楊 浩，單媛媛，曹 舫，馬 瑛

(1.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，西安 710061；2．陜西省腫瘤醫(yī)院藥劑科，西安 710061)

?

·化學(xué)·

新型5-氟尿嘧啶前藥的合成與抗腫瘤活性研究

楊 浩1，2，單媛媛1，曹 舫2，馬 瑛1

(1.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，西安 710061；2．陜西省腫瘤醫(yī)院藥劑科，西安 710061)

目的 尋找新型、高效的5-氟尿嘧啶(5-Fu)前藥并測定其抗腫瘤活性。方法 在5-氟尿嘧啶的N1和N3位引入具有抗腫瘤活性的取代基，合成其前體藥物，利用MTT方法測定其對不同腫瘤細(xì)胞的增殖抑制活性。結(jié)果 合成的6個5-氟尿嘧啶前體藥物均顯示了較好的腫瘤細(xì)胞增殖抑制活性。結(jié)論 新型5-氟尿嘧啶前藥對腫瘤細(xì)胞有較好的抑制活性，值得進(jìn)一步研究。

5-氟尿嘧啶；前體藥物；抗腫瘤；腫瘤細(xì)胞株

惡性腫瘤已經(jīng)成為影響人類健康的主要疾病之一，人類因惡性腫瘤而引起的死亡率占所有疾病的第2位，僅次于心腦血管疾病[1]。目前惡性腫瘤的治療很大程度上仍以化療為主，但是化療藥物已經(jīng)從傳統(tǒng)的細(xì)胞毒性藥物逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂邪邢蛐郧覍δ[瘤細(xì)胞具有高選擇性的靶向小分子藥物[2-4]。5-氟尿嘧啶是最早廣泛應(yīng)用于治療惡性腫瘤的抗代謝類藥物之一，是胸腺嘧啶合成酶抑制劑。5-氟尿嘧啶抗腫瘤作用療效確切，但是5-氟尿嘧啶在體內(nèi)半衰期短，臨床使用一般需要靜脈持續(xù)灌注給藥，毒性和不良反應(yīng)較高，限制了其在臨床上的應(yīng)用[5]。因此，設(shè)計(jì)合成療效高、毒性和不良反應(yīng)低的氟尿嘧啶衍生物一直是研究的熱點(diǎn)之一。

阿托夫定是較早上市的5-氟尿嘧啶前體藥物，體內(nèi)代謝穩(wěn)定性好，能緩慢釋放5-氟尿嘧啶發(fā)揮抗腫瘤作用。本課題通過在5-氟尿嘧啶的N1和N3位引入具有抗腫瘤活性的小分子片段，進(jìn)而延長其在體內(nèi)的半衰期并增強(qiáng)其抗腫瘤活性。近年來研究發(fā)現(xiàn)，甲醛在增加抗腫瘤活性方面發(fā)揮著重要的作用，同時在誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化和死亡方面是一個關(guān)鍵的抗腫瘤因子。通過改變基因表達(dá)和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，能夠改善母體藥物的抗腫瘤活性[6]。二氯乙酸能夠通過轉(zhuǎn)移代謝從有糖酵解到葡萄糖氧化促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞生長[7]。在非毒性的藥物濃度下，丙戊酸能夠妨礙腫瘤細(xì)胞生長、誘導(dǎo)分化以及通過非毒性機(jī)制增加腫瘤細(xì)胞的免疫原性[8]。

為了克服5-氟尿嘧啶的缺點(diǎn)，我們在其結(jié)構(gòu)中引入具有抗腫瘤作用的小分子片段，如：甲醛、二氯乙酸和丙戊酸等，合成新型5-氟尿嘧啶前體藥物，使其在體內(nèi)能夠同時釋放具有不同作用機(jī)制的小分子及5-氟尿嘧啶，進(jìn)而對腫瘤細(xì)胞進(jìn)行多靶點(diǎn)作用?；钚院Y選結(jié)果顯示，我們所合成的5-氟尿嘧啶前體藥物均具有一定程度的抗腫瘤活性，為5-氟尿嘧啶前體藥物的研究開發(fā)奠定一定的基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器SGWX-4A型顯微熔點(diǎn)測定儀(溫度未經(jīng)校正，上海儀電物理光學(xué)儀器有限公司)；VarianunityINOVA-400MHz核磁共振儀(溶劑CDCl3，內(nèi)標(biāo)TMS，美國Varian公司)；Agilent1100MSD-Trap-VL質(zhì)譜儀(日本Agilent公司)。

1.2 試藥 合成試劑：5-氟尿嘧啶、2，2-二氯乙酰氯、乙酰氯、氯甲酸異丁酯、丙戊酰氯(南京多點(diǎn)化工)、吡啶、乙酸乙酯、無水硫酸鈉、乙醚、二氯甲烷和甲醛(天津科密歐)，所用試劑和溶劑均為分析純，按照常規(guī)方法處理。

