于麗娟，張艷花，徐新明，吳偉偉，阿米尼古麗，瑪爾孜婭，拉扎提，田可川

（新疆畜牧科學(xué)院畜牧研究所，烏魯木齊 830011）

利用PCR技術(shù)鑒定常見(jiàn)肉類來(lái)源

于麗娟，張艷花，徐新明，吳偉偉，阿米尼古麗，瑪爾孜婭，拉扎提，田可川

（新疆畜牧科學(xué)院畜牧研究所，烏魯木齊 830011）

在提取送檢的未知肌肉組織樣品以及市購(gòu)的豬肉、牛肉、羊肉樣品基因組DNA的基礎(chǔ)上，分別選用1對(duì)通用引物與3對(duì)特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增，用來(lái)檢測(cè)未知樣品的畜種來(lái)源。結(jié)果顯示：通用引物擴(kuò)增4種樣品均出現(xiàn)陽(yáng)性條帶；分別用羊、豬、牛的特異性引物擴(kuò)增樣品DNA，送檢未知樣品只在牛特異性引物擴(kuò)增時(shí)出現(xiàn)了特異性目的條帶。經(jīng)PCR產(chǎn)物直接測(cè)序及同源性比對(duì)進(jìn)行驗(yàn)證確認(rèn)，該未知樣品與牛的同源性為100%，從而驗(yàn)證了該方法的準(zhǔn)確性。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)；鑒定；常見(jiàn)肉類；線粒體DNA

隨著人們生活水平的不斷提高，人們對(duì)肉類的需求量越來(lái)越大。近年來(lái)，在國(guó)內(nèi)及國(guó)際貿(mào)易中，許多不法個(gè)體商人為了牟取高額利潤(rùn)，用低價(jià)格的肉冒充高價(jià)格的肉，比如用豬肉冒充牛羊肉等造假行為最為常見(jiàn)，這不僅影響了消費(fèi)者的健康，而且還會(huì)涉及到宗教信仰等問(wèn)題，致使人們?cè)絹?lái)越關(guān)注肉類食品的動(dòng)物來(lái)源［1］。由于許多制假及摻假肉食品，在宏觀形態(tài)學(xué)方面不易辨別，為此，執(zhí)法機(jī)關(guān)對(duì)市面上的樣品進(jìn)行鑒定時(shí)需要一種科學(xué)準(zhǔn)確的方法，為打假摻雜提供證據(jù)。因此，對(duì)未知的動(dòng)物組織進(jìn)行畜種源性鑒定，一直是科研人員致力解決的問(wèn)題。

近年來(lái)，PCR技術(shù)因其靈敏、快速、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，在肉類和物種鑒定應(yīng)用中得到了快速發(fā)展，成為肉類鑒別及肉類摻假檢驗(yàn)的主要技術(shù)［2］。mtDNA由于穩(wěn)定性好、拷貝數(shù)多、無(wú)組織特異性等優(yōu)點(diǎn)，常作為目標(biāo)基因被用于物種鑒定。其中，經(jīng)常被用于擴(kuò)增線粒體DNA的區(qū)域包括細(xì)胞色素 b、D-loop、12S rRNA、16S rRNA、ATP6和ATP8等［3］。本研究參考相關(guān)文獻(xiàn)，利用PCR方法對(duì)有關(guān)部門送檢的肌肉組織樣品進(jìn)行種屬鑒定，為相關(guān)執(zhí)法部門打擊不法商販、維護(hù)消費(fèi)者合法利益提供有力科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)樣品 1份樣品來(lái)自有關(guān)部門送檢的未知?jiǎng)游锛∪饨M織樣本，另外3份分別為生鮮羊肉、生鮮牛肉和生鮮豬肉，均購(gòu)于市場(chǎng)。

1.1.2 主要試劑和設(shè)備 瓊脂糖、Taq酶、dNTPs、Marker（DL2000）、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒等均購(gòu)自大連寶生物有限公司；ABI 9700PCR儀（美國(guó)ABI公司）、DYY-Ⅲ32型平板電泳槽（北京市六一儀器廠）、UV-1000凝膠成像系統(tǒng)（北京賓達(dá)英創(chuàng)科技有限公司）、BECKMAN ND-1000 Spectrophotometer分光光度計(jì)（美國(guó)）、3－16K型低溫離心機(jī)（Sigma，德國(guó)）等。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取 每個(gè)樣品稱取30 mg，按照天根生化科技有限公司生產(chǎn)的產(chǎn)品DP304-血液、組織、細(xì)胞基因組提取試劑盒的說(shuō)明書的操作步驟對(duì)樣品進(jìn)行全基因組提取。

1.2.2 PCR擴(kuò)增 引物序列及擴(kuò)增片段長(zhǎng)度見(jiàn)表1，引物由上海生工生物工程公司合成。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系25 μL：10×PCR緩沖液2.5 μL，dNTPs 2.0 μL（2.5 mmol/L），引物各1 μL（2.5 pmol/μL），Taq酶0.5 μL（5 U/μL），模板DNA 1.5 μL（空白對(duì)照加ddH2O），ddH2O補(bǔ)至25μL。

