羅生金

（新疆哈密地區(qū)畜牧工作站，哈密839000）

哈薩克羊多胎新類型培育研究

羅生金

（新疆哈密地區(qū)畜牧工作站，哈密839000）

以含有FecB基因?yàn)楹蜻x基因的小尾寒羊和湖羊?yàn)楦副?，與當(dāng)?shù)毓_克母羊進(jìn)行雜交，采用多胎基因FecB分子標(biāo)記技術(shù)與常規(guī)育種技術(shù)，組建理想型育種群。結(jié)果表明：雜交F1羊166只含等位基因B頻率0.58，等位基因+頻率0.42；橫交F2羊檢測(cè)64只，等位基因B頻率0.41，等位基因+頻率0.59；湖（寒）哈雜交及橫交F2羊基因頻率差異均不顯著（P＞0.05），但含BB基因型純合子數(shù)量有所增多，通過(guò)基因檢測(cè)驗(yàn)證了含F(xiàn)ecB基因羊與哈薩克母羊雜交后，F(xiàn)ecB基因顯性效果好，遺傳性能較為穩(wěn)定。F1羊中含有FecB基因型（BB、B+、++）的母羊初生重、6月齡體重、12月齡體重差異均不顯著（P＞0.05）；經(jīng)測(cè)定6月齡和12月齡體高、體長(zhǎng)、胸圍、管圍4項(xiàng)指標(biāo)差異也均不顯著（P＞0.05）。通過(guò)對(duì)F1羊的跟蹤調(diào)查，41只母羊產(chǎn)羔率159%（64/41），繁殖成活率146%（60/41），其中BB基因型1只，產(chǎn)羔2只，產(chǎn)羔率200%；B+基因型29只，產(chǎn)羔50只，產(chǎn)羔率172%；++基因型11只，產(chǎn)羔12只，產(chǎn)羔率109%；B+基因型產(chǎn)羔率與野生型（++）相比提高了63個(gè)百分點(diǎn)，差異極顯著（P＜0.01）。通過(guò)選育選配、橫交固定，初步培育出了哈薩克羊多胎新類型，該類型能較好地適合哈密地區(qū)生態(tài)環(huán)境，為哈薩克羊多胎新類型的進(jìn)一步選育提供依據(jù)。

哈薩克羊；FecB基因；多胎型；培育；小尾寒羊；湖羊

國(guó)內(nèi)外采用常規(guī)育種與分子標(biāo)記結(jié)合開(kāi)展新品種（品系）培育工作，已取得了突破性進(jìn)展。1919年澳大利亞的BSeear從新南威士州毛用型美利奴羊群中選出1只高繁殖力母羊，到1959年BSeear的羊群已經(jīng)具有很高的繁殖力，平均產(chǎn)羔1.94只，育成了多胎的BooroolaMerino高產(chǎn)群［1］。Wilion等［2］發(fā)現(xiàn)骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體-IB（bone morphogentic protein receptor-IB，BMPR-IB）基因編碼區(qū)發(fā)生一處突變（A746G），導(dǎo)致了該受體激酶結(jié)構(gòu)域的第249位氨基酸由谷氨酰胺突變?yōu)榫彼幔≦→R），造成Booroola Merino綿羊排卵數(shù)增加，1989年該基因被綿、山羊遺傳命名委員會(huì)正式定名為FecB基因。在我國(guó)，王根林等［3］利用“forced”限制性酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性PCR技術(shù)首次發(fā)現(xiàn)，湖羊和小尾寒羊存在FecB基因，與Booroola Merino綿羊的多胎主效基因FecB的表現(xiàn)型基本相同，兩者產(chǎn)羔率分別為228.92%和270.00%。柳淑芳等［4］利用FecB基因?qū)?guó)內(nèi)多胎品種進(jìn)行了基因型與產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)聯(lián)分析，進(jìn)一步確認(rèn)了我國(guó)的湖羊、小尾寒羊等少數(shù)品種攜帶有多胎性能主基因。這些文獻(xiàn)為哈密地區(qū)選育多胎新類型提供了理論依據(jù)。

