馮紀璐，齊軍茹，劉倩茹

（華南理工大學食品科學與工程學院，淀粉與植物蛋白深加工教育部工程研究中心，廣州510640）

基于糖基化反應及自組裝法制備大豆分離蛋白?可溶性大豆多糖核殼結構納米凝膠

馮紀璐，齊軍茹，劉倩茹

（華南理工大學食品科學與工程學院，淀粉與植物蛋白深加工教育部工程研究中心，廣州510640）

結合大分子擁擠環(huán)境下的糖基化反應與自組裝兩步法，制備了安全而新型的具有核殼結構的納米凝膠.首先，通過水相體系中的Maillard反應使親水性大豆多糖（SSPS）共價連接到大豆分離蛋白（SPI）上形成兩親性嵌段共聚物；然后，在疏水聚集及靜電吸引作用力的驅動下誘導接枝共聚物自組裝形成SPI?SSPS納米凝膠.原子力顯微鏡與透射電子顯微鏡分析表明，SPI?SSPS納米凝膠為分布均勻、具有核殼結構的球形粒子，以親水性的SPI為殼，以交聯(lián)的SSPS為核；利用圓二色光譜法與熒光光譜法表征了SPI?SSPS納米凝膠的結構，結果表明，SPI?SSPS納米凝膠中蛋白的三級結構發(fā)生改變，疏水基團暴露于蛋白表面使納米凝膠內部形成疏水微區(qū)，有利于荷載疏水性藥物；穩(wěn)定性實驗結果表明，所制備的SPI?SSPS納米凝膠具有環(huán)境穩(wěn)定性，在一定的pH值與生理離子強度范圍內粒子基本不變，于4℃能穩(wěn)定儲藏120 d以上.因此，SPI?SSPS納米凝膠在生物醫(yī)藥領域具有廣闊的應用前景.

納米凝膠；Maillard反應；自組裝；疏水聚集；靜電作用；大豆分離蛋白；可溶性大豆多糖

納米凝膠具有優(yōu)異的尺寸效應、較高的負載能力及穩(wěn)定性，從而可實現(xiàn)藥物的靶向輸送［1］.目前，制備納米凝膠的材料主要為聚異丙基丙烯酰胺和聚丙烯酸等合成的高分子，但由于聚異丙基丙烯酰胺和聚丙烯酸具有一定的毒性與生物不相容性，限制了其在實際生產中的應用［2］.蛋白質與多糖是兩大類來源廣泛的天然大分子，具有較好的生物相容性與降解性，有利于制備環(huán)境友好的納米凝膠［3］. Yu等［4］利用蛋白與多糖在水溶液中的靜電相互作用制備了殼聚糖?白蛋白納米凝膠，此類納米凝膠由于缺少表面修飾而具有pH敏感性，其二次聚集現(xiàn)象不利于納米凝膠的負載與輸送.研究發(fā)現(xiàn)，兩親性的嵌段共聚物能在水相中自組裝形成核殼結構的穩(wěn)定納米粒子［5～7］，因此利用共價鍵結合的蛋白多糖復合物自組裝構建納米粒子具有良好的前景.

基于Maillard反應（糖基化反應或羰氨反應）的蛋白質改性方法是一種安全有效的方法.通過自發(fā)的羰氨反應可使還原性多糖的羰基末端共價連接到蛋白的ε?或α?氨基上，從而形成兩親性接枝共聚物［8］.Maillard反應通常分為干熱法與濕熱法.干熱法形成的接枝共聚物具有接枝度高及功能特性優(yōu)越等特點［9］.

