李元新 劉來利 王必成 馮玲霞 張鵬岳

（甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所，甘肅平?jīng)?744000）

牛羊肉毒梭菌（C型）滅活苗的保存期試驗

李元新 劉來利 王必成 馮玲霞 張鵬岳

（甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所，甘肅平?jīng)?744000）

對研制的牛羊肉毒梭菌（C型）滅活苗二批分別置于0℃-4℃冰箱或室溫（15℃）條件下，存放，每年用小白鼠進(jìn)行效力試驗，觀察疫苗保存期。結(jié)果表明疫苗置于0℃-4℃冰箱或室溫（15℃）條件下，3年仍可達(dá)滅活苗的效價，保存期暫定為3年。

牛 羊 肉毒梭菌（C型） 滅活苗

肉毒梭菌是一種革蘭陽性厭氧芽孢梭菌，其產(chǎn)生的肉毒毒素能引起人畜嚴(yán)重的中毒癥狀，甚至導(dǎo)致死亡，病死率高達(dá)79.53%。目前控制肉毒棱菌中毒癥的有效手段就是預(yù)防接種疫苗，為此研制出用于預(yù)防C型肉毒梭菌中毒癥滅活疫苗，為使疫苗在生產(chǎn)中起到良好效果，避免免疫失敗，給養(yǎng)殖業(yè)造成損失。對保存于不同環(huán)境和時間下的疫苗進(jìn)行效力測定，確定不同環(huán)境和時間的疫苗保存期。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 種毒 制造與檢驗用的菌種為C型肉毒梭菌菌株，系1965年從甘肅省瓜州縣黃牛體內(nèi)分離，經(jīng)中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所鑒定為C型肉毒梭菌菌株。

1.1.2 菌種標(biāo)準(zhǔn) 本菌為革蘭氏陽性粗大桿菌，產(chǎn)生偏端芽孢，為嚴(yán)格的厭氧菌，在新鮮生肝塊的厭氣肉肝湯或肉肝胃酶消化湯培養(yǎng)5～7日，培養(yǎng)液毒力不應(yīng)低于50000MLD/ml（14～16 g的小白鼠靜脈注射）。

1.1.3 試驗動物 小白鼠，體重16～20g。

1.1.4 生產(chǎn)和檢驗用培養(yǎng)基 魚（或）肉胃酶消化肉肝湯、硫乙醇酸鹽（TG）、酪胨瓊脂（GA）和葡萄糖蛋白胨湯（GP）培養(yǎng)基，普通瓊脂斜面、厭氣肉肝湯、保蒲氏胰酶消化半固體培養(yǎng)基。

1.1.5 佐劑 氫氧化鋁膠，購自甘肅省生物藥廠。

1.2 方法

1.2.1 生產(chǎn)用種子制備

（1）一級種子繁殖及鑒定。將菌種接于厭氣肉肝湯或肉肝胃酶消化半固體（含0.05%瓊脂，0.5%明膠）培養(yǎng)基中，于37℃培養(yǎng)3日后，測毒及涂片鏡檢，應(yīng)純粹并用普通瓊脂斜面、厭氣肉肝湯及普通肉湯各2管，每管接種0.2mL，培養(yǎng)3～5日，應(yīng)純粹，即作為一級種子管，在2℃～8℃保存，使用期不超過15日。

（2）二級種子繁殖。將一級種子1～2株，接種于培養(yǎng)中，置37℃培養(yǎng)3～5日，抽樣做純檢，應(yīng)純粹，在2℃～8℃保存，應(yīng)用期應(yīng)不超過5日。

1.2.2 制苗用菌液制備

（1）用玻璃培養(yǎng)瓶培養(yǎng)。按容量裝入80%左右的培養(yǎng)基，用玻璃瓶培養(yǎng)時加入1/10肝塊，而按5∶1加入氫氧化鋁膠，混合后，118℃滅菌60min，玻璃瓶冷至37℃左右，按培養(yǎng)基總量的1%～2%接入種子，同時加入滅菌的葡萄糖溶液，使其最終含量為0.5%，30℃～35℃靜止培養(yǎng)5～7日，培養(yǎng)基如經(jīng)存放，在接種前應(yīng)煮沸驅(qū)氧，冷至37℃左右立即接種。

（2）毒素測定。每批抽樣測定毒素。用體重14～16 g的小白鼠靜脈注射，每1mL不應(yīng)低于50000MLD。采用小白鼠腹腔注射測毒，劑量為0.5ml/只，毒素稀釋液采用0.2%明膠磷酸鹽緩沖液（pH為6.8）。采用10倍梯度稀釋。

（3）滅活脫毒。按菌液量0.8%加入甲醛溶液，并按0.01%加入硫柳汞；在37℃脫毒10日，每日搖瓶2次。

（4）滅活檢驗。每瓶取樣接種普通瓊脂斜面、普通肉湯、加新鮮生肝塊的厭氣肉肝湯，或加0.05%瓊脂、0.05%明膠的半固體培養(yǎng)基各1管每管接種菌液0.2ml，在37℃培養(yǎng)5～10日，應(yīng)無菌生長。

（5）脫毒檢驗。在無菌檢驗同時，離心取上清液，靜脈注射體重16～20g小白鼠2只，每只0.4ml，觀察5日，不應(yīng)死亡。如有小白鼠死亡，應(yīng)繼續(xù)脫毒。

1.2.3 配苗

滅活檢驗合格后，玻璃培養(yǎng)的濾出肝塊，按菌液5份加鋁膠1份的比例加入無菌氫氧化鋁膠，用8%氫氧化鈉調(diào)節(jié)至pH7.0 ±0.2，充分搖勻。

（1）半成品檢驗。配苗完成后，取樣做無菌檢驗。做厭氧性、需氧性細(xì)菌檢驗及霉菌及腐生菌檢驗（葡萄糖蛋白胨湯培養(yǎng)基G.P），滅菌效果檢驗（保蒲氏胰酶消化液半固體培養(yǎng)基），應(yīng)無菌生長。

（2）分裝。經(jīng)無菌檢驗合格后，進(jìn)行定量分裝，分裝時應(yīng)隨時攪拌，使其混合均勻。2℃～15℃保冷暗處存。

（3）牛羊肉毒棱菌（C型）滅活苗保存期測定方法。二批苗置于0℃～4℃冰箱或室溫（15℃）條件下，存放3y，每年用小白鼠通過血清中和試驗進(jìn)行效力檢驗，觀察3～5d，確定疫苗保存期。

2 結(jié)果

表 牛羊肉毒棱菌（C型）滅活苗保存期試驗結(jié)果

由上表可見，牛羊肉毒棱菌（C型）滅活苗保存于0-4℃冰箱或室溫（15℃），分別在保存1y，2y，3y后，用小白鼠進(jìn)行血清中和試驗，結(jié)果均合格。因此可以確定牛羊肉毒棱菌（C型）滅活苗保存期為3y，即3y仍可達(dá)到疫苗的使用效價。

［1］張振興.姜平平.實用獸醫(yī)生物制品技術(shù)［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1996.

甘肅省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究與應(yīng)用開發(fā)項目，項目編號：GNSW-2012-15

李元新（1971-），男，甘肅平?jīng)鋈耍F醫(yī)碩士，副研究員，主要從事動物疫病防治與疫苗開發(fā)研究工作。