富國(guó)文，王紹卿，祁會(huì)彩，滕曉紅，達(dá)永仙，樊月圓

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，昆明 650201；2.西安市未央?yún)^(qū)動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，西安 710016）

繁殖與生理

馬關(guān)無(wú)角山羊卵巢顆粒細(xì)胞INHA基因siRNA的篩選與鑒定

富國(guó)文1，王紹卿1，祁會(huì)彩2，滕曉紅1，達(dá)永仙1，樊月圓1

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，昆明 650201；2.西安市未央?yún)^(qū)動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，西安 710016）

為了研究INHA基因在馬關(guān)無(wú)角山羊卵泡發(fā)育中的作用，設(shè)計(jì)并化學(xué)合成了3條針對(duì)INHA基因的siRNA，脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染至馬關(guān)無(wú)角山羊的卵巢顆粒細(xì)胞，Real-time PCR技術(shù)和Western-Blot技術(shù)對(duì)其干擾效率進(jìn)行了篩選。結(jié)果表明：siRNA-2對(duì)INHA基因mRNA表達(dá)抑制率達(dá)到了94.3%，對(duì)蛋白表達(dá)的抑制率達(dá)到了93.4%，是INHA基因沉默的最佳干擾質(zhì)粒，可為今后研究INHA基因的功能提供基礎(chǔ)。

馬關(guān)無(wú)角山羊；INHA基因；siRNA

馬關(guān)無(wú)角山羊是云南省優(yōu)良的地方畜禽品種之一，公母羊均無(wú)角，故性情溫順，易于管理，其頭部有鬃，當(dāng)?shù)厮追Q“馬羊”。主要產(chǎn)于云南省馬關(guān)縣，生活于海拔700～1 700 m的山區(qū)。該品種具有繁殖力高（200%～400%）、性成熟早（母羊3月齡即可發(fā)情配種，公羊6月齡即可配種）、生長(zhǎng)快、性情溫順、肉膻味小、耐粗飼和抗病力強(qiáng)的特點(diǎn)。特別是在無(wú)角、多胎性和肉質(zhì)方面，堪稱山羊珍稀品種資源［1-2］。

抑制素（inhibin，INH）是由睪丸支持細(xì)胞和卵巢顆粒細(xì)胞分泌的糖蛋白激素，屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子超家族成員，該家族主要調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)與分化。INH是由α、β兩個(gè)亞基組成的異二聚體，β亞基又分為A、B兩種，故INH存在兩種形式，即INHA（αβA）和INHB（αβB）［3-5］。研究發(fā)現(xiàn)，INH對(duì)豬、牛、羊、雞等動(dòng)物的卵泡生長(zhǎng)發(fā)育有著重要的作用［6-9］。INHA對(duì)雌性動(dòng)物卵泡發(fā)育的作用隨著卵泡的逐漸成熟而增強(qiáng)，這種作用具有劑量依賴性，因此INHA被認(rèn)為是確定單胎和多胎動(dòng)物種屬特異性排卵數(shù)最重要的激素之一［10-12］。其主要功能是通過反饋調(diào)節(jié)FSH的分泌參與卵泡發(fā)育調(diào)節(jié)。同時(shí)，在卵泡顆粒細(xì)胞上存在INH的特異結(jié)合位點(diǎn)。Geng等［13］和滑國(guó)華［14］通過超表達(dá)和RNAi技術(shù)，研究了INHA基因?qū)εＢ殉差w粒細(xì)胞增殖和凋亡的影響，結(jié)果證明，INHA能抑制卵巢顆粒細(xì)胞的增殖，促進(jìn)卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡。

RNAi技術(shù)為研究者提供了很好的技術(shù)平臺(tái)，能高效特異性地阻斷基因的表達(dá)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞水平的基因敲除。本研究對(duì)構(gòu)建的3個(gè)干擾質(zhì)粒的干擾效率進(jìn)行篩選，為進(jìn)一步研究INHA基因的功能提供了基礎(chǔ)材料。

1　材料與方法

1.1試劑與主要儀器

主要試劑：DMEM/F12（Hyclone），胎牛血清（Gibco），PureYield質(zhì)粒中量純化系統(tǒng)（去內(nèi)毒素）（Promega），Lipofectamine 2000 Reagent（Invitrogen），TRIzol（北京天根），ReverTraAce-α-逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TOYOBO），AceQ?qPCR SYBR?Green Master Mix（Toyobo），Rabbit Anti-INHAPolyclonal Antibody（NOVUSbiologicals），PVDF膜（Millipore）。

主要儀器：CO2培養(yǎng)箱（ThermoFisher Forma），倒置熒光顯微鏡（Nikon），CFX PCR儀（Bio-Rad），轉(zhuǎn)膜槽（Bio Rad）。