目前已有利用Maillard干熱反應制備穩(wěn)定納米粒子的報道［10～13］.Wu等［10］利用糖基化產物及其水解物通過反溶劑法制備大豆7S球蛋白?葡聚糖納米粒子，但交聯(lián)劑戊二醛?乙醇溶液具有一定的毒性. Yi等［11］通過均質?溶劑揮發(fā)法制備包埋有β?胡蘿卜素的β?乳球蛋白?葡聚糖納米粒子，此法不僅操作繁瑣，而且容易殘留有機溶劑（乙酸乙酯）.Feng等［12］利用Maillard干熱產物通過自組裝法制備了具有高度穩(wěn)定性的納米凝膠，但由于干熱法存在反應時間長及反應程度不可控等缺點，不利于工業(yè)化生產［14］.為了解決這一問題，濕熱法被用于糖基化產物的制備，研究發(fā)現(xiàn)，Maillard濕熱反應能明顯縮短

反應時間，從而將反應限制在初級階段［15］.但在傳統(tǒng)的水相體系中，蛋白質在高溫條件下發(fā)生變性和聚集，導致產物的接枝度較低，使Maillard反應始終不能有效地在水相中進行.為了突破瓶頸，“大分子擁擠環(huán)境”的概念被引入了濕熱反應［14，16］，利用大分子在高濃度環(huán)境下的反應遵循分子排斥容積理論及蛋白在擁擠體系中構型趨于穩(wěn)定的理論指導［17，18］，制備出變性及聚集程度較低而接枝程度較高的接枝共聚物.目前，基于大分子擁擠環(huán)境下Maillard反應制備納米凝膠的研究尚未見報道.

本文利用Maillard濕熱反應及自組裝兩步法構建納米凝膠體系，即通過Maillard反應使可溶性大豆多糖（SSPS）共價接枝到大豆分離蛋白（SPI）上，形成兩親性共價接枝聚合物大豆分離蛋白?可溶性大豆多糖接枝聚合物（SSC），在疏水作用力及靜電吸引力的驅動下誘導其自組裝形成SPI?SSPS納米凝膠.利用透射電子顯微鏡（TEM）及圓二色光譜（CD）法表征了SPI?SSPS納米凝膠的形貌及結構.并對其環(huán)境穩(wěn)定性進行了測定，以期在食品醫(yī)藥領域的實際應用中起到指導作用.

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

低溫脫脂豆粕，山東省高唐藍山集團總公司；可溶性大豆多糖［SSPS，含粗蛋白6.3%（質量分數(shù)），粗脂肪0.7%，灰分7.4%及水分5.6%］，福建味博食品有限公司；8?苯胺基?1?萘磺酸（ANS），美國Sigma?Aldrich公司；其它生化試劑均為國產分析純.

Nano?ZS型激光動態(tài)粒度掃描（DLS）儀，英國Malvern公司；H?7650型透射電子顯微鏡（TEM），日本Hitachi公司；Multimode 8型掃描探針顯微鏡（SPM），美國Bruker公司；Himac CR 22G型高速冷凍離心機，日本Hitachi公司；Alpha?4型冷凍干燥機，德國Christ公司；F?7000型熒光分光光度計，日本Hitachi公司.

1.2 實驗過程

1.2.1 SPI的制備 采用堿溶酸沉法［19］從低溫脫脂豆粕中提取SPI.根據杜馬斯燃燒法（N＝5.71）測得SPI的蛋白質量分數(shù)為（85.40±0.32）%.

1.2.2 共價接枝聚合物SSC的制備 將質量比為1∶1的SPI與SSPS溶解于去離子水中，使其質量分數(shù)為20%，室溫下攪拌4 h使其完全溶解并調節(jié)溶液pH至7.0，于4℃靜置12 h使其充分水解；將溶液于60℃反應24 h，然后于4℃透析24 h，每隔4 h更換去離子水；透析后溶液于20℃離心（10000g，30 min），取上清液冷凍干燥，所得粉末即為SSC.

1.2.3 SPI?SSPS納米凝膠的制備 將0.1 g SSC粉末溶于200 mL去離子水中，室溫下磁力攪拌30 min，用0.1 mol／L HCl溶液調節(jié)pH值至3.8～5.8并平衡5 min，于90℃的水浴中孵育60 min，得到SPI?SSPS納米凝膠.

