張 艷，周慶民，徐 馨，馮萬宇，黃 健，王靚靚，寧秀云

（1.黑龍江省獸醫(yī)科學(xué)研究所，齊齊哈爾 161006；2.黑龍江省大慶市畜牧獸醫(yī)局，大慶 163000；3.黑龍江省訥河市動物防疫站，齊齊哈爾 161300）

黃芪莖葉藥物成分及營養(yǎng)成分測定

張 艷1，周慶民1，徐 馨1，馮萬宇1，黃 健1，王靚靚2，寧秀云3

（1.黑龍江省獸醫(yī)科學(xué)研究所，齊齊哈爾 161006；2.黑龍江省大慶市畜牧獸醫(yī)局，大慶 163000；3.黑龍江省訥河市動物防疫站，齊齊哈爾 161300）

黃芪藥用至今已有2 000多年的歷史，具有補氣固表、托毒排膿、利尿、生肌的功效。傳統(tǒng)黃芪應(yīng)用只重視其根部的藥用價值，其莖葉部分視為廢物，十分可惜。為了充分利用黃芪資源，對黃芪莖葉的藥物成分及營養(yǎng)成分進行測定。結(jié)果顯示：黃芪莖葉中含有多量皂苷、多糖、黃酮、營養(yǎng)物質(zhì)及微量元素，有些成分甚至高于根部。表明黃芪莖葉不但具有藥物與營養(yǎng)的雙重價值，而且還具有資源豐富、價格低廉、無藥物殘留等優(yōu)勢，將其作為飼料飼喂動物，可起到預(yù)防保健的功效。

黃芪莖葉；有效成分；營養(yǎng)成分；微量元素

黃芪作為我國的傳統(tǒng)中藥，首次記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》［1］，活性成分主要有皂苷類［2］、多糖類［3］、黃酮類［4］。黃芪莖葉是黃芪的地上部分，以往黃芪成熟后作為藥用的主要是地下根部，而其莖葉含有效成分較少，不能入藥，在采挖后被棄掉。為了充分利用黃芪資源，筆者等對黃芪莖葉中的藥物成分及營養(yǎng)成分進行測定，以期作為飼料飼喂動物，并預(yù)防某些疾病的發(fā)生。

1 材料與方法

1.1 藥材

黑龍江產(chǎn)黃芪莖葉，晾干，陰涼處保存。

1.2 主要試劑

黃芪甲苷、葡萄糖和蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品購自中國食品藥品檢定研究院；其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.3 黃芪莖葉中有效成分含量測定

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備 取黃芪甲苷標(biāo)準(zhǔn)品2.05 mg，甲醇定容至于10 mL量瓶中，即得黃芪甲苷標(biāo)準(zhǔn)液（含黃芪甲苷 0.205 mg/mL）；取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品25 mg，蒸餾水定容至50 mL搖勻，即得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液（含葡萄糖0.500 mg/mL）；精確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10.0 mg，95%乙醇定容于25 mL的容量瓶中，即得蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液（含蘆丁0.400 mg/mL）。

1.3.2 黃芪莖葉中總皂苷含量測定［5］

1.3.2.1 總皂苷的提取與鑒定 取黃芪莖葉，于60℃低溫烘干，粉碎后稱取5 g，以20倍量的70%乙醇對其進行回流提取2.5 h，后對乙醇進行濃縮，加入等量水，冰鎮(zhèn)后過濾，回收乙醇，水飽和乙酸乙酯萃取3次（20∶15∶10），過濾水層，用水飽和正丁醇萃取3次（20∶15∶10），減壓回收正丁醇層，過D101樹脂柱，蒸餾水和70%乙醇洗脫，濃縮，水浴蒸干，用甲醇定容得皂苷樣品液。采用Liebermann-Burchard（醋酸濃硫酸反應(yīng)）、Lalkowski反應(yīng)和三氯醋酸反應(yīng)對提取物進行鑒定。

