曾 紅

（貴州省動物疫病預(yù)防控制中心，貴州貴阡 550000）

孵化場微生物學(xué)檢測的方法及其標(biāo)準(zhǔn)的探索

曾 紅

（貴州省動物疫病預(yù)防控制中心，貴州貴阡 550000）

1種蛋表面微生物學(xué)檢測

1.1 檢測材料

被測種蛋與胚蛋，普通瓊脂培養(yǎng)基、滅菌的蒸餾水、滅菌的試管、刻度吸管和棉簽、鐵絲規(guī)板（D為3.5cm）。

1.2 檢測方法（棉簽拭抹法）

（1）將被測的種蛋或胚蛋夾在特制的規(guī)板內(nèi)，種蛋大頭朝上。每批種蛋至少檢測20枚，分別按部門分棟號采樣。

（2）將裝有10ml無菌的蒸餾水浸濕無菌的棉簽，在試管壁上擠去多余的滅菌蒸餾水，然后在規(guī)板范圍內(nèi)滾動棉簽涂抹蛋殼表面取樣。

（3）折斷棉簽的手持端，使棉簽落入蒸餾水試管中，塞緊試管塞，帶回獸醫(yī)室檢測。

（4）若檢測種蛋消毒后的效果，可在蒸餾水中加入適量的滅菌中和劑。

（5）反復(fù)上下?lián)u動采樣的試管，充分洗下棉簽上的細(xì)菌。

（6）可根據(jù)平時檢測種蛋表面菌數(shù)的多少，將已取樣的試管液作遞減稀釋并記下菌液的稀釋倍數(shù)。

（7）用滅菌的刻度吸管吸取0.5或1ml細(xì)菌懸液，放入裝有10～15ml熔化并滅菌冷卻到45～50℃的普通瓊脂平皿內(nèi)充分混合。

（8）待瓊脂凝固后，置37℃恒溫箱中培養(yǎng)24～48h，計數(shù)平板上的菌落數(shù)。根據(jù)平板上的菌落數(shù)和菌液的稀釋倍數(shù)，計算出取樣范圍內(nèi)的細(xì)菌總數(shù)。

1.3 種蛋微生物學(xué)檢測標(biāo)準(zhǔn)

表1 種蛋表面微生物學(xué)檢測標(biāo)準(zhǔn)規(guī)板（D為3.5cm）

2 孵化器、孵化室、出雛器、出雛場地和運輸車空氣微生物學(xué)檢測

2.1 檢測用的培養(yǎng)基

5%乳糖瓊脂培養(yǎng)基。

2.2 檢測方法采用四級分類平板空氣暴露法。5%乳糖瓊脂培養(yǎng)基數(shù)個，開蓋后均勻放在檢測房的水平地面上；平板在被測房間的地面內(nèi)空氣暴露3min，蓋上平板，回收平板；將平板置37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，計算平板上的菌落數(shù)。要求每間房取樣2～5個，求其平均菌落數(shù)。

2.3 各個空間空氣微生物學(xué)檢測標(biāo)準(zhǔn)

表2 四級分類平板空氣暴露法（空氣暴露3 min）

3 出雛器微生物學(xué)檢測

3.1 檢測用培養(yǎng)基

胰蛋白酶瓊脂培養(yǎng)基；麥康凱瓊脂培養(yǎng)基；高鹽甘露醇瓊脂培養(yǎng)基；沙保葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基。

3.2 檢測方法

采取絨毛檢測法。

在出雛過程中，無菌地采集絨毛置于無菌的容器中，帶回獸醫(yī)室檢驗。用滅菌的濾紙稱取0.25g絨毛放入100ml無菌的蒸餾水，充分搖動，使絨毛潮濕不要粘到三角瓶壁上，使混合物靜置30min。利用無菌操作技術(shù)，分別吸取0.1ml，1.0ml，0.1ml，1.0ml，按表3安排，分別加入到已溶化并冷卻到45℃～47℃的4種培養(yǎng)基，充分混合后，傾入滅菌的平皿內(nèi)。待瓊脂凝固后，除沙保葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基外，均置37℃恒溫箱中培養(yǎng)24h，待細(xì)菌長出后，計數(shù)平板上的菌落數(shù)。每臺出雛器，至少測定2份絨毛樣品，一般抽測2～3臺。

3.3 出雛器內(nèi)絨毛微生物學(xué)檢測標(biāo)準(zhǔn)

表3 出雛器絨毛微生物學(xué)檢測標(biāo)準(zhǔn)（菌數(shù)/克絨毛）

4 物體表面微生物學(xué)檢測

4.1 檢測材料普通瓊脂培養(yǎng)基、滅菌棉簽和刻度吸管、帶有滅菌蒸餾水的試管；滅菌規(guī)板：3.6cm×3.6cm；被檢測物品：墻壁、地面、門窗、設(shè)備、出雛器、孵化器、蛋托、蛋車、出雛盒、臺架、輸送帶、出雛車。