近年來(lái)新疆自治區(qū)開(kāi)展了肉羊標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，肉羊養(yǎng)殖存在問(wèn)題主要有：一是當(dāng)?shù)毓_克羊適應(yīng)性強(qiáng)、體質(zhì)結(jié)實(shí)、善于爬山游牧、抓膘能力強(qiáng)，但生長(zhǎng)速度慢、產(chǎn)肉率低，尾脂多，季節(jié)性發(fā)情，一年一胎繁殖性能低。二是缺乏專門(mén)化多胎肉羊品種，舍飼繁殖母羊依靠山東、江浙一帶引進(jìn)，這些品種在本地區(qū)環(huán)境適應(yīng)性差，表現(xiàn)為繁殖率和成活率低、羊體質(zhì)差、死亡率高等突出特點(diǎn)。針對(duì)以上存在的問(wèn)題，自治區(qū)高技術(shù)項(xiàng)目“新疆地方綿羊品種多胎性類型創(chuàng)制”的子課題“哈薩克羊多胎新類型創(chuàng)制”，采用含有候選FecB基因純合子的湖（寒）公羊與本地哈薩克母羊雜交，通過(guò)檢測(cè)綿羊高繁殖率主效基因來(lái)選育哈薩克羊多胎新類型。

1 材料與方法

1.1 檢測(cè)多胎基因FecB

本實(shí)驗(yàn)分4次采集血樣，用裝有肝素鈉的采血器每只綿羊頸靜脈采血3～5 mL，-20℃冷凍，分次進(jìn)行綿羊多胎主效基因FecB分子檢測(cè)篩選。

1.1.1 材料 綿羊血樣，1.5 mL離心管，PCR引物，限制性內(nèi)切酶AvaⅡ，瓊脂糖，高速離心機(jī)，恒溫?fù)u床，PCR儀，電泳槽，電泳儀，凝膠自動(dòng)成像儀，自動(dòng)滅菌鍋，電子天平，干熱滅菌箱，移液槍。

1.1.2 方法 本實(shí)驗(yàn)采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)連接的限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析（PCR-RFLP）檢測(cè)，參照儲(chǔ)明星等［5］方法分3步操作：第一步，提取綿羊基因組DNA，通過(guò)酚－氯仿法從綿羊全血或者組織提取DNA；第二步，進(jìn)行PCR擴(kuò)增FecB基因特異片段，通過(guò)PCR方法擴(kuò)增包含突變位點(diǎn)的片段；第三步，PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切和結(jié)果判定，根據(jù)突變位點(diǎn)選擇特異性限制性內(nèi)切酶對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切，酶切產(chǎn)物進(jìn)行電泳，用分光光度計(jì)檢測(cè)DNA純度，根據(jù)電泳凝膠上DNA片段大小不同判定結(jié)果。

1.1.3 酶切產(chǎn)物分析 用限制性內(nèi)切酶AvaⅡ?qū)CR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切消化。酶切體系：6 μL擴(kuò)增產(chǎn)物；2 μL 10×Buffer；0.5 μL AvaⅡ限制性內(nèi)切酶；雙蒸水補(bǔ)至20 μL，然后37℃水浴6 h；酶切產(chǎn)物在3%（w/v）瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，凝膠成像系統(tǒng)拍照，確定酶切圖譜的基因型。

圖1 綿羊FecB基因內(nèi)切酶結(jié)果

1.2 制定育種技術(shù)方案

2013年8月確定項(xiàng)目實(shí)施點(diǎn)：哈密市沁城鄉(xiāng)西路村。選取該村6戶飼養(yǎng)的哈薩克母羊500只組群。通過(guò)多胎基因測(cè)定，從哈密地區(qū)長(zhǎng)青種羊場(chǎng)檢測(cè)FecB純合子10只為被選公羊開(kāi)展人工授精。2015年1月進(jìn)入橫交固定階段，采用FecB雜合子6只公羊進(jìn)行橫交，做好各項(xiàng)數(shù)據(jù)收集。