1.3.2.2 黃芪莖葉中皂苷含量測定 分別吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液0.30、0.60、1.20、1.80、2.40 mL于有塞試管內(nèi)，水浴使溶劑揮發(fā)，分別加入0.2mL現(xiàn)配的5%香草醛冰醋酸和0.8 mL高氯酸，60℃水浴15 min，流水冷卻2 min，補冰醋酸至5 mL混勻，做空白對照，在552 nm波長處測定吸光度。以吸光度（y）為縱坐標(biāo)、黃芪甲苷微克數(shù)（x）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算回歸方程。精確量取皂苷樣品液，按標(biāo)準(zhǔn)曲線操作步驟，計算總皂苷含量。

1.3.3 黃芪莖葉中多糖含量測定［6］

1.3.3.1 多糖的提取與鑒定 精確稱取黃芪莖葉粉末2.0 g于100 mL錐形瓶中，加入40 mL蒸餾水，調(diào)節(jié)pH=9.0，超聲提取20 min（80℃，1 000 Hz），低溫離心15 min（5000 r/min），將藥渣與藥液分離，重復(fù)上述操作，將兩次收集的藥液混合，洗滌藥渣3次，與之前藥液混合，布氏漏斗中抽濾，濃縮后用蒸餾水定容至50 mL，即為多糖樣品液。采用蒽酮-硫酸法、α-萘酚反應(yīng)和菲林反應(yīng)對提取的多糖進行鑒別。

1.3.3.2 黃芪莖葉中多糖含量測定 分別量取標(biāo)準(zhǔn)液0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL，以蒸餾水定容至10 mL，混勻。各取1.0 mL與1.0 mL新配的5.5%苯酚混勻，加入濃硫酸5.0mL，震蕩5min，沸水煮15min，立即冰浴15min，設(shè)空白對照，在498 nm波長出測定吸光度。以吸光度（y）為縱坐標(biāo)、溶液濃度（x）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算回歸方程。精確量取多糖樣品液0.1 mL，蒸餾水定容至 10 mL，取1 mL加1 mL蒸餾水混合，按標(biāo)準(zhǔn)曲線步驟操作，計算總多糖含量。

1.3.4 黃芪莖葉中黃酮含量的測定［7］

1.3.4.1 黃酮的提取與鑒定 取黃芪莖葉，60℃低溫烘干，粉碎后稱取5 g，用20倍量70%乙醇回流提取2.5 h，后對乙醇進行濃縮，加入等量水，冰鎮(zhèn)后過濾，殘渣再重復(fù)提取1次，將兩次濾液混合，揮干，用甲醇定容。采用HCL-Mg反應(yīng)、三氯化鋁反應(yīng)和乙酸鎂反應(yīng)對提取的黃酮進行鑒定。

1.3.4.2 黃芪莖葉中黃酮含量的測定 分別精確量取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0和1.2 mL于25 mL容量瓶中，加入1 mL的5%亞硝酸鈉搖勻，靜置5 min，再加入1 mL的10%亞硝酸鋁搖勻，靜置5 min，加入4%氫氧化鈉10 mL，加水至刻度搖勻，靜置15 min，在510 nm波長處測定吸光度。以吸光度（y）為縱坐標(biāo)、溶液濃度（x）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算回歸方程。精密稱取1 mL樣品液，以95%乙醇定容于10 mL容量瓶中，按標(biāo)準(zhǔn)曲線步驟操作，計算黃酮含量。

1.4 黃芪莖葉中常規(guī)營養(yǎng)成分測定

1.4.1 黃芪莖葉中干物質(zhì)含量測定 將稱量瓶恒重，記質(zhì)量為W1，加入5 g黃芪莖葉粉末后記質(zhì)量為W2，將稱量瓶放入溫箱105℃烘干6 h，冷卻30 min稱重，重復(fù)烘干至恒重，記終質(zhì)量為W3，依據(jù)下式計算干物質(zhì)含量。