2 結果與討論

2.1 SSC的形成與表征

高分子量的SSPS不僅作為反應試劑在水相體系中與SPI發(fā)生共價接枝反應，而且作為擁擠試劑為糖基化反應提供一個擁擠的環(huán)境.

電泳圖譜是鑒定Maillard型接枝共聚物形成的重要手段，分離膠頂部或濃縮膠界面多分散性條帶的出現(xiàn)說明形成高分子量物質［20］.圖1（A）為蛋白染色圖譜.條帶1清晰地顯現(xiàn)了SPI的5個特征譜帶：大豆7S球蛋白的α′，α和β亞基譜帶與大豆11S球蛋白的酸性（a）及堿性（b）亞基譜帶.蛋白與多糖的混合物條帶（條帶2）與SPI條帶無明顯差異，說明單純加入SSPS對電泳圖譜沒有影響.但接枝共聚物條帶（條帶3）中譜帶顯色明顯變淺，表明SPI中所有的α′，α亞基與大部分的β，a和b亞基參與了糖基化反應.糖染色圖譜用于表征糖基化產物的形成［21］，如圖1（B）所示，SPI與混合物條帶均為空白條帶，而條帶3中高分子量區(qū)出現(xiàn)了明顯的譜帶，表明SPI與SSPS以共價鍵的形式結合，形成了高分子量的接枝共聚物.此外，在蛋白染色及糖染色圖譜各條帶樣品蛋白含量相同的條件下，條帶3在糖染色圖譜的高分子量區(qū)顯色較深，而在蛋白染色圖譜中顯色較淺，說明共價接枝于SPI上的SSPS比

例較高［22］，即產物的接枝程度較高.

Fig.1 Electrophoresis profiles with protein staining （A）and carbohydrate staining（B）

Fig.2 Intrinsic fluorescence spectra of SPI（a），SPI／SSPSm ixture（b）and SSC（c）

褐變是Maillard反應的重要特征，褐變的發(fā)生伴隨著有色物質的形成，而熒光物質被認為是有色物質的前體物［21］，因此通過對比反應前后物質的熒光強度可進一步分析糖基化程度.內源熒光光譜如圖2所示.與SPI和混合物相比，糖基化產物的最大發(fā)射波長（λmax）發(fā)生藍移且熒光強度顯著增強，與文獻［16］報道結果一致，表明在大分子擁擠體系中SPI的糖基化程度較高，即糖基化反應產物的接枝度較高.

2.2 SPI?SSPS納米凝膠的構建及表征

自組裝法是構建單分散性納米粒子綠色而有效的方法，在次級鍵作用力的驅動下，兩親性的嵌段共聚物在水溶液中通過自組裝形成具有核殼結構的納米粒子，疏水性嵌段自發(fā)形成內核，親水性嵌段自發(fā)形成外殼［23］.

研究發(fā)現(xiàn)，納米粒子在等電點附近具有較高的荷載效率［24］，因此探討在SPI等電點（pH＝4.5）附近不同pH值對SPI?SSPS納米凝膠制備的影響，結果示于圖3.可以看出，在pH值為3.8～5.8范圍內均可制備出粒徑分布較窄的平均表觀流體力學直徑（Dh）為125.5～150.6 nm的SPI?SSPS納米凝膠，其中在pH＝3.8時所制備的納米凝膠多分散性指數(shù)（PDI）最小，即納米粒子尺寸最為均一.蛋白質主要依靠排斥作用（主要為靜電排斥）與吸引作用（主要為疏水聚集）兩種非共價鍵作用力維持構象的穩(wěn)定.當?shù)鞍自诘入婞c附近受熱時所帶電荷較少而使蛋白間靜電排斥作用較小，在疏水作用的驅使下蛋白趨于聚集、交聯(lián)并發(fā)生凝膠化，但共價接枝的SSPS發(fā)揮其空間位阻效應，阻止SPI的宏觀聚集并形成粒徑均一的納米凝膠.此外，在pH＝3.8時SPI帶正電荷而SSPS帶負電荷，兩者間靜電吸引作用促進了蛋白與多糖之間的自組裝.

