劉若海， 王 穎， 吳文俊， 金芃芃， 余立群， 曹 紅， 李 旭△

(1溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院麻醉科， 浙江 溫州 325027； 溫州醫(yī)科大學 2仁濟學院生理學教研室， 3附屬第一醫(yī)院內分泌科， 浙江 溫州 325035)

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Caveolin-1在高鹽飲食損傷糖尿病大鼠血管中的作用*

劉若海1， 王 穎2， 吳文俊3， 金芃芃2， 余立群2， 曹 紅2， 李 旭2△

(1溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院麻醉科， 浙江 溫州 325027； 溫州醫(yī)科大學2仁濟學院生理學教研室，3附屬第一醫(yī)院內分泌科， 浙江 溫州 325035)

目的： 觀察1型糖尿病(DM)大鼠給予高鹽飲食后內皮細胞功能障礙的可能機制。方法：SD大鼠(150～180 g)60只，腹腔注射鏈唑霉素(70 mg/kg)，3 d后空腹血糖≥16.7 mmol/L為1型DM大鼠。正常大鼠和DM大鼠分別給予正常飲食和高鹽飲食(8% NaCl)6周。檢測腸系膜動脈舒張功能，Western blot技術檢測血管中Akt、內皮型一氧化氮合酶(eNOS)、caveolin-1(Cav-1)等蛋白的水平。結果：高鹽飲食DM大鼠收縮壓顯著高于DM組，其腸系膜動脈乙酰膽堿和胰島素的舒張作用顯著下降(P<0.01)。Akt、p-eNOS和NO水平均顯著低于DM組(P<0.01)，Cav-1顯著增高(P<0.01)。結論：1型糖尿病大鼠高鹽飲食血管功能障礙可能與抑制內皮細胞Akt激活及增強Cav-1表達導致的eNOS活性下降有關。

高鹽飲食； 糖尿?。?Caveolin-1； 內皮型一氧化氮合酶； 腸系膜動脈

糖尿病(diabetes mellitus,DM)合并高血壓患者與單純高血壓患者或單純的糖尿病患者相比，其心血管并發(fā)癥風險[1]和血管進行性損傷[2]顯著增加，已成為全球性的主要健康問題。因此，闡明糖尿病狀態(tài)下對高血壓易感性增加的機制是降低糖尿病患者高血壓發(fā)病率及死亡率的關鍵。流行病學研究已明確高鹽飲食會導致血壓升高并增加日后患心臟病和中風的風險，但高鹽飲食導致的內皮功能損害，使糖尿病患者更易伴發(fā)高血壓的機制仍不清楚。窖蛋白(caveolin)/脂質筏是膜特殊的微結構，是多分子信號傳遞的區(qū)域。細胞內多種信號分子是通過與窖蛋白1(caveolin-1，Cav-1)的相互作用完成信號轉導過程。有研究提示，Cav-1是連接胰島素抵抗和高血壓發(fā)病之間重要的信號分子[3]，本研究將從Cav-1和內皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)之間的相互作用探討糖尿病狀態(tài)下高鹽飲食引發(fā)高血壓的易感性及其信號機制，期望為臨床更有效治療糖尿病罹患高血壓患者提供新的實驗依據。

材 料 和 方 法

1 動物

雄性SD大鼠(150～180 g)，由溫州醫(yī)科大學實驗動物中心提供。動物生產許可證號為SCXK(浙)2015-0001。

2 主要試劑

Insulin、eNOS、p-eNOS抗體、IP試劑盒均購于CST；Cav-1抗體購于BD；β-tubulin購于南通碧云天生物技術研究所。

3 主要方法

3.1 動物模型的制備和分組 腹腔注射鏈唑霉素(streptozotocin，STZ) 70 mg/kg，3 d后空腹血糖≥16.7 mmol/L為1型糖尿病大鼠。正常大鼠給予正常飲食作為對照(control,CON)組，給予高鹽飲食為HS組；糖尿病大鼠給予正常飲食為糖尿病模型組(即DM組)，給予高鹽飲食6周，即DM+HS組。每周測血壓和空腹血糖。

