。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為：0分=無(wú)炎癥反應(yīng)；1分=輕度炎癥反應(yīng)，在氣管或血管周?chē)胺闻荼诖嬖诰衷钚缘难仔约?xì)胞浸潤(rùn)；2分=中度炎癥反應(yīng)，在氣管或血管周?chē)胺闻荼诖嬖诔善蚓植康难仔约?xì)胞浸潤(rùn)，累及的范圍小于1/3的肺橫截面積；3分=重度炎癥反應(yīng)，在氣管或血管周?chē)胺伍g質(zhì)存在彌漫性的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，1/3至2/3的面積受累。每只小鼠計(jì)數(shù)10個(gè)視野，取平均數(shù)作為每只小鼠的氣道炎癥反應(yīng)評(píng)分。

3.7 ELISA法測(cè)定肺組織勻漿液中IL-6和IL-8的含量 制備肺組織勻漿液，10 mg肺組織加入1 mL生理鹽水充分勻漿，12 000 r/min離心10 min，收集上清液做ELISA，保存至-80 ℃。取肺組織勻漿液和試劑盒放至室溫平衡20 min。按照試劑盒說(shuō)明檢測(cè)IL-6和IL-8的含量。

3.8 TBA法測(cè)定肺組織勻漿液中MDA的含量 肺組織按照10 mg∶100 μL的比例加入生理鹽水，勻漿至肉眼下無(wú)明顯組織塊。12 000 r/min離心10 min后取上清，按試劑盒說(shuō)明操作檢測(cè)MDA蛋白濃度，MDA 含量結(jié)果以μmol/g表示。

3.9 Western blot法檢測(cè)NF-κB p65蛋白的表達(dá)情況 取25 mg肺組織放入5 mL的離心管中，加入200 μL 2%組織裂解液。在冰上將肺組織勻漿磨碎后充分裂解，4 ℃、14 000×g離心5 min，取上清液，按BCA試劑盒所示的方法測(cè)定蛋白質(zhì)的濃度。各組取60 μg蛋白樣品于10% SDS-PAGE分離，電濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上。將PVDF膜取出放入TBST溶液洗10 min 3次，5%脫脂奶粉封閉 1 h。封閉后用TBST緩沖液洗10 min 3次，加3% BSA稀釋的NF-κB p65(1∶1 000)及GAPDH(1∶2 000)4 ℃搖床孵育過(guò)夜。次日于室溫復(fù)溫1 h，用TBST緩沖液洗10 min 3次，加HRP標(biāo)記羊抗兔IgG(1∶5 000)水平搖床室溫孵育1 h。用TBST緩沖液洗10 min 3次。經(jīng)ECL化學(xué)發(fā)光劑曝光5 min，用ImageJ 軟件分析條帶吸光度值，用目標(biāo)蛋白條帶與GAPDH條帶的吸光度值比值表示該蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。兩組間比較采用獨(dú)立樣本資料t檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，在確定方差齊性后進(jìn)行Bonferroni法檢驗(yàn)，以P<0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 內(nèi)源性H2S合成酶活性變化

O3組內(nèi)源性H2S合成酶活性明顯低于control組(P<0．05)，見(jiàn)圖1。

Figure 1.The change of H2S synthase activity after O3exposure. Mean±SD.n=8.*P<0．05vscontrol group.

圖1 Control組與O3組H2S合成酶活性比較

2 氣道反應(yīng)性變化

O3組的Penh/NS%最大值顯著高于control組和O3+NaHS組(P<0.01)，O3+NaHS組、NaHS組和Control組兩兩比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P>0.05)。O3組PC100顯著低于control組和O3+NaHS組(P<0.01)，O3+NaHS組、NaHS組和control組兩兩比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見(jiàn)圖2。上述結(jié)果顯示，O3組的氣道反應(yīng)性顯著高于control組，O3+NaHS組的氣道反應(yīng)性顯著低于O3組。

Figure 2. Comparison of airway responsiveness in the mice with different treatments. Mean±SD.n=8.**P<0．01vscontrol group;##P<0．01vsO3group.

圖2 各組氣道反應(yīng)性比值的變化

3 BALF中白細(xì)胞總數(shù)計(jì)數(shù)與分類(lèi)計(jì)數(shù)情況

與control組和O3+NaHS組相比較，O3組BALF中白細(xì)胞總數(shù)、巨噬細(xì)胞數(shù)、中性粒細(xì)胞數(shù)和淋巴細(xì)胞數(shù)明顯增多(P<0．01)，O3+NaHS組、NaHS組和control組兩兩比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，各組小鼠嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)均無(wú)明顯變化，見(jiàn)表1。

4 BALF中總蛋白濃度變化

O3組BALF中總蛋白濃度明顯高于control組(P<0．05)，O3+NaHS組與O3組相比明顯降低(P<0．05)，O3+NaHS組、NaHS組和control組兩兩比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P>0．05)，見(jiàn)圖3。

表1 BALF的白細(xì)胞計(jì)數(shù)

*P<0．05vscontrol group;#P<0．05vsO3group.