干物質(zhì)（%）=［（W3-W1）/（W2-W1）］×100%

1.4.2 黃芪莖葉中粗蛋白含量測定 采用凱氏定氮法測定。用濾紙包精確稱取黃芪莖葉粉末1.0 g放入凱氏管底部，加入6.4 g混合催化劑和98%硫酸12 mL，于消化儀上文火加熱，焦化泡沫消失后再加強火，待溶液呈透明的藍綠色終止加熱。冷卻后將凱氏管固定在凱氏定氮儀上，將冷凝管末端浸入混合有20 mL硼酸和2滴混合指示劑的錐形瓶中。蒸汽蒸餾，持續(xù)滴加40%氫氧化鈉直至消化液變?yōu)楹稚?。?.1 mol/L的HCl滴定，直至滴定終點（藍綠色變成灰紅色），記錄使用HCl的體積（吸收液耗用體積記為V1，空白液耗用體積記為V2），依據(jù)下式計算蛋白質(zhì)含量。

蛋白質(zhì)（%）=［C×（V1－V2）×0.014 01/（m×0.1）］×F×100%（F=6.25，飼料蛋白質(zhì)含量換算系數(shù)）1.4.3黃芪莖葉中粗纖維含量測定 采用提濾法測定。精確稱取黃芪莖葉粉末，記重W1，脫脂后放入燒杯。加入預(yù)熱的已知濃度的硫酸200 mL，繼續(xù)加熱使其在2 min內(nèi)沸騰，加入1～2滴正辛醇除泡沫，持續(xù)微沸30 min，進行抽濾，使用沸水沖洗殘渣直到變?yōu)橹行院蟪楦?。殘渣中加入預(yù)熱的氫氧化鈉溶液200 mL，繼續(xù)加熱30 min，然后在古氏坩堝上過濾，先用硫酸洗滌，殘渣轉(zhuǎn)移到坩堝內(nèi)用水沖洗至中性，最后用15 mL乙醇洗滌、抽干。將盛有殘渣的坩堝130℃烘干2 h，然后干燥器中冷卻稱重，坩堝和殘渣記重W2，再將盛有殘渣的坩堝550℃灼燒30 min，干燥冷卻30 min，坩堝及殘渣記重W3，根據(jù)下式計算粗纖維含量。

粗纖維（%）=［（W2-W3）/W1］×100%

1.4.4 黃芪莖葉中粗脂肪含量測定 采用索氏浸提法進行測定。濾紙包和稱量瓶恒重，記重W1。精確稱取黃芪莖葉粉末1 g于濾紙包中，105℃烘干6 h，冷卻稱量，重復(fù)至恒重，記重W2。將濾紙包放入索氏抽提器，30～60℃乙醚抽提50～70次，濾紙包放入稱量瓶，揮干乙醚，105℃烘干2 h，冷卻稱重，重復(fù)至恒重，記重W3，根據(jù)下式計算粗脂肪含量。

粗脂肪（%）=［（W2-W3）/（W2-W1）］×100%

1.4.5 黃芪莖葉中粗灰分含量測定 采用燒灼殘渣法測定。將坩堝恒重，記重W1。精確稱取黃芪莖葉粉末1 g放入坩堝，記重W2。先250℃炭化，然后550℃灼燒3 h，取出冷卻稱重，重復(fù)至恒重，記重W3，根據(jù)下式計算粗灰分含量。