通用引物擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性4 min，94℃45 s，69℃90 s，72℃60 s，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸7 min。牛特異性引物擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性4 min，94℃45 s，63℃30 s，72℃60 s，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸7 min。羊特異性引物擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性4 min，94℃45 s，59℃30 s，72℃60 s，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸7 min。豬特異性引物擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性3 min，94℃30 s，60℃20 s，72℃20 s，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸5 min。

1.2.3 PCR產(chǎn)物純化和測(cè)序 利用膠回收試劑盒對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收純化，送上海生工生物工程公司進(jìn)行序列測(cè)定。

表1 引物序列及擴(kuò)增片段長(zhǎng)度

2 結(jié)果與分析

2.1 通用引物擴(kuò)增結(jié)果

圖1 通用引物檢測(cè)不同樣品PCR電泳圖

采用通用引物對(duì)送檢樣品、豬、牛、羊肌肉組織樣品所提取的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，均檢測(cè)出陽(yáng)性條帶，其中牛和羊的目的片段均為234 bp，豬的目的片段為239 bp，如圖1。

圖2 羊特異性引物PCR擴(kuò)增不同樣品電泳圖

2.2 特異性引物擴(kuò)增結(jié)果

用羊特異性引物擴(kuò)增樣品DNA時(shí)，只有4號(hào)市購(gòu)羊肉樣品中檢測(cè)出了特異性條帶，其他樣品未檢測(cè)出特異性條帶，如圖2；用豬特異性引物擴(kuò)增樣品DNA時(shí)，只有2號(hào)市購(gòu)豬肉樣品中檢測(cè)出了特異性條帶，其他樣品均未檢測(cè)出特異性條帶，如圖3；用牛特異性引物擴(kuò)增樣品DNA時(shí)，1號(hào)送檢樣品與3號(hào)市購(gòu)牛肉樣品均檢測(cè)出特異性條帶，其余樣品未檢測(cè)出特異性條帶，如圖4。

圖3 豬特異性引物PCR擴(kuò)增不同樣品電泳圖

圖4 牛特異性引物PCR擴(kuò)增不同樣品電泳圖

2.3 PCR產(chǎn)物的測(cè)序結(jié)果

將牛特異性引物擴(kuò)增送檢樣品的PCR產(chǎn)物的測(cè)序結(jié)果用BLAST2.2.9進(jìn)行匹配查詢基因庫(kù)比對(duì)，此序列與牛（Bos taurus）線粒體DNA D-loop區(qū)序列同源性達(dá)到100%，如圖5。

圖5 送檢樣品線粒體DNAD-loop區(qū)部分片段測(cè)序結(jié)果

3 討論

近年來(lái)，由于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)具有較高的靈敏度和特異性，使得以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的檢測(cè)方法被廣泛應(yīng)用于肉類食品的種屬鑒定。許多研究者根據(jù)不同物種基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，然后利用特異性引物擴(kuò)增目的片段，通過(guò)電泳檢測(cè)鑒別肉類食品中可能的物種來(lái)源［8］。

在靶基因選擇方面，線粒體基因組DNA由于具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、母系遺傳、高度的物種特異性、拷貝數(shù)多、加熱時(shí)不容易被徹底破壞，存活機(jī)率大，更容易被擴(kuò)增，不會(huì)發(fā)生基因重組等優(yōu)點(diǎn)成為肉類食品種屬鑒定的首選靶標(biāo)［9］。經(jīng)查閱相關(guān)文獻(xiàn)分析總結(jié)，Cytb基因、D-Loop區(qū)、12S rRNA、16S rRNA、ATP6和ATP8等線粒體基因常被選用作為肉種類鑒定的PCR擴(kuò)增區(qū)域。馬伊薩蘭等［10］利用Cytb基因序列分析鑒定肉制品摻假；張全芳等［11］據(jù)山羊、綿羊和狐貍線粒體16S rRNA基因間序列差異，設(shè)計(jì)特異性引物，建立了3種肉類成分快速檢測(cè)的多重PCR方法。王蘭萍等［12］通過(guò)擴(kuò)增黃牛肉、牦牛肉和水牛肉的12S rRNA序列并結(jié)合測(cè)序結(jié)果來(lái)鑒別牛肉的種源。本研究中，首先利用幾種動(dòng)物的通用引物，分別擴(kuò)增豬肉、牛肉、羊肉及送檢未知樣品的16S rRNA序列，4個(gè)樣品均為陽(yáng)性。然后分別用豬肉、牛肉、羊肉的特異性引物分別擴(kuò)增4個(gè)樣品的mtDNA中的保守序列，結(jié)果顯示，送檢未知樣品只在牛特異性引物擴(kuò)增時(shí)出現(xiàn)了特異性條帶。經(jīng)PCR產(chǎn)物直接測(cè)序及同源性比對(duì)進(jìn)行驗(yàn)證確認(rèn)，該未知樣品與牛的同源性為100%，從而驗(yàn)證了該方法的準(zhǔn)確性。因此，結(jié)合運(yùn)用PCR擴(kuò)增和DNA測(cè)序技術(shù)是一種精確可靠的方法，能夠有效地運(yùn)用于常見(jiàn)肉類的種源鑒別。該方法可為相關(guān)食品監(jiān)管部門鑒別肉制品摻假造假提供技術(shù)支持。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)利用通用引物與特異性引物PCR擴(kuò)增的方法來(lái)檢測(cè)送檢樣品的畜種來(lái)源，并通過(guò)直接測(cè)序驗(yàn)證其結(jié)果的可靠性，最終確定送檢樣品為牛肉，進(jìn)一步證明該方法用于豬肉、牛肉、羊肉等常見(jiàn)肉類種屬鑒定的可信性。