1.3 材料 人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞(A549)、人肝癌細(xì)胞(7721)、人乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)和人結(jié)腸癌細(xì)胞(LOVO)細(xì)胞株，由西安交通大學(xué)藥學(xué)院天然藥物研究中心惠贈。

活性實(shí)驗(yàn)：RPMI1640粉末培養(yǎng)基、胎牛血清(Gibco公司)；牛胰島素(Sigma公司)；胰蛋白酶(北京華美生物工程公司)；青霉素和鏈霉素(華北制藥集團(tuán))。

2 方法

2.1 化合物的制備 所有目標(biāo)化合物均以5-氟尿嘧啶為起始原料，與不同的具有抗腫瘤活性片段?；频?。本文采用的具有抗腫瘤活性的酰化片段包括：2，2-二氯乙酰氯、乙酰氯、氯甲酸異丁酯和丙戊酰氯。我們設(shè)計(jì)的第1個系列5-氟尿嘧啶前體藥物是在N3位引入各種具有抗腫瘤活性的?；?，分別合成了N3-?；?-氟尿嘧啶前藥。這些前藥在體內(nèi)的代謝產(chǎn)物為活性抗腫瘤片段和5-氟尿嘧啶，通過在體內(nèi)釋放5-氟尿嘧啶使其保持相對穩(wěn)定的血藥濃度，從而克服5-氟尿嘧啶代謝穩(wěn)定性差的特性，同時代謝產(chǎn)生的活性小分子片段能夠協(xié)同發(fā)揮抗腫瘤作用，具體合成路線見圖1。

圖1 5-氟尿嘧啶的N1取代前體藥物合成路線

Fig.1ThesynthesisrouteofN1replaceprecursordrugsof5-Fu

2.1.1 N3-乙?；?5-氟尿嘧啶(FU-1)的制備 冰浴條件下，將2.60g(20mmol) 5-氟尿嘧啶的吡啶溶液(48mL)在10min內(nèi)逐滴加入到40mmol(5.70mL)乙酰氯的吡啶溶液(15mL)中。滴加完成后，混合物在室溫條件下反應(yīng)3h[9]。TLC檢測反應(yīng)進(jìn)程，待反應(yīng)完全后，將混合物倒入冰水中，用乙酸乙酯萃取，水洗有機(jī)相，無水硫酸鈉干燥。減壓蒸除溶劑后得粗品，乙醚重結(jié)晶得到白色固體(2.30g，產(chǎn)率67.0%)，熔點(diǎn)：112～114 ℃。ESI/MS(m/z):173.1 [M+H]；1H-NMR(400MHz，CDCl3) δ 2.61 (s，3H)，7.31 (d，J=7.0Hz，1H)。

2.1.2 N3-二氯乙?；?5-氟尿嘧啶(FU-2)的制備 冰浴條件下，將2.60g(20mmol) 5-氟尿嘧啶的吡啶溶液(48mL)在10min內(nèi)逐滴加入到40mmol(3.85mL) 2，2-二氯乙酰氯的吡啶溶液(10mL)中。滴加完成后，混合物在室溫條件下反應(yīng)6h。TLC檢測反應(yīng)進(jìn)程，待反應(yīng)完全后，將混合物倒入冰水中，用乙酸乙酯萃取，水洗有機(jī)相，無水硫酸鈉干燥。減壓蒸除溶劑后得粗品，乙醚重結(jié)晶得到白色固體(2.55g，產(chǎn)率53.0%)，熔點(diǎn)：185～187 °C。ESI/MS(m/z): 241.2 [M+H]；1H-NMR(400MHz，CDCl3) δ 7.68 (d，J=7.0Hz，1H)，7.15 (s，1H)。

2.1.3 N3-丙戊?；?5-氟尿嘧啶(FU-3)的制備 冰浴條件下，將0.39g(3mmol) 5-氟尿嘧啶的吡啶溶液(10mL)在10min內(nèi)逐滴加入到5mmol丙戊酰氯的吡啶溶液(5mL)中。滴加完成后，混合物在室溫條件下反應(yīng)8h。TLC檢測反應(yīng)進(jìn)程，待反應(yīng)完全后，將混合物倒入冰水中，用乙酸乙酯萃取，水洗有機(jī)相，無水硫酸鈉干燥。減壓蒸除溶劑后得粗品，乙醚重結(jié)晶得到白色固體(2.55g，產(chǎn)率53.0%)，熔點(diǎn)：101～102 ℃。ESI/MS(m/z): 257.3 [M+H]；1H-NMR(400MHz，CDCl3) δ 7.88 (d，J=6.7Hz，1H)，2.52～1.55 (m，4H)，1.58～1.62 (m，4H)，1.50～1.54 (m，4H)，1.07 (t，J=6.4Hz，6H)。