粗灰分（%）=［（W2-W3）/（W2-W1）］×100%

1.4.6 黃芪莖葉中無氮浸出物含量計算 采用相差計算法計算。

無氮浸出物（%）=干物質(zhì)（%）-［粗蛋白質(zhì)（%）+粗脂肪（%）+粗纖維（%）+粗灰分（%）］

1.5 黃芪莖葉中常量及微量元素含量測定

1.5.1 黃芪莖葉中鈣含量測定 采用EDTA直接容量法測定。精確稱取黃芪莖葉粉末5 g于坩堝中，先250℃炭化，然后550℃灼燒3 h，加入10 mL鹽酸和幾滴濃硝酸，煮沸后完全倒入100mL容量瓶，冷卻后蒸餾水定容，搖勻即為樣品分解液。準(zhǔn)確量取10 mL樣品分解液于250 mL錐形瓶，加入蒸餾水50 mL、三乙醇胺2 mL、乙二胺1 mL、淀粉液10 mL、品綠1滴，使用氫氧化鉀滴定至無色，再過量10 mL，加入0.1 g的鹽酸羥胺和少許加鈣黃綠素。立即在黑色背景下用EDTA標(biāo)準(zhǔn)液滴定，滴定終點為黃綠色熒光轉(zhuǎn)為紫紅色，然后計算鈣含量。

1.5.2 黃芪莖葉中磷含量測定 采用磷鉬釩酸比色法測定。按上述方法制備樣品分解液，分別準(zhǔn)確吸取磷標(biāo)準(zhǔn)液0、1.0、2.0、5.0、10.0和15.0 mL于50 mL容量瓶中，各加10 mL釩鉬酸銨顯色劑，用水定容搖勻，靜置15 min，以0 mL為參照，分光光度計420 nm波長處測定各溶液的吸光度。以磷含量為橫坐標(biāo)（x）、吸光度為縱坐標(biāo)（y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。精確吸取樣品分解液1～10 mL，按標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制方法測得樣品分解液吸光度，計算黃芪莖葉中磷的含量。

1.5.3 黃芪莖葉中微量元素含量測定 采用《動物飼料中鈣、銅、鐵、鎂、錳、鉀、鈉和鋅含量的測定》（GB/T13885—2003）方法進行測定。

2 結(jié)果

2.1 黃芪莖葉中有效成分含量

2.1.1 黃芪莖葉中總皂苷含量 樣品液Liebemann-Burchard反應(yīng)見液面由黃色轉(zhuǎn)變?yōu)樽霞t色，Lalkowski反應(yīng)見三氯甲烷層出現(xiàn)黃綠色熒光，三氯醋酸反應(yīng)試紙由紅色變紫色，表明樣品液含有皂苷。依繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1），得回歸方程：y=0.00184 x-0.015 64，R2=0.997 75（n=5）。結(jié)果表明，黃芪甲苷在61.5～492 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，黃芪莖葉中總皂苷含量為23.35 mg/g。

2.1.2 黃芪莖葉中多糖含量 樣品液蒽酮-硫酸反應(yīng)呈藍色透明液體，α-萘酚反應(yīng)液面交界處出現(xiàn)紫紅色環(huán)，菲林反應(yīng)陽性，表示樣品液成分為多糖。依繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖2），得回歸方程：y=5.865 8 x-0.021 02，R2=0.997 92（n=6）。結(jié)果表明，標(biāo)準(zhǔn)液濃度在0.01～0.10 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，黃芪莖葉中多糖含量為27.04 mg/g。

2.1.3 黃芪莖葉中黃酮含量 樣品液HCl-Mg反應(yīng)溶液變?yōu)榉奂t色，三氯化鋁反應(yīng)日光下呈灰黃斑點、紫外光下呈黃綠熒光斑點，乙酸鎂反應(yīng)紫外光下見黃色斑點，表明樣品液含有黃酮類物質(zhì)。依繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖3），得回歸方程：y=0.009 59 x+0.329 2，R2=0.997 37（n=6）。結(jié)果表明，標(biāo)準(zhǔn)液濃度在8～48 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，黃芪莖葉中黃酮含量為5.61 mg/g。