4.2 檢測方法

將規(guī)板滅菌后扣在被測物體的表面。在裝有10ml無菌蒸餾水的試管中浸濕無菌的棉簽，在試管壁上壓擠多余的蒸餾水，然后在規(guī)板范圍內(nèi)滾動棉簽涂抹取樣。折去棉簽手持端，使棉簽落入蒸餾水試管內(nèi)，塞緊試管塞，帶回獸醫(yī)室檢驗。若檢測剛剛消毒過的物體表面，可在蒸餾水中加入適量無菌的中和劑。反復(fù)上下?lián)u動已采樣的試管，充分洗下棉簽內(nèi)的細(xì)菌。根據(jù)平時檢測孵化設(shè)備表面菌數(shù)的多少，可將已取樣的試管液做遞減稀釋，并記下其菌液的稀釋倍數(shù)。用滅菌的刻度吸管吸取0.5～1ml細(xì)菌懸液，放入裝有10～15ml熔化并滅菌冷卻到45℃～50℃的普通瓊脂平皿內(nèi)充分混合。待瓊脂凝固后置37℃恒溫箱中培養(yǎng)24～48h，計算平板上的菌落數(shù)。根據(jù)平板上的菌落數(shù)和菌液的稀釋倍數(shù)計算出取樣范圍內(nèi)的細(xì)菌總數(shù)。

為了有代表性，每個房間采樣不能少于5個，然后求出每個規(guī)板內(nèi)細(xì)菌總數(shù)，最后求出菌落個數(shù)/平方厘米。

4.3 孵化廳內(nèi)物體表面微生物學(xué)檢測標(biāo)準(zhǔn)

表4 物體表面微生物學(xué)檢測標(biāo)準(zhǔn)（菌數(shù)/cm2）

5 運輸車輛表面微生物檢測

5.1 檢測材料

普通瓊脂培養(yǎng)基、滅菌棉簽和刻度吸管、帶有滅菌蒸餾水的試管；滅菌規(guī)板：3.6cm×3.6cm；被檢測物品：種蛋車和送雛車的內(nèi)外壁、地面、棉被。

5.2 檢測方法

將規(guī)板滅菌后扣在被測物體的表面。在裝有10ml無菌蒸餾水的試管中浸濕無菌的棉簽，在試管壁上壓擠多余的蒸餾水，然后在規(guī)板范圍內(nèi)滾動棉簽涂抹取樣。折去棉簽手持端，使棉簽落入蒸餾水試管內(nèi)，塞緊試管塞，帶回獸醫(yī)室檢驗。若檢測剛剛消毒過的物體表面，可在蒸餾水中加入適量無菌的中和劑，反復(fù)上下?lián)u動已采樣的試管（80次），充分洗下棉簽內(nèi)的細(xì)菌。用滅菌的刻度吸管吸取0.5～1ml細(xì)菌懸液，放入裝有10～15ml熔化并滅菌的45℃～50℃的普通瓊脂平皿內(nèi)充分混合。待瓊脂凝固后置37℃恒溫箱中培養(yǎng)24～48h，計算平板上的菌落數(shù)。

為了有代表性，每個車輛采樣不能少于5個，然后求出每個規(guī)板內(nèi)細(xì)菌總數(shù)，最后求出菌落個數(shù)/平方厘米。

5.3 車輛內(nèi)物體表面微生物學(xué)檢測標(biāo)準(zhǔn)

表5 車輛表面微生物學(xué)檢測標(biāo)準(zhǔn)（菌數(shù)/ cm2）

6 消毒液微生物學(xué)檢測

6.1 檢測材料

普通瓊脂培養(yǎng)基、滅菌刻度吸管、帶有滅菌蒸餾水的試管、中和劑（鹽酸、吐溫80）；被檢測物品：消毒池內(nèi)的消毒液。

6.2 采樣地點

門口消毒池、蛋庫消毒盆。

6.3 方法

每個檢測對象至少取3樣品。無菌取使用過的消毒液1ml加到9ml加有滅菌中和劑的蒸餾水中，混勻。用滅菌的刻度吸管吸取1毫升混合液，放入裝有10～15ml熔化并滅菌冷卻到45℃～50℃的普通瓊脂平皿內(nèi)充分混合。待瓊脂凝固后置37℃恒溫箱中培養(yǎng)24～48h，計算平板上的菌落數(shù)。取其平均菌落數(shù)。

6.4 標(biāo)準(zhǔn)