［1］ 熊蕊，郭鳳柳，劉曉慧，等.牛羊肉中摻雜豬肉的PCR方法的建立和初步應(yīng)用［J］.食品工業(yè)，2014，35（8）：199-202.

［2］ 薛超波，王萍亞，李素芳，等.基于PCR多物種鑒定技術(shù)及其在肉類鑒定中的應(yīng)用［J］.食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào)，2016，7（2）：562-566.

［3］ 高敬，魏迪，張癸榮，等.常見(jiàn)肉類鑒別技術(shù)研究進(jìn)展［J］.食品科學(xué)，2014，35（11）：356-360.

［4］ Bottero MT，Civera T，Nucera T，et al.Design of universal primers for the detection of animal tissues in feedstuff［J］.ProQuest Agriculture Journal，2003，27：667-669.

［5］ Tartaglia M，Saulle E，Pestalozza S，et al.Detection of bovine mitochondrial DNA in ruminant feeds：a molecular approach to test for the presence of bovine-derived materials［J］.Journal of Food Protection，1998，61：513-518.

［6］ Bottero M T，Dalmasso I A，Nucera T，et al.Development of a PCR assayfor the detection of animal tissues in ruminant feeds［J］.Journal ofFood Protection，2003，66：2307-2312.

［7］ Dooley J B，Kelly E P，Stephen D G，et al.Detection of meat species using Taqman real-time PCR assays［J］.Meat Science，2004，68：431-438.

［8］ 何瑋玲，張馳，楊靜，等.食品中4種肉類成分多重PCR的快速鑒別方法［J］.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，45（9）：1873-1880.

［9］ 任君安，黃文勝，葛毅強(qiáng)，等.肉制品真?zhèn)舞b別技術(shù)研究進(jìn)展［J］.食品科學(xué)，2016，37（1）：247-256.

［10］馬伊薩蘭，呂明星，唐俊妮，等.用Cytb基因序列分析鑒定肉制品摻假［J］.中國(guó)食品衛(wèi)生雜志，2016，28（1）：48-51.

［11］張全芳，馬德源，劉艷艷，等.利用多重PCR技術(shù)檢測(cè)羊肉中摻雜狐貍?cè)獾姆椒ㄑ芯浚跩］.山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，46（12）：4-6.

［12］王蘭萍，耿榮慶，王偉，等.基于線粒體12S rRNA基因序列鑒別牛肉的種源［J］.家畜生態(tài)學(xué)報(bào)，2013，34（2）：19-21.

Application of PCR Technique in the Identification of Species Origin of Common Meat

Yu Lijuan，ZhangYanhua，Tian Kechuan，et al
（Institude ofAnimal Science，XinjiangAcademyofAnimal Science，Urumqi 830011，China）

The DNA samples were extracted from unknown muscle tissue sample，pork，beef and mutton for PCR amplification using one pair ofuniversal primers and three pairs of specific primers，in order to detect the species of the unknown muscle tissue sample.The result showed that both positive bands appeared when four samples were amplified by universal primers；When DNA samples were amplified by specific primers，the unknown samples appeared specific target band under using bovine specific primers.The PCR products were sequenced and homology alignment was verified，the result showed that the homology between unknown sample and cattle was 100%，toverifythe accuracyofthe method.

polymerase chain reaction（PCR）technique；identification；common meat；mitochondrial DNA

S826.2

A

2095-3887（2016）05-0007-04

10.3969/j.issn.2095-3887.2016.05.002

2016-08-01

新疆維吾爾自治區(qū)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)經(jīng)費(fèi)資助項(xiàng)目“細(xì)毛羊毛品質(zhì)性狀相關(guān)基因功能鑒定及生物信息學(xué)分析”；新疆絨毛用羊遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（XJYS1105）

于麗娟（1986-），女，助理研究員，碩士。研究方向：動(dòng)物分子遺傳。

田可川（1963-），男，研究員，博士。研究方向：動(dòng)物遺傳育種。