3.2 腸系膜動脈環(huán)舒張功能檢測 待用的PSS緩沖液(mmol/L： NaCl 118、KCl 4.7、MgSO41.2、KH2PO41.2、NaHCO325、glucose 11和CaCl21.8)，預先放入37 ℃恒溫浴槽加熱；小血管張力測定儀PowerLab Chart System (Danish Myo Technology)浴槽中加入5 mL 預熱的PSS液，并持續(xù)通以5% CO2及95% O2的混合氣，保持水溫37 ℃；在顯微鏡下，使用2根直徑為40 μm的不銹鋼絲分別穿過血管，固定，將血管全部沒入PSS液中，平衡時間為60 min。氯化鉀溶液KPSS(mmol/L: NaCl 64.7、KCl 58.9、MgSO41.2、KH2PO41.2、NaHCO325、glucose 11和CaCl21.8)預收縮1次檢查腸系膜動脈環(huán)的活力。加入10-5mol/L的苯腎上腺素(phenylephrine，PE)預收縮，待血管收縮反應達平臺穩(wěn)定后，加入不同濃度(10-10～10-6mol/L)的乙酰膽堿(acetylcholine，ACh)或胰島素(insulin)，觀察血管的內皮依賴性舒張反應。

3.4 Western blot法檢測蛋白 提取血管總蛋白，取等量的蛋白用10%聚丙烯酰胺凝膠電泳后，轉至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉液室溫輕搖1 h，將PVDF膜分別與Ⅰ抗eNOS(1∶1 000)、p-eNOS(1∶1 000)、Cav-1(1∶1 000)和β-tubulin(1∶1 000) 4 ℃孵育過夜。HRP標記的山羊抗兔Ⅱ抗(1∶10 000)或者山羊抗小鼠Ⅱ抗(1∶10 000)(北京天德悅生物科技公司)按比例稀釋，室溫孵育PVDF膜1 h，ECL發(fā)光檢測液發(fā)光，用凝膠成像系統檢測相對表達強度。

4 統計學處理

實驗數據均以均數±標準差(mean±SD)表示，采用GraphPad Prism 5.0 統計程序進行統計學分析。多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，各組均數間兩兩比較采用Bonferroni校正的t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 高鹽飲食6周后收縮壓和舒張壓

飲食6周后測各組的血壓，DM+HS組血壓明顯升高，SBP和DBP顯著高于CON組和DM組(P<0.01)，見表1。結果提示高鹽飲食可引起血壓增高，在糖尿病的基礎上高鹽飲食，可促進高血壓的進一步發(fā)展。

表1 高糖高鹽對大鼠收縮壓和舒張壓的影響

Table 1.Systolic blood pressure (SBP) and diastolic blood pressure (DBP) in rats (mmHg. Mean±SD.n=8)

GroupSBPDBPCON112±887±9DM99±1079±9HS157±13??##119±7??##DM+HS169±12??##126±13??##

**P<0.01vsCON;##P<0.01vsDM.

2 外周阻力血管收縮舒張功能

6周時，DM組和HS組ACh和胰島素引起的內皮依賴性舒張作用進一步降低，硝普鈉(sodium nitroprusside，SNP)的血管舒張作用仍未見明顯下降，表明高血糖和高鹽飲食都損傷血管內皮細胞，導致血管舒張能力下降。但DM+HS組ACh和胰島素引起的內皮依賴性舒張作用進一步減退(P<0.01)，而且SNP對血管的直接舒張作用也明顯低于其它組(P<0.01)，提示糖尿病加高鹽飲食不僅損害了血管內皮細胞，而且還損傷到血管平滑肌的舒張功能，見圖1。

Figure 1.Impairment of ACh-induced, insulin-induced, and SNP-induced vasodilatation in small mesenteric arteries. Mean±SD.n=8.**P<0.01vsCON;#P<0.05，##P<0.01vsDM;$P<0.05vsHS.