1.3 種公羊飼養(yǎng)管理

種公羊日糧配合：混合精料1.2～1.4kg，青干草2.0kg，胡蘿卜0.5～1.5 kg，雞蛋2枚，配種前3～4周開(kāi)始補(bǔ)料，對(duì)選定種公羊進(jìn)行預(yù)飼，每天驅(qū)趕運(yùn)動(dòng)1～2 h，并進(jìn)行采精訓(xùn)練，配種期種公羊日采精2～3次。

1.4 母羊飼養(yǎng)管理

選取2～5歲繁殖母羊組成基礎(chǔ)群，懷孕前期以放牧為主，適量補(bǔ)飼飼草，懷孕后期及哺乳期每只羊補(bǔ)飼全價(jià)精飼料0.3 kg，補(bǔ)飼部分飼草。

1.5 羔羊飼養(yǎng)管理

羔羊出生稱重、掛耳標(biāo)，2周齡開(kāi)始補(bǔ)羔羊料，填好各項(xiàng)產(chǎn)羔記錄，做好疫苗接種、母幼適時(shí)分飼、定時(shí)哺乳及斷奶工作，并做好斷奶羔羊鑒定和記錄。按一定比例對(duì)母羔采血進(jìn)行多胎基因測(cè)定，初步建立了F1、F2公母羊的后備羊群，做好數(shù)據(jù)整理。

1.6 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析方法

數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0、Excel軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用單因子方差分析（one-way ANOVA，LSD）進(jìn)行平均數(shù)與標(biāo)準(zhǔn)差計(jì)算，差異顯著時(shí)進(jìn)行Duncan多重比較檢驗(yàn)。結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 FecB基因在雜交類群中的分布

由表1可知，在湖（寒）哈雜交及橫交F2羊群中存在3種基因型：BB型、B+型、++型。雜交F1羊166只含等位基因B頻率為0.58，等位基因+頻率為0.42；橫交F2羊檢測(cè)64只，含等位基因B頻率為0.41，含等位基因+頻率為0.59；湖（寒）哈雜交F1羊與橫交F2羊基因頻率和基因型頻率差異均不顯著（P＞0.05），但兩者均與小尾寒羊和湖羊差異極顯著（P＜0.01）。說(shuō)明含F(xiàn)ecB基因羊與哈薩克母羊雜交后，F(xiàn)ecB基因顯性效果好，遺傳性能較為穩(wěn)定。

表1 成羊及雜交羔羊FecB基因型頻率分布

2.2 初生、6月齡、12月齡體重及體尺測(cè)定結(jié)果比較

由表2可知，不同F(xiàn)ecB基因型（BB、B+、++）羊初生、6月齡、12月齡體重均差異不顯著（P>0.05）。同時(shí)測(cè)定6月齡和12月齡體高、體長(zhǎng)、胸圍、管圍4項(xiàng)指標(biāo)，結(jié)果表明，攜帶BB、B+與野生型（++）基因型育成羊體尺差異也均不顯著（P＞0.05）。說(shuō)明育種群的遺傳性能較為穩(wěn)定，具有早期生長(zhǎng)發(fā)育較快的特性，充分顯示此類群生長(zhǎng)發(fā)育狀態(tài)良好。

表2 不同基因型羔羊初生重及6月齡、12月齡體重與體尺比較

2.3 橫交固定FecB基因?qū)Τ醍a(chǎn)母羊產(chǎn)羔數(shù)的影響

應(yīng)用FecB基因選擇提高產(chǎn)羔率，選擇5只F1理想型B+基因型公羊與無(wú)親緣關(guān)系的攜帶不同基因型的136只母羊配種，并對(duì)其中41只母羊產(chǎn)羔情況跟蹤觀察。由表3可知，41只母羊產(chǎn)羔64只，產(chǎn)羔率156%。其中BB基因型1只，產(chǎn)羔2只，產(chǎn)羔率200%；B+基因型29只，產(chǎn)羔50只，產(chǎn)羔率172%；++基因型11只，產(chǎn)羔12只，產(chǎn)羔率109%；B+基因型與野生型（++）相比產(chǎn)羔率提高了63個(gè)百分點(diǎn)，差異極顯著（P＜0.01）。以上研究表明，多胎基因FecB分子標(biāo)記技術(shù)，可以用于對(duì)綿羊產(chǎn)羔數(shù)的輔助選擇。因此，在開(kāi)展橫交固定及選育過(guò)程中，應(yīng)優(yōu)先選擇攜帶多胎基因的公、母羊配種，以利于增加哈薩克羊新類型的多胎型。