消毒液中菌落總數(shù)≤250個/ml，消毒液可以繼續(xù)使用；消毒液中菌落總數(shù)＞250個/ml，消毒液不可使用，必須更換藥液。

7 現(xiàn)場消毒試驗效果檢測

7.1 試驗檢測材料

（1）采樣地點：地面、墻壁，空氣，消毒環(huán)境溫度21℃～25℃。

（2）被測的消毒劑：使用自來水配制所需要的濃度。

（3）消毒工具：噴霧器，采樣規(guī)板10*10cm2。（4）含有中和劑的滅菌水溶液，滅菌棉簽、普通瓊脂（融化、滅菌）。

7.2 試驗檢測方法

消毒前先將消毒的物品和場地徹底清掃、沖洗干凈并干燥。用5點采樣法，地面5點，空氣5點，即中心和4個角落各選1個點；墻壁采用4點法，即四周各采1點；用已滅菌的棉簽蘸取含有中和劑的水溶液，在采樣規(guī)板范圍內(nèi)滾動1次后，剪斷棉簽的手持端，使其落入含有中和劑水溶液試管中（5ml/管）；空氣采用3min暴露法。使用被試驗的消毒液，對消毒地點進(jìn)行噴灑消毒。消毒后1小時，以同樣的方法在消毒場所再次取樣1次，兩次取樣點要靠近，但不可重復(fù)。將樣品帶回實驗室，利用提拉或吹打的方法，沖洗棉簽上的細(xì)菌。吸出菌懸液1ml，用滅菌蒸餾水以10倍稀釋法將其稀釋至10-3。

消毒前后的樣品：從每個稀釋后的樣品中各取3ml，分別放在3個滅菌的平皿內(nèi)，每個平皿1ml（即每個稀釋度使用三個平皿），然后每個平皿內(nèi)倒入融化滅菌并冷卻至45～50℃的營養(yǎng)瓊脂15～18ml，充分混勻，待瓊脂凝固后，置37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24小時。觀察細(xì)菌生長情況，進(jìn)行菌落計數(shù)，根據(jù)樣品的稀釋度換算出每一個測試點的菌落數(shù)。

7.3 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)

該消毒劑在現(xiàn)場消毒1h后滅菌率達(dá)到90.0%以上，故消毒劑是一種良好的消毒劑，可以投入生產(chǎn)使用，否則，此種消毒劑滅菌效果不佳，則尋找此種藥物在5分鐘內(nèi)殺滅本場內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)菌株滅菌率達(dá)到99.9%的最低有效濃度.

8 孵化場的微生物學(xué)檢測的計劃和基本要求

（1）凡是從生產(chǎn)部門運來的入孵前種蛋和孵化器的胚蛋，每枚種蛋規(guī)板內(nèi)的菌數(shù)不應(yīng)超過120個，即達(dá)到良級標(biāo)準(zhǔn)，入孵前的種蛋（已熏蒸）不應(yīng)超過60個/規(guī)板。

（2）空氣檢測，平時檢測不應(yīng)超過20個/平板（暴露3min），即達(dá)到良好標(biāo)準(zhǔn)。

（3）所有物體表面的菌數(shù)應(yīng)低于20個菌落/cm2，即達(dá)到良級標(biāo)準(zhǔn)。

（4）檢測計劃：

①每個廳（20臺）的孵化室每月至少抽測1次，孵化器抽測2臺以上，一般兩次/月為宜。

②每一個種雞生產(chǎn)部門運送來的種蛋，每個月至少抽測兩次，每次抽測4個棟號，10枚/棟。

③每個廳的出雛室和出雛場地，每一個月至少檢測兩次。

④檢測入孵前種蛋熏蒸效果和洗盤消毒效果，每個月每個廳抽測2～3次。

⑤運雛車輛每周抽測1次，2輛/次；種蛋車按種雞生產(chǎn)場檢測，2次/月，2輛/次；

⑥消毒藥液微生物檢測：每周檢測一次，藥液菌數(shù)必須達(dá)到250個以下；

⑦消毒藥品消毒效果檢測：每購入新的批號消毒藥品必須測定該種藥物30min殺滅本場內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)菌株滅菌率達(dá)到99.9%的最低有效濃度，然后用此濃度進(jìn)行現(xiàn)場消毒試驗，消毒1h后滅菌率必須達(dá)到90.0%以上。

總之，對孵化場環(huán)境、種蛋、運輸車輛和消毒藥物滅菌效果進(jìn)行定期檢測，可以隨時了解孵化場病原微生物的種類和數(shù)量，以及每種消毒藥物現(xiàn)場消毒效果，可以有目的選擇消毒藥的種類和最低有效消毒濃度，做到有的放矢，從而減少不必要的消毒藥物浪費，降低有害病原微生物對孵化場環(huán)境和雛雞的影響，為全力打造4A雛雞品質(zhì)奠定良好的基礎(chǔ)。