圖1 高糖高鹽對乙酰膽堿、胰島素和SNP誘導腸系膜動脈環(huán)舒張功能的影響

3 主動脈管壁形態(tài)學的變化

高鹽飲食6周主動脈的HE染色。DM和DM+HS組的主動脈管壁厚度(內膜+中膜)顯著低于CON組(P<0.01)，也顯著低于HS組(P<0.01)，而DM+HS組腸系膜動脈的厚度顯著低于其它組。DM+HS組的主動脈中膜血管平滑肌排列紊亂，中層平滑肌增生異常，內膜破壞相對嚴重。該結果顯示糖尿病狀態(tài)下HS不僅損傷血管內膜，也導致血管平滑肌形態(tài)上發(fā)生損傷，對腸系膜動脈的損傷要比主動脈的的損傷更為顯著，見圖2。

Figure 2.Representative images of hematoxylin-eosin (HE) staining of aorta at 6 weeks. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsCON;##P<0.01vsDM.

圖2 HE染色觀察主動脈管壁的形態(tài)學變化

4 血漿NO水平的變化

為觀察糖尿病大鼠高鹽飲食后血管內皮功能受損是否與NO的產生增多或者破壞增多有關，我們檢測了血漿NOX的濃度。高鹽飲食6周，DM組和HS組的NO水平與對照組比較均下降(P<0.01)；DM+HS組的NO水平與對照組比較下降更明顯(P<0.01)，也明顯低于HS組和DM組(P<0.05)。這提示糖尿病高鹽飲食后，血管舒張能力急劇下降與NO生成減少密切相關。

5 高鹽飲食信號機制蛋白水平的研究

6周時，DM組和HS組的p-eNOS均顯著降低，Cav-1均升高。但是DM+HS組p-Akt和p-eNOS最低，Cav-1最高，提示高血糖和高鹽飲食均損害了Akt/eNOS/NO通路從而加劇內皮舒張功能障礙。而DM+HS組p-eNOS水平要比HS組低，提示Akt活性的改變并不是導致eNOS活性下降的唯一原因，需要進一步研究Cav-1在血管舒張功能的作用，見圖3。

Figure 3.The protein levels of vascular Cav-1, eNOS, p-eNOS, Akt and p-Akt at 6 weeks determined by Western blot analysis. Mean±SD.n=5.*P<0.05，**P<0.01vsCON;#P<0.05,##P<0.01vsDM;$$P<0.01vsHS.

圖3 Western blot法檢測Cav-1、eNOS、p-eNOS、Akt和p-Akt的蛋白水平

討 論

血壓受到神經、激素的調節(jié)和血管、腎臟等相互的作用。高鹽飲食、血管炎癥、氧化應激等可導致血管功能障礙[4]。臨床研究顯示高血糖癥導致血管內皮進行性損害是高血壓發(fā)生發(fā)展的主要危險因素，也是血管功能障礙的第一步[5]。ACh可通過激活內皮毒蕈堿樣受體作用于血管舒張因子NO，從而舒張血管，本實驗發(fā)現，DM組和HS組腸系膜動脈對ACh的舒張反應減弱，而DM+HS組腸系膜動脈對ACh的舒張反應比前2組更弱，表明糖尿病加高鹽飲食對血管內皮損傷更為嚴重。高鹽飲食促進胰島素信號傳導并引起胰島素抵抗[6]。我們實驗組以前的研究顯示幼年自發(fā)性高血壓大鼠具有胰島素抵抗，內皮依賴的胰島素血管舒張作用下降[7]。本實驗研究顯示在高血糖癥時增加鹽的攝入量會降低血管內皮細胞對ACh和胰島素刺激的舒張作用，腸系膜動脈對SNP的舒張反應下降表明損傷了平滑肌細胞對NO的反應。鹽敏感性高血壓大鼠損傷了胰島素引起的舒張作用和Akt/eNOS磷酸化，降低了胰島素的敏感性[8]。