Fig.3 Effect of pH on size（a）and PDI values（b） of the fabrication of SPI?SSPS nanogels

利用DLS與AFM探討納米凝膠的形成過程（圖4和圖5）.SPI呈球形狀態(tài)，部分蛋白由于自身聚集而形成大的顆粒，其Dh為（95.57±0.68）nm.SSPS由于缺少表面活性劑對糖鏈的展開而大致呈橢圓形，其Dh為（197.4±2.4）nm，粒徑分布不均勻（PDI＝0.430）.大分子擁擠環(huán)境下的糖基化反應使SSPS接枝到SPI上從而形成密集的聚集體，顆粒形狀不規(guī)則，樣品分布不均勻.而聚集體進一步在水相體系中自組裝形成了分散性好、粒徑均勻、球形完整的納米粒子，其Dh為（143.1±1.4）nm，PDI為0.186，表明形成單分散性的SPI?SSPS納米凝膠.經過SSPS改性的納米凝膠的親水性得到明顯改善.同時高分子量多糖的立體位阻效應與粒子間多糖的靜電排斥作用可有效地保持SPI?SSPS納米凝膠的分散穩(wěn)定性，即SSPS在SPI?SSPS納米凝膠體系中起界面穩(wěn)定劑的作用.

Fig.4 DLS resu lts of SPI（A），SSPS（B），SSC（C）and SPI?SSPS nanogels（D）

Fig.5 AFM images of SPI（A），SSPS（B），SSC（C）and SPI?SSPS nanogels（D）

2.3 納米凝膠的結構

圖6給出納米凝膠的TEM照片.由圖6可見，納米凝膠具有核殼結構，顯色較深的為親水性的SSPS外殼，而顯色較淺的是疏水性SPI內核.推測由于外殼多糖的結構較為疏松而內核蛋白的結構較為緊密，采用磷鎢酸染色時難以進入內核復染，因此TEM照片中納米凝膠外殼呈現(xiàn)黑色而內核呈現(xiàn)灰白色.此外，從圖6中觀察到納米凝膠的粒徑約為45 nm，而DLS測得該納米凝膠的Dh為（143.6± 0.7）nm，這是由于TEM制樣過程中樣品干燥而使

粒子內部水分揮發(fā)從而導致粒子體積收縮，即所制備的納米凝膠具有較高的溶脹比.