1.2方法

1.2.1馬關(guān)無(wú)角山羊卵巢顆粒細(xì)胞的培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)?zāi)秆蚣∪庾⑸渎惹傲邢俅尖c，每只0.1 mg，40 h后麻醉，通過手術(shù)打開腹腔，用無(wú)菌注射器抽取卵巢表面顏色透明、微透亮，血管豐富的卵泡，獲得帶有顆粒細(xì)胞的卵泡液，將卵泡液用不含Ca2+和Mg2+的PBS液洗3次，0.2%透明質(zhì)酸酶消化3 min，再用DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)液洗2遍，每次1 500 r/min離心10 min，回收細(xì)胞，制得顆粒細(xì)胞懸液，按3×105/孔接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板。

1.2.2轉(zhuǎn)染將純化后的卵巢顆粒細(xì)胞用0.25%的胰酶消化，轉(zhuǎn)于25 cm2的培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底的60%～80%時(shí)，用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染INHA基因干擾片段，轉(zhuǎn)染步驟如下：①用250 μL無(wú)血清的DMEM/F12培養(yǎng)基稀釋10 μL的干擾片段（20 μM），同時(shí)用250 μL無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋8 μL的Lipofectamine 2000，輕輕混勻后，分別靜置5 min；②將干擾片段和脂質(zhì)體的稀釋液混合，輕輕混勻后，靜置20 min；③將混合液加入含卵巢顆粒細(xì)胞的培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)加1.5 mL的無(wú)血清培養(yǎng)基，使終體積為2 mL；④放入CO2培養(yǎng)箱中，6 h后換成含10%血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)。培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞進(jìn)行鑒定。

表1　INHA基因的siRNA序列信息

1.2.3Real-time PCR檢測(cè)干擾質(zhì)粒的干擾效率將細(xì)胞收集于RNase-Free離心管中，采用傳統(tǒng)的Trizol法提取總mRNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。根據(jù)Genbank中山羊的INHA的mRNA全序列，取其保守區(qū)，設(shè)計(jì)RT-PCR引物，引物序列為：F：5'-CCGGCCATCCCAGCACACAC-3'，R：5'-GGCGGAGCAGGAACAGAG AGG-3'，內(nèi)參基因GAPDH的引物序列為：F：5'-CGGCTACAGCAACAGGGTGG-3'，R：5'-GGTGGAGGTGGGGCAGGAC-3'。基因表達(dá)量計(jì)算公式為：PCR反應(yīng)后，根據(jù)軟件分析數(shù)據(jù)，應(yīng)用2-△△CT方法對(duì)基因的表達(dá)水平進(jìn)行相對(duì)定量。

1.2.4Western blot檢測(cè)干擾質(zhì)粒的干擾效率細(xì)胞收集于1.5 mL離心管中，加入蛋白裂解液和蛋白酶抑制劑，于冰上裂解30 min，為使細(xì)胞充分裂解，對(duì)裂解液反復(fù)吹打，離心獲得總蛋白，BCA法測(cè)蛋白濃度。目的蛋白分子量大小為40 KD，配置5%的濃縮膠和8%的分離膠，煮樣后電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，一抗孵育稀釋，4℃搖床過夜。置室溫30 min后，洗膜3次，每次10 min，加入過氧化物酶標(biāo)記的二抗，置搖床搖2 h后，化學(xué)發(fā)光法采集照片。應(yīng)用Metamorph圖像分析軟件分析INHA與β-actin的蛋白灰度值，得到各組蛋白相對(duì)含量。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）來(lái)表示，采用One-way ANOVA進(jìn)行方差分析，采用EXCEL繪制比較圖譜。P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2　結(jié)果與分析

2.1馬關(guān)無(wú)角山羊卵巢顆粒細(xì)胞的培養(yǎng)

剛分離出來(lái)的卵巢顆粒細(xì)胞呈圓形或橢圓形，懸浮在含10%胎牛血清的DMEMF12的培養(yǎng)液中，如圖1（A）所示。經(jīng)原代培養(yǎng)后進(jìn)行了傳代，傳代24 h后，細(xì)胞貼壁，呈梭型或不規(guī)則三角形圖1（B），72 h鋪滿了瓶壁的90%（圖1（D））。細(xì)胞狀態(tài)良好，可用于下一步實(shí)驗(yàn)。

圖1　卵巢顆粒細(xì)胞的培養(yǎng)結(jié)果

2.2卵巢顆粒細(xì)胞轉(zhuǎn)染結(jié)果

如圖2所示，倒置熒光顯微鏡下可見發(fā)綠色熒光的卵巢顆粒細(xì)胞。

圖2　轉(zhuǎn)染后的卵巢顆粒細(xì)胞

2.3Real-time PCR法檢測(cè)干擾后INHA基因的mRNA表達(dá)量

卵巢顆粒細(xì)胞中的INHA基因經(jīng)3個(gè)干擾質(zhì)粒干擾后的mRNA的表達(dá)量如圖3所示。干擾后siRNA-1、siRNA-2和siRNA-3組的INHA基因的mRNA的表達(dá)量與正常組和NC組比較明顯降低（P＜0.01），其中siRNA-2組的表達(dá)量最低。