DM+HS組大鼠的腸系膜動脈胰島素內皮依賴的血管舒張作用明顯低于其它組，這與以往的研究一致。DM+HS組腸系膜動脈對SNP的舒張作用明顯低于其它組，并觀察到血管壁的厚度變薄，血管平滑肌排列紊亂、增生異常導致平滑肌細胞受損，可能導致血管對NO的反應下降。有文獻報道，敲除Cav-1可能會導致血管舒張和增加血管壁的紊亂，引起血管重塑[9]。因此，從實驗的血管形態(tài)學顯示糖尿病伴高鹽飲食比單獨糖尿病組和單獨高鹽飲食組的血管內皮和平滑肌損害更為嚴重，高鹽飲食加劇了糖尿病組的內皮依賴和非內皮依賴的血管舒張功能障礙并促進高血壓的發(fā)生發(fā)展。

大量的研究認為Akt/eNOS通路在胰島素信號轉導中起非常重要的作用。有研究顯示糖尿病相關的血管內皮功能障礙與內皮細胞的胰島素信號Akt/eNOS減弱有關[10-11]。高血壓鹽敏感性大鼠也顯示胰島素誘導的血管舒張損害和Akt/eNOS磷酸化的減弱[8]。然而在糖尿病伴高鹽飲食中，對eNOS磷酸化水平的影響很少有研究。本實驗的結果顯示DM+HS組的Akt/eNOS磷酸化水平下降，NO生成減少，提示高鹽飲食可能是損害了Akt/eNOS/NO通路從而加劇內皮功能的障礙。在鹽敏感大鼠給予高鹽飲食時發(fā)現血漿NO水平顯著下降，而內皮eNOS表達也顯著下降[4]。而DM+HS組p-eNOS水平要比HS組低，提示Akt活性的改變并不是導致eNOS活性下降的唯一原因。

在人體和動物的研究中，Cav-1已被認為與血管疾病有著密切關系。有研究顯示糖尿病小鼠[12]和高鹽飲食大鼠[13]中Cav-1的mRNA及蛋白表達水平升高和內皮依賴的舒張程度顯著下降都與eNOS的活性下降有關。eNOS/Cav-1相互作用可能是心血管疾病發(fā)生發(fā)展的重要機制。eNOS激活過程是eNOS首先與Cav-1分開，從細胞膜小窩脫落，才能進一步被激活[14]。eNOS的Ser1177殘基位的磷酸化被認為是eNOS激活的最主要機制[15]。很多機制解釋Cav-1減少引起了肺、血管、心功能異常，而給予NOS的抑制劑則有所改善[16-17]。在Cav-1缺失小鼠伴eNOS缺失小鼠的實驗中提示了心血管疾病與eNOS功能失調有關[18]。在尿糖濃度達到500～1 000 mg/dL時，對eNOS具有抑制作用的Cav-1 表達顯著增加。糖尿病導致的氧化應激上調Cav-1，但有些研究顯示糖尿病患者呈現每批細胞的小窩數量的減少，可能是由于外源性的ONOO-減少了窖蛋白的數量[19]。有實驗發(fā)現糖尿病大鼠給予高鹽飲食后血漿的NO水平和eNOS表達顯著下降[4]?；贑av-1和eNOS之間的密切關系，我們的實驗發(fā)現糖尿病大鼠給予高鹽飲食后胰島素信號通路Akt-eNOS的活性降低，Cav-1表達增強。Cav-1-/-小鼠給予高鹽飲食引起血管的收縮性下降，舒張作用增加，eNOS的表達和活性均增加[20]。這些結果均顯示eNOS與Cav-1之間的關系非常密切，認為Cav-1可能通過調控eNOS的活性，在血管舒張功能上起著重要的調節(jié)作用。

綜上所述，本研究證實在糖尿病的基礎上給予高鹽飲食可降低NO生成，嚴重破壞外周阻力血管的舒張功能。糖尿病合并高鹽膳食導致的血管損傷程度比單純的高鹽飲食或單純的糖尿病造成的血管損傷更為嚴重。在糖尿病通路Akt-eNOS活性減弱破壞血管內皮的基礎上，高鹽飲食不僅減弱eNOS的表達，還增強了Cav-1的表達，使eNOS磷酸化水平進一步降低，使NO表達下降，從而協同加重高血壓的發(fā)生和發(fā)展。本研究提示，在激活胰島素-Akt-eNOS信號的同時，適度抑制Cav-1的表達可能會阻斷胰島素抵抗和高血壓發(fā)生發(fā)展之間的關鍵信號分子，降低糖尿病患者的血管損傷。