表3 橫交組合FecB基因型對(duì)初產(chǎn)母羊產(chǎn)羔率的影響

2.4 哈薩克羊新類型繁殖性能

參與肉羊新類型培育的母本是本地哈薩克羊，屬季節(jié)性發(fā)情，通過(guò)對(duì)哈密市牧祥養(yǎng)殖專業(yè)合作社湖（寒）哈雜交F1羊的跟蹤調(diào)查，41只母羊產(chǎn)羔率156%（64/41），繁殖成活率146%（60/41）。原因在于初產(chǎn)母羊配種年齡較小、存在奶水不足等問(wèn)題，導(dǎo)致羔羊死亡、繁殖成活率有所下降。F1母羊表現(xiàn)為早熟、常年發(fā)情、配種、產(chǎn)羔等特點(diǎn)。

2.5 哈薩克羊新類型培育與適應(yīng)性觀察

2.5.1 體型外貌 培育中的哈薩克羊多胎新類型，毛色為紅白花、黑白花、白色等，以雜色居多。體型中等，結(jié)構(gòu)勻稱，背腰平直，四肢較高且結(jié)實(shí)。尾部呈現(xiàn)桃型，個(gè)別出現(xiàn)下垂尾，下一步應(yīng)采用含有FecB基因的薩?？搜蜻M(jìn)一步雜交改良。

2.5.2 適應(yīng)性觀察 哈密是典型的溫帶大陸性干旱氣候，晝夜溫差大，風(fēng)沙多。經(jīng)觀察哈薩克羊多胎新類型能在哈密山區(qū)生態(tài)條件下放牧，合群性強(qiáng)，能夠忍受營(yíng)養(yǎng)上的四季變化，生長(zhǎng)性能較好，繁殖力超過(guò)哈薩克羊，采食速度快、范圍廣、不挑食。在舍飼養(yǎng)殖條件下各項(xiàng)生理指標(biāo)在合理區(qū)間，發(fā)病率低。

表4 各季節(jié)生理指標(biāo)

3 討論與小結(jié)

（1）綿羊多胎基因（FecB）的位點(diǎn)被定位在第6號(hào)染色體上，F(xiàn)ecB基因是綿羊高繁殖力BMPR-IB基因突變的結(jié)果，具有提高排卵數(shù)和產(chǎn)羔數(shù)的生物學(xué)作用。本實(shí)驗(yàn)選用10只FecB基因突變BB基因型公羊與本地哈薩克母羊配種，抽樣檢測(cè)多胎基因型（BB）及雜合型母羔頻率為0.78，公羔頻率為0.86。檢測(cè)橫交F2羊64只，B+基因型頻率為0.67；BB基因型頻率為0.08，++基因型頻率為0.25。但湖（寒）哈雜交F1羊及橫交F2羊基因型頻率差異均不顯著（P＞0.05）。檢測(cè)結(jié)果表明，含F(xiàn)ecB基因羊與哈薩克母羊雜交后，F(xiàn)ecB基因顯性效果好，遺傳性能較為穩(wěn)定，導(dǎo)入效果十分顯著。

（2）關(guān)于FecB基因是否影響羔羊初生重和羔羊發(fā)育生長(zhǎng)，目前還沒(méi)有統(tǒng)一結(jié)論。本研究數(shù)據(jù)表明，BB基因型羔羊初生、6月齡、12月齡體重均低于B+、++基因型羔羊，但差異均不顯著（P＞0.05）。此結(jié)果與Kumar等［6］、WillingG等［7］的報(bào)道基本一致。