Fig.6 TEM image of SPI?SSPS nanogels

圖7給出SPI、SPI／SSPS混合物、SSC與SPI?SSPS納米凝膠的CD光譜.蛋白在近紫外區(qū)的圓二色性可以反映其側鏈基團苯丙氨酸（260～270 nm）、酪氨酸（275～282 nm）、色氨酸（290～305 nm）微環(huán)境的變化，進而分析蛋白質三級結構的精細變化.由圖7可見，SPI／SSPS混合物的CD光譜與SPI沒有明顯區(qū)別，表明單純加入SSPS不會對蛋白三級結構造成影響.但SSC與SPI?SSPS納米凝膠的CD光譜在苯丙氨酸及酪氨酸（260～282 nm）信號范圍內均出現(xiàn)較大的波動且CD光譜信號增強，這是因為蛋白肽鏈受熱振蕩導致其次價鍵遭受破壞，從而發(fā)生一定程度的伸展，埋藏于分子內部的苯丙氨酸及酪氨酸暴露于肽鏈表面，使蛋白質的三級結構發(fā)生明顯改變.通過測定蛋白的表面疏水性可進一步分析疏水基團的暴露情況.混合物的表面疏水性與SPI相比沒有本質差異（p＜0.05），表明游離的多糖對蛋白的表面疏水性沒有影響.SPI在大分子環(huán)境下接枝到SSPS上后表面疏水性顯著降低，一方面由于蛋白質肽鏈的伸展打破了蛋白質自身的親?疏水平衡，分子內部的疏水基團暴露，另一方面由于接枝了親水性強的多糖使蛋白肽鏈的親水基團數(shù)目增加，且高分子量的多糖對蛋白的疏水基團具有一定的屏蔽作用，使接枝共聚物的表面疏水性下降，進一步證明SPI的親水性能得到較大的改善.與接枝共聚物相比，SPI?SSPS納米凝膠的表面疏水性顯著增加，推測在進一步加熱自組裝的過程中，SPI的肽鏈由于發(fā)生劇烈的熱振蕩使其次價鍵受破壞，即導致疏水鍵進一步暴露于蛋白表面，從而導致蛋白表面疏水性增強.結合TEM分析結果可知，疏水聚集作用是自組裝的主要驅動力，SPI表現(xiàn)出較強的疏水性而蜷縮在內核，其疏水側鏈的進一步打開使納米凝膠內部形成疏水微區(qū).

Fig.7 Near?ultraviolet CD spectra of SPI（a），SPI／SSPSm ixture（b），SSC（c）and SPI?SSPS nanogol（d）

2.4 SPI?SSPS納米凝膠的穩(wěn)定性

由聚電解質通過靜電相互作用自組裝形成的納米凝膠由于缺少表面修飾而具有pH依賴性［4］，從而限制了其在較寬pH值范圍內的應用.本文制備的SPI?SSPS納米凝膠的表面由于經過親水修飾，在pH＝2～10范圍內均未出現(xiàn)二次聚集現(xiàn)象，而且其粒徑能維持在一定范圍內（圖8），具有較強的pH穩(wěn)定性.此種獨特的pH穩(wěn)定性得益于納米凝膠核內交聯(lián)的SPI與外層SSPS的空間位阻效應及靜電排斥作用.一方面，在SPI等電點附近，SPI?SSPS納米凝膠粒子間的SPI由于缺乏靜電排斥而趨于相互聚集，但外殼帶負電荷的SSPS屏蔽了核內的蛋白并發(fā)揮其立體效應從而阻止納米粒子的聚集；另一方面，遠離等電點時，納米凝膠核內的SPI帶有相同的電荷而傾向于解離，但蛋白分子間交聯(lián)的網絡結構使其保持穩(wěn)定狀態(tài).

Fig.8 Dh（a）and PDI values（b）of SPI?SSPS nanogels at pH＝2—10

納米凝膠僅具備pH穩(wěn)定性并不能滿足其在人體內應用的基本要求，因此進一步研究SPI?SSPS納米凝膠在生理離子強度下的穩(wěn)定性.研究發(fā)現(xiàn)，SPI?SSPS納米凝膠在0～200 mmol／L NaCl溶液中的粒徑沒有明顯的變化（圖9），具有較高的NaCl穩(wěn)定性.此外，由于SPI?SSPS納米粒子表面為帶負電荷的多糖，NaCl溶液的加入使帶正電荷的鈉離子吸附于SPI?SSPS納米凝膠的表面，從而中和其表面電荷以屏蔽粒子間的靜電相互作用.由于粒子間缺少靜電排斥作用會趨于聚集，但所制備的SPI?SSPS納米凝膠溶液能保持穩(wěn)定，表明靜電相互作用并不是維持納米凝膠穩(wěn)定的唯一因素.

SPI?SSPS納米凝膠在4℃下儲藏120 d時的粒徑分布基本不變（圖10），表明SPI?SSPS納米凝膠

處于熱力學平衡狀態(tài)，具備長期儲存的穩(wěn)定性，對其實際應用具有較高的價值.