圖3　轉(zhuǎn)染后INHA基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量

2.4Westernblot法檢測(cè)干擾后INHA蛋白的表達(dá)量

轉(zhuǎn)染48 h后抽提蛋白，經(jīng)Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，正常組與陰性對(duì)照組的Western blot圖譜灰度基本一致，而3個(gè)干擾組的Western blot圖譜灰度都明顯降低，其中SiRNA-2的蛋白圖譜灰度最低（圖4）。應(yīng)用Metamorph圖像分析軟件分析INHA與β-actin蛋白灰度值，得到各組蛋白相對(duì)含量。如圖5所示，siRNA-1、siRNA-2和 siRNA-3組的INHA蛋白的表達(dá)量與正常組和NC組比較明顯降低（P＜0.01），其中siRNA-2組的蛋白表達(dá)量極顯著低于其他兩組（P＜0.01）。

圖4　轉(zhuǎn)染后的Western blot檢測(cè)結(jié)果

圖5　轉(zhuǎn)染后INHA蛋白的相對(duì)表達(dá)量

3　討論

繁殖性狀是家畜的重要經(jīng)濟(jì)性狀，也是畜牧業(yè)生產(chǎn)的主要經(jīng)濟(jì)性狀之一，尤其對(duì)于繁殖力低、繁殖周期和世代間隔長(zhǎng)的牛、羊等草食家畜而言，繁殖成本就占據(jù)總生產(chǎn)成本的60%～70%。因此，提高牛、羊等草食家畜繁殖力，對(duì)降低繁殖成本，提高養(yǎng)殖業(yè)經(jīng)濟(jì)效益，促進(jìn)我國(guó)畜牧業(yè)的快速發(fā)展具有重要的意義。動(dòng)物的繁殖性狀主要包括排卵數(shù)、產(chǎn)仔/羔數(shù)、精液品質(zhì)等因素，這些因素主要受自體激素水平、相關(guān)細(xì)胞因子以及相關(guān)基因的共同調(diào)控。大量研究表明，下丘腦-垂體-卵巢軸（hypothalamus-pituitary-ovarial axis，HPO）對(duì)卵泡發(fā)育、配子發(fā)生及胚胎發(fā)育等具有重要的調(diào)節(jié)作用。抑制素是HPO軸調(diào)控系統(tǒng)的重要調(diào)節(jié)激素，通過調(diào)節(jié)卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡/增殖對(duì)卵泡的正常生長(zhǎng)、分化及閉鎖起到刺激或抑制作用［15］。

RNA干擾（RNAinterference，RNAi）技術(shù)的主要目的是高效特異性降解目標(biāo)信使RNA（mRNA），阻斷翻譯蛋白質(zhì)的過程，從而抑制目標(biāo)基因的表達(dá)［16］。本研究對(duì)設(shè)計(jì)的3條抑制INHA基因表達(dá)的siRNA干擾質(zhì)粒進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，結(jié)果顯示，干擾后INHA基因的mRNA表達(dá)水平變化為，siRNA-1干擾質(zhì)粒使INHA基因的mRNA表達(dá)量下降了84%，siRNA-2干擾后，INHA基因的mRNA表達(dá)量?jī)H5.7%，siRNA-3干擾質(zhì)粒的干擾效率為68%；干擾后INHA蛋白的表達(dá)水平分別為，siRNA-1干擾質(zhì)粒使INHA蛋白的表達(dá)量下降了61%，siRNA-2干擾后，INHA蛋白表達(dá)量?jī)H6.6%，siRNA-3與siRNA-1的干擾效果差別不大，蛋白表達(dá)量43%。由此可見，不論是mRNA水平還是蛋白水平，siRNA-2質(zhì)粒對(duì)INHA基因的干擾效率都達(dá)到了最佳。為下一步體內(nèi)、外研究INHA基因的功能奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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Selection and Identification of siRNA against INHA Gene in Ovarian Granular Cells of Maguan Polled Goats

Fu Guowen，WangShaoqing，F(xiàn)an Yueyuan，et al
（College Animal Science&Technology，Yunnan Agriculture University，Kunming650201，China）

In order tostudythe role ofINHA gene in the follicular development ofMaguan polled goat，three siRNAagainst INHA gene were designed and synthesized，then these siRNA were transfected into the ovarian granular cells of goats via lipofectamine，and the interference efficiency were screened by Real-time PCR and Western-Blot.The results showed that the inhibition rate of siRNA-2 for INHA gene mRNA expression was 94.3%，and that for protein expression was 93.4%.So siRNA-2 is the best interference plasmid ofINHA gene silencing，and which can provide the basis for the studyofINHA gene function in the future.

Maguan polled goats；INHA gene；SiRNA

S827.3

A

2095-3887（2016）01-0015-04

10.3969/j.issn.2095-3887.2016.01.005

2015-11-25

云南省科技計(jì)劃面上項(xiàng)目（2012FB147）

富國(guó)文與王紹卿同為第一作者。富國(guó)文（1980-），男，在讀博士；王紹卿（1972-），男，碩士，副教授。

樊月圓（1979-），女，講師，博士，主要從事動(dòng)物遺傳育種與繁殖研究。