（3）哈薩克多胎新類型是選用小尾寒羊種公羊和湖羊種公羊與本地哈薩克母羊進(jìn)行雜交，同時(shí)采用多胎基因FecB分子標(biāo)記技術(shù)與常規(guī)育種技術(shù)，組建理想型育種群，通過(guò)選育選配、橫交固定，初步培育出了哈薩克羊多胎新類型。該類型具有較高繁殖力，在舍飼條件下各項(xiàng)生理指標(biāo)正常，發(fā)病率低，能很好地適應(yīng)本地氣候環(huán)境；缺點(diǎn)是個(gè)別羊出現(xiàn)下垂尾，不利于自然交配，毛色不一，繁殖性能不太穩(wěn)定等問(wèn)題，在今后的培育中有待繼續(xù)完善與提高。

［1］ Souza C J，Macdougall C，Campbell B K，et al.The Booroola（FecB）phenotype is associated with a mutation in bone morphogenetic receptor typeIB（BMPR1B）gene［J］.Endocrinol，2001，169（2）：1-6.

［2］ Wilson T，Wu J L.Highlyprolific Booroola sheep have a mutation in the intracellular kinase domain of bone morphogenetic protein IB receptor（ALK-6）that is expressed in both oocyes and granulose cells［J］.BiologyofReproduction，2001，64：1225-1235.

［3］ 王根林，毛鑫智，Davis GH，等.DNA分析發(fā)現(xiàn)我國(guó)湖羊和小尾寒羊存在Booroola（FecB）多胎基因［J］.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，26（1）：104-106.

［4］ 柳淑芳，姜運(yùn)良，杜立新.BMPR-IB和BMPl5基因作為小尾寒羊多胎性能候選基因的研究［J］.遺傳學(xué)報(bào)，2003，30（8）：755-760.

［5］ 儲(chǔ)明星，狄冉，葉素成，等.綿羊多胎主效基因FecB分子檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用［J］.農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2009，17（1）：52-58.

［6］ Kumar S，Mishra A K，Kolte A P.Effects of the Boorla（FecB）genotypes on growth performance，ewe，s productivity efficiency and litter size in Garole Malpura sheep［J］.Animal Reproduction Science，2008，105（3-4）：319-331.

［7］ Walling G A，Dodds K G，Galloway S M，et al.The consequences of carrying the Booroola fecundity（FecB）gene on sheep live weight［C］// Proceedingofthe British SocietyofAnimal Science.2000：43-47.

Study on the Breeding of Fecundity Type of Kazak Sheep

LuoShengjin
（Hami Animal HusbandryStation，Hami 839000，Xinjiang，China）

In order to breed an ideal fecundity type of Kazak sheep，Small Tail Han sheep and Hu sheep，containing FecB gene（multiple gene），were used as male parents.The results showed that the frequencies of B allele and+allele in F1were 0.58，0.42 respectively，thefrequenciesofBalleleand+alleleinF2were0.41，0.59respectively.Therewerenosignificantdifferencesinthebirth weight，sixmonthweightandtwelvemonthweightamongtheeweswithdifferentFecBgenotypes（BB，B+，++）（P＞0.05），sowerethe body height，body length，chest circumference and tube around at the age of 6，12 month（P＞0.05）.The lambing rate and the reproductive survival rate ofF1were 159%（64/41）and 146%（60/41）respectively，the lambing rates of ewes with BB，B+，++ genotypeswere200%（2/1），172%（50/29），109%（12/11）respectively；comparedwiththelambingrateofgenotype++，the lambing rateofgenotypeB+washigherby63percentagepoints（P＜0.01）.Throughselectivebreedingandcrossingfixation，thefecunditytype ofKazak sheep was established initiallyand it was suitable tothe local ecological environment.

Kazak sheep；FecB gene；fecunditytype；breeding；Small Tail Han sheep；Hu sheep

S826.2

A

2095-3887（2016）03-0017-04

10.3969/j.issn.2095-3887.2016.03.005

2016-02-23

新疆維吾爾自治區(qū)科技廳高技術(shù)項(xiàng)目（2013110101）

羅生金（1973-），男，高級(jí)獸醫(yī)師，執(zhí)業(yè)獸醫(yī)師，碩士，主要從事畜牧業(yè)科技推廣與臨床動(dòng)物疫病診治工作。