Fig.9 Dh（a）and PDI values（b） of SPI?SSPS nanogels with different NaCl concentrations

Fig.10 Size distribution of nanogels that stored for various times

3 結 論

采用Maillard反應及自組裝兩步法構建大豆分離蛋白?可溶性大豆多糖納米凝膠.以大分子擁擠環(huán)境作為反應介質，通過可溶性大豆多糖與大豆分離蛋白在水相體系中的Maillard反應制備兩親性接枝共聚物；在SPI等電點附近對共聚物進一步熱處理使其在疏水聚集作用及靜電吸引作用的誘導下自組裝形成具有核殼結構的納米凝膠，熵的驅動使疏水性較強的SPI自發(fā)聚集成內核，親水性較強的SSPS自發(fā)包覆在外層.形貌學分析結果顯示，納米凝膠為分布均勻的具有明顯核殼結構的球形粒子，圓二色譜及表面疏水性測試結果表明，納米凝膠中蛋白的空間構象發(fā)生了轉變，疏水側鏈的暴露導致內核疏水微區(qū)的生成，進而有利于通過疏水相互作用對疏水性藥物進行包埋與運載.所制備的納米凝膠在較寬的pH值范圍及一定的離子強度下均不發(fā)生解離或聚集，并且其粒徑能維持在一定范圍內；在4℃下儲藏120 d粒徑分布基本不變，具有較高的儲藏穩(wěn)定性.納米凝膠的核殼結構與高度穩(wěn)定性使其在生物醫(yī)藥領域具有廣闊的應用前景.

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Fabrication of Soy Protein Isolate?soluble Soy Polysaccharide Core?shell Nanogels via Maillard Reaction and Self?assembly?

FENG Jilu，QIJunru?，LIU Qianru
（Engineering Research Center ofStarch and Vegetable Protein Processing，Ministry ofEducation，School of Food Science and Engineering，South China University of Technology，Guangzhou 510640，China）

A“two?step”method，which involved Maillard reaction in macromolecular crowding environment and self?assembly approach，has been adopted to fabricate the novel and safe core?shell nanogels.First，am?phiphilic graft copolymers were synthesized by soluble soy polysaccharide（SSPS）covalently attaching to soy protein isolate（SPI）via Maillard wet?heating reaction.Second，the resultant conjugates（SSC）were induced by both hydrophobic and electrostatic interaction to self?assemble soy protein isolate?soluble soy polysaccharide （SPI?SSPS）nanogels.Microscopic technology indicated that the SPI?SSPS nanogels were well?separated and spherical in shape with obvious core?shell structures：the hydrophilic soy polysaccharide constituted the shell and the cross?linked soy protein constituted the core.Spectroscopy investigation revealed that the tertiary structure of protein in nanogels was changed and the non?polar groups were exposed to the surface of soy protein to develop the hydrophobic compartments in the core of SPI?SSPS nanogels，which might offer a promising potential for drugs encapsulating via hydrophobic attraction.The SPI?SSPS nanogels exhibited remarkable stability against pH and NaCl concentration change，and they were pretty stable against 120 d storage at4℃.All of these valuable properties provide a great potential for practical application in the field of biomedicine.

Nanogel；Maillard reaction；Self?assembly；Hydrophobic attraction；Electrostatic interaction；Soy protein isolate；Soluble soy polysaccharide

O629.7；O629.12

A

10.7503／cjcu20160364

（Ed.：W，Z）

?Supported by the National Natural Science Foundation of China（No.31370036）and the Fundamental Research Funds for the Central Univer?sities，China（No.2015Z2119）.

2016?05?20.

日期：2016?10?09.

國家自然科學基金（批準號：31370036）和中央高校基本科研業(yè)務費專項資金（批準號：2015Z2119）資助.

聯(lián)系人簡介：齊軍茹，女，博士，教授，主要從事蛋白物性修飾及功能性多糖研究.E?mail：jrqi@scut.edu.cn