由于本研究僅觀察了高鹽飲食對糖尿病大鼠的血管功能的影響，并無闡明Cav-1和eNOS這2種蛋白之間如何相互作用，因此需要進一步的研究。

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(責任編輯： 盧 萍， 羅 森)

Fractalkine受體缺陷可削弱小膠質細胞和神經元對慢性應激的反應性

慢性應激是與抑郁癥高度相關的觸發(fā)因素之一。一般認為，小膠質細胞對應激乃至環(huán)境刺激具有高度反應性。然而，關于這些腦免疫細胞介導應激反應的作用機制尚不清楚。Fractalkine信號通路由趨化因子CX3CL1(主要由神經元表達)及其受體CX3CR1(幾乎只存在于健康腦的小膠質細胞)組成，已被發(fā)現對小膠質細胞活性的調節(jié)極為重要。Milior等主要研究敲除CX3CR1基因以干擾小膠質細胞功能是否影響腦對慢性應激的反應。為此，他們以CX3CR1基因敲除和野生型成年小鼠為研究對象，分為對照組和壓力環(huán)境組，歷時2周，對小膠質細胞表型、突觸間相互作用、突觸傳遞、動物行為學反應及皮質酮水平等進行了檢測。結果表明，通過CX3CR1-CX3CL1途徑阻礙神經元-小膠質細胞之間的信息傳遞，可阻止慢性不可預測應激對小膠質細胞功能、短期和長期的神經元可塑性以及抑郁樣行為的影響?？傮w而言，該研究表明小膠質細胞調節(jié)機制可能是應激易感性差異的基礎，因而這種易感性可以通過經歷應激事件如抑郁癥而觸發(fā)疾病。

Brain Behav Immun, 2016, 55:114-125(范沖竹)

Effect of caveolin-1 expression on high-salt diet-induced endothelial dysfunction in type 1 diabetic rats

LIU Ruo-hai1, WANG Ying2, WU Wen-jun3, JIN Peng-peng2, YU Li-qun2, CAO Hong2, LI Xu2

(1DepartmentofAnesthesiology,TheSecondAffiliatedHospitalofWenzhouMedicalUniversity,Wenzhou325027,China;2DepartmentofPhysiology,RenjiCollege,3DepartmentofEndocrinology,TheFirstAffiliatedHospital,WenzhouMedicalUniversity,Wenzhou325035,China.E-mail:lixu0577@126.com)

AIM: To investigate the underlying mechanisms responsible for endothelial dysfunction of type 1 diabetes mellitus (DM) rats fed with high-salt diet. METHODS: Type 1 DM was induced by intraperitoneal injection of streptozotocin (70 mg/kg). Normal and diabetic rats were fed high-salt food (HS, 8% NaCl) and standard food for 6 weeks， respectively. Isometric tension of the mesenteric arteries were measured. The expression of Akt, endothelial nitric oxide synthase (eNOS) and caveolin-1 (Cav-1) was examined by Western blot. RESULTS: The rats in DM+HS group exhibited more pronounced impairment of vasorelaxation to acetylcholine and insulin compared with either DM group or HS group (P<0.01). Akt and eNOS phosphorylation levels， and nitric oxide (NO) concentration in DM+HS group were significantly lower than those in DM group (P<0.01). The level of Cav-1 in DM+HS group was significantly higher than that in DM group and HS group. CONCLUSION: Impaired endothelial Akt activation, increased Cav-1 expression and resultant decreased eNOS activation contribute to aggravate high-salt diet-induced endothelial dysfunction and hypertension in DM rats.

High-salt diet; Diabetes mellitus; Caveolin-1; Endothelial nitric oxide synthase; Mesenteric arteries

1000- 4718(2016)10- 1757- 06

2016- 03- 02

2016- 08- 01

浙江省教育廳一般科研項目(No. Y201431185)

△通訊作者 Tel: 0577-86689769; E-mail： lixu0577@126.com

R363; R587.1

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.10.005

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