圖1 黃芪莖葉中總皂苷含量標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 黃芪莖葉中多糖含量標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖3 黃芪莖葉中黃酮含量標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 黃芪莖葉中常規(guī)營養(yǎng)成分含量

常規(guī)營養(yǎng)成分測定進行3個重復(fù)，發(fā)現(xiàn)測得結(jié)果相差不大，比較穩(wěn)定，計算各主要營養(yǎng)成分含量的平均值，結(jié)果見表1。

表1 黃芪莖葉中主要營養(yǎng)成分含量%

2.3 黃芪莖葉中微量元素含量

結(jié)果見表2。

表2 黃芪莖葉中主要礦物質(zhì)元素含量 μg/g

3 分析與討論

（1）采用提取率最高的方法提取黃芪莖葉中皂苷、多糖和黃酮，然后進行含量測定，結(jié)果顯示，3種成分的含量均不低，以后可以對黃芪莖葉的化學(xué)成分及其生物活性進行深入研究，以更加充分地開發(fā)黃芪的藥用價值。

（2）對黃芪莖葉的營養(yǎng)成分進行測定，結(jié)果表明，黃芪莖葉具備作為飼料添加劑甚至是免疫增強劑的良好潛質(zhì)，對目前提倡的綠色養(yǎng)殖提供了良好基礎(chǔ)。

（3）黃芪莖葉中含有動物所需的銅、鐵、鎂、錳和鋅等微量元素，且鎂和鐵的含量較高。與塞東［8］的研究結(jié)果進行比較發(fā)現(xiàn)，與黃芪根部相比，其莖葉中微量元素含量相差不多，所以傳統(tǒng)的只取根部棄掉莖葉造成了大量浪費，將其作為飼料飼喂奶牛是一個可行的方法。

（4）從本研究結(jié)果可以看出，黃芪莖葉具有藥物與營養(yǎng)的雙重價值，藥材資源豐富，價格低廉，飼喂動物后不會產(chǎn)生藥物殘留，隨著人們綠色養(yǎng)殖理念的發(fā)展和安全意識的提高，應(yīng)該對黃芪莖葉更加深入研究，變廢為寶，在節(jié)約成本的同時對動物起到營養(yǎng)、治療和保健的功效。

［1］ 趙杰.中國常見中藥材［M］.北京：科學(xué)出版社，1995：495-502.

［2］ 齊宗韶.黃芪化學(xué)成分的研究概況［J］.中草藥，1987，18（5）：233-235.

［3］ 鄭志仁，劉滌，宋純清，等.黃芪毛狀根化學(xué)成分和免疫功能活性的研究［J］.生物工程學(xué)報，1998，14（2）：153-157.

［4］ 齊圣鼎，陳燕，徐小異，等.中藥黃芪有效成分的研究、多糖體的分離、性質(zhì)及其生理活性［J］.有機化學(xué)，1982（1）：26-29.

［5］ 張桂娟，江蔚新，陳明小.黃芪葉中有效成分含量的研究［J］.黑龍江醫(yī)藥，2004，17（3）：163-165.

［6］ 張艷賀，張雷鳴，劉秀波，等.不同產(chǎn)地黃芪中黃芪多糖的含量測定［J］.中醫(yī)藥信息，2013，30（5）：69-71.

［7］ 張軍武，趙琦，王昌利.不同生長年限黃芪中黃芪總黃酮含量考察［J］.藥學(xué)研究，2012，25（12）：18-19.

［8］ 塞東.黃芪中的微量元素研究［J］.錦州醫(yī)學(xué)院學(xué)報，1993（5）：24-25.

S816.11

A

2095-3887（2016）05-0032-04

10.3969/j.issn.2095-3887.2016.05.008

2016-07-14

張艷（1987-），女，助理研究員，碩士，主要從事新獸藥研發(fā)與臨床診療工作。

周慶民（1964-），男，研究員，大學(xué)本科，主要從事臨床診療與新獸藥開發(fā)工作。