Figure 3.Comparison of the protein concentrations in the BALF of different groups. Mean±SD.n=8.**P<0．01vscontrol group;##P<0．01vsO3group.

圖3 各組BALF總蛋白濃度比值的變化

5 肺組織病理形態(tài)學(xué)分析

光鏡下可見(jiàn)control組肺泡結(jié)構(gòu)完整，支氣管管腔規(guī)則，黏膜上皮細(xì)胞排列有序，氣道周?chē)窗l(fā)現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象。O3組可見(jiàn)肺泡壁結(jié)構(gòu)受損，肺間質(zhì)充血，支氣管管腔狹窄，氣管和血管周?chē)忻黠@的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象。O3+NaHS組肺泡結(jié)構(gòu)正常、氣管和血管周?chē)装Y明顯減輕。NaHS組肺泡結(jié)構(gòu)正常、氣管和血管周?chē)匆?jiàn)明顯異常，見(jiàn)圖4。

Figure 4.The morphological changes of the lung tissues in diffe-rent groups (HE staining, ×200).

圖4 各組肺組織的形態(tài)學(xué)改變

O3組炎癥反應(yīng)評(píng)分明顯高于control組(P<0.01)，O3+NaHS組炎癥評(píng)分與O3組相比明顯降低(P<0.01)，O3+NaHS組、NaHS組和control組兩兩比較無(wú)顯著差異，見(jiàn)圖5。

Figure 5.Semiquantitative analysis of the lung inflammation in different groups by inflammatory scoring. Mean±SD.n=8.**P<0．01vscontrol group；##P<0．01vsO3group.

圖5 各組肺組織炎癥評(píng)分

6 肺組織勻漿液中IL-6和IL-8含量變化

O3組肺組織勻漿液中IL-6和IL-8含量明顯高于control組(P<0．01)，O3+NaHS組IL-6和IL-8含量與O3組相比明顯降低(P<0．01)，O3+NaHS組、NaHS組和control組兩兩比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見(jiàn)圖6。

7 肺組織勻漿液中MDA含量的變化

O3組肺組織勻漿液中MDA含量明顯高于control組(P<0．01)，O3+NaHS組MDA含量較O3組明顯降低(P<0．01)，O3+NaHS組、NaHS組和control組兩兩比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見(jiàn)圖7。

8 NF-κB p65蛋白在肺組織中的表達(dá)情況

O3組NF-κB p65蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯高于control組(P<0．05)，O3+NaHS組NF-κB p65蛋白相對(duì)表達(dá)量較O3組明顯降低(P<0．05)，O3+NaHS組、NaHS組和control組兩兩比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見(jiàn)圖8。

討 論

O3作為一種強(qiáng)氧化性氣體，可與任何一種生物組織發(fā)生反應(yīng)，其中對(duì)呼吸道的破壞最為嚴(yán)重。本研究中O3組小鼠氣道反應(yīng)性增高，肺切片炎癥評(píng)分明顯增高，與我們以往發(fā)表的結(jié)果相似[8]。另外，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示O3暴露會(huì)導(dǎo)致BALF中白細(xì)胞總數(shù)明顯增多，巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和總蛋白濃度不同比例增多，肺組織勻漿液中脂質(zhì)過(guò)氧化物MDA含量明顯增高。一方面，O3直接攻擊氣道上皮細(xì)胞，使其合成和分泌大量趨化因子和炎癥介質(zhì)，引起炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)，造成氣道損傷[9]。另一方面，O3與氣道上皮細(xì)胞膜上的不飽和脂肪酸和肺泡表面活性物質(zhì)中的磷脂發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生臭氧化物自由基，引起氧化應(yīng)激[10]。氧化應(yīng)激導(dǎo)致機(jī)體活性氧和活性氮增多，它們可以直接刺激氣道感覺(jué)神經(jīng)引起氣道反應(yīng)性升高[11]。

Figure 6.The contents of IL-6 and IL-8 in the lung tissues of the mice. Mean±SD.n=8.**P<0．01vscontrol group;##P<0．01vsO3group.

圖6 各組肺組織IL-6和IL-8的含量

Figure 7.The MDA level in the lung tissues of the mice with different treatments. Mean±SD.n=8.**P<0．01vscontrol group;##P<0．01vsO3group.

圖7 各組肺組織MDA的含量

Figure 8.Determination of NF-κB p65 in the lung tissues by Western blot. Mean±SD.n=8.*P<0．05vscontrol group;#P<0．05vsO3group.

圖8 各組肺組織中NF-κB p65蛋白的表達(dá)

氧化應(yīng)激能夠促進(jìn)NF-κB p65入核，通過(guò)上調(diào)下游的環(huán)氧酶和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶，產(chǎn)生新的過(guò)氧化物，進(jìn)一步促進(jìn)NF-κB的活化[12]。NF-κB既是氧化應(yīng)激敏感性轉(zhuǎn)錄因子，也是炎癥放大過(guò)程中重要的調(diào)控節(jié)點(diǎn)。NF-κB可以促進(jìn)炎癥因子TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8等炎癥因子的表達(dá)，這些炎癥因子反過(guò)來(lái)又可以調(diào)控NF-κB的轉(zhuǎn)錄。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示O3暴露會(huì)引起小鼠氣道炎癥的同時(shí)，肺部NF-κB p65的表達(dá)水平也明顯增高，組織勻漿液中炎癥因子IL-6和IL-8含量明顯增高。

H2S在清蛋白誘導(dǎo)的哮喘中發(fā)揮抑制氣道炎癥、氣道高反應(yīng)和抗氣道重塑的作用[6]。內(nèi)源性H2S主要由胱硫醚β-合成酶和胱硫醚γ-裂解酶催化產(chǎn)生，我們發(fā)現(xiàn)O3組小鼠肺部的H2S合成酶的活性明顯降低。給予外源性H2S使O3暴露后小鼠的氣道高反應(yīng)性顯著減輕，逆轉(zhuǎn)了O3暴露導(dǎo)致的BALF中白細(xì)胞總數(shù)、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和總蛋白濃度的增加，提示H2S可以減輕O3致小鼠氣道炎癥。H2S對(duì)氣道的保護(hù)機(jī)制十分復(fù)雜，首先，H2S具有廣泛而強(qiáng)大的抗氧化效應(yīng)，不僅可以直接清除過(guò)氧化氫、超氧陰離子、過(guò)氧化亞硝酸等氧自由基，而且可以上調(diào)內(nèi)源性的抗氧化系統(tǒng)，進(jìn)而增強(qiáng)內(nèi)源性抗氧化能力，減輕脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)[13-14]。其次，H2S本身也具有抗炎作用，H2S可以調(diào)控NF-κB核轉(zhuǎn)位，抑制促炎因子的表達(dá)，減輕呼吸道合胞病毒感染后的肺部炎癥反應(yīng)[15]。我們發(fā)現(xiàn)H2S預(yù)處理明顯降低了O3暴露后肺組織MDA含量以及NF-κB p65的表達(dá)水平，提示H2S可能是通過(guò)減輕脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)和下調(diào)NF-κB p65的表達(dá)，在O3致氣道炎癥中發(fā)揮保護(hù)作用。

綜上所述，H2S在O3暴露引起的小鼠氣道炎癥中起到保護(hù)作用，有抗炎、抗氧化和降低氣道反應(yīng)性的作用，為哮喘、慢性阻塞性肺疾病等疾病治療提供了新思路，其具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步探討。

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(責(zé)任編輯： 林白霜， 羅 森)

Effect of hydrogen sulfide on airway inflammation induced by ozone in mice

ZHOU Yu-bo, FU Zhao-di, ZHOU Li-fen, CHEN Qing-zi, YANG Chun-tao, LI Jian-hua

(DepartmentofPhysiology,GuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou511436,China.E-mail:lijianh@hotmail.com)

AIM: To investigate the effect of hydrogen sulfide (H2S) on airway inflammation induced by ozone (O3) exposure and its mechanisms. METHODS: C57BL/6 mice (n=32) were randomly divided into control group, O3group, NaHS+O3group and NaHS group. The mice in O3group and O3+NaHS group were exposed to 2.14 mg/m3O3for 3 h on days 1, 3 and 5, while the mice in control group and NaHS group were exposed to filtered air. NaHS (14 μmol/kg) was administered intraperitoneally to the mice in NaHS group and O3+NaHS group 30 min before each exposure. After the last exposure for 24 h, the airway responsiveness was determined, and bronchoalveolar lavage fluid (BALF) was collected for counting inflammatory cells and measuring total protein concentration. The lung tissues were collected for observing the morphological changes with HE staining. The levels of interleukin-6 (IL-6), interleukin-8 (IL-8), malondialdehyde (MDA) and NF-κB p65 protein in the lungs were determined. RESULTS: Compared with control group, the airway responsiveness, inflammatory cells, protein concentration, inflammation score, levels of IL-6, IL-8, MDA and NF-κB p65 in O3group increased significantly, but these in NaHS+O3group decreased compared with O3group.CONCLUSION: The present findings suggest that H2S attenuates O3induced airway inflammation by inhibiting NF-κB expression and preventing lipid peroxidation.

Hydrogen sulfide; Ozone; Airway inflammation

1000- 4718(2016)10- 1837- 06

2016- 03- 11

2016- 07- 11

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 81470205)

△通訊作者 Tel: 020-37103061; E-mail: lijianh@hotmail.com

▲并列第1作者

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.10.016

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