2.1.4 N3-異丁氧甲酰-5-氟尿嘧啶(FU-4)的制備 冰浴條件下，將24mmol氯甲酸異丁酯的吡啶溶液(10mL) 在10min內(nèi)逐滴加入到2.60g(20mmol) 5-氟尿嘧啶的吡啶溶液(35mL)中。滴加完成后，混合物在室溫條件下反應(yīng)7h。TLC檢測反應(yīng)進(jìn)程，待反應(yīng)完全后，將混合物倒入冰水中，用乙酸乙酯萃取，水洗有機(jī)相，無水硫酸鈉干燥。減壓蒸除溶劑后得粗品，二氯甲烷重結(jié)晶得到白色固體(3.27g，產(chǎn)率71.0%)，熔點(diǎn)：172～174 ℃。ESI/MS(m/z): 231.1 [M+H]；1H-NMR(400MHz，CDCl3) δ 8.22 (d，J=6.0Hz，1H)，4.07 (d，J=6.7Hz，1H)，2.12～1.33 (m，1H)，1.08 (t，J=6.6Hz，6H)。

甲醛是一種高度有毒的化合物，近年來研究發(fā)現(xiàn)，甲醛在增加抗腫瘤活性方面有重要作用，能夠誘導(dǎo)癌細(xì)胞分化。此外，甲醛能夠改變癌基因表達(dá)和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而增強(qiáng)母體藥物的抗腫瘤活性。因此，我們將甲醛與5-氟尿嘧啶反應(yīng)得到1，3-二羥甲基-5-氟尿嘧啶，進(jìn)而在其結(jié)構(gòu)式引入具有抗腫瘤活性的?；?，化合物合成路線見圖2。

圖2 5-氟尿嘧啶的N3取代前體藥物合成路線

Fig.2ThesynthesisrouteofN3replaceprecursordrugsof5-Fu

2.1.5 N1-乙酰氧亞甲基-5-氟尿嘧啶(FU-5)的制備 將0.52g的 5-氟尿嘧啶(4mmol)加入到5mL體積分?jǐn)?shù)為37%的甲醛水溶液中。混合物在60 ℃條件下攪拌至固體完全溶解，繼續(xù)在60 ℃條件下反應(yīng)1h。減壓蒸除溶劑和過量甲醛，得到無色透明油狀物，為1，3-二羥甲基-5-氟尿嘧啶[10]。ESI/MS(m/z): 191.0 [M+H]；1H-NMR(400MHz，CDCl3) δ 7.78 (d，J=6.0Hz，1H)，5.38(s，2H)，5.40(s，2H)。

將上述油狀物溶于10mL吡啶中，冰浴條件下再向吡啶溶液中緩慢滴加8mmol(1.14mL)乙酰氯的吡啶溶液(10mL)。滴加完成后，混合物在室溫條件下反應(yīng)7h。TLC檢測反應(yīng)進(jìn)程，待反應(yīng)完全后，將混合物倒入冰水中，用乙酸乙酯萃取，水洗有機(jī)相，無水硫酸鈉干燥。減壓蒸除溶劑后得粗品，乙醚重結(jié)晶得到白色固體(0.44g，產(chǎn)率54.0%)，熔點(diǎn)：125～127 ℃。ESI/MS(m/z): 203.1 [M+H]；1H-NMR(400MHz，CDCl3) δ 7.83(d，J=6.0Hz，1H)，5.72 (s，2H)， 2.08(s，3H)。

2.1.6 N1-乙酰氧亞甲基-5-氟尿嘧啶(FU-6)的制備 將上述油狀物溶于10mL吡啶中，冰浴條件下再向吡啶溶液中緩慢滴加8mmol2，2-二氯乙酰氯的吡啶溶液(10mL)。滴加完成后，混合物在室溫條件下反應(yīng)8h[11]。TLC檢測反應(yīng)進(jìn)程，待反應(yīng)完全后，將混合物倒入冰水中，用乙酸乙酯萃取，水洗有機(jī)相，無水硫酸鈉干燥。減壓蒸除溶劑后得粗品，乙醚重結(jié)晶得到白色固體(0.66g，產(chǎn)率61.0%)，熔點(diǎn)：189～191 ℃。ESI/MS(m/z): 271.1 [M+H]；1H-NMR(400MHz，CDCl3) δ 8.03 (d，J=5.7Hz，1H)，7.12 (s，2H)。

2.2 體外抗腫瘤活性篩選 采用MTT方法測定所合成的6個5-氟尿嘧啶前體藥物對人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞(A549)、人肝癌細(xì)胞(7721)、人乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)和人結(jié)腸癌細(xì)胞(LOVO)的體外抗腫瘤活性，以5-氟尿嘧啶為陽性對照[12]。將處于對數(shù)生長期的腫瘤細(xì)胞用質(zhì)量濃度為2.5g·L-1的胰酶消化后稀釋成2×104·mL-1，在96孔板中每孔加入100μL，在37 ℃下孵育24h。在每孔中加入不同濃度的待測化合物及相應(yīng)溶劑對照的新鮮培養(yǎng)基，每孔加100μL(DMSO終濃度<0.5%)，每個化合物設(shè)6個濃度梯度，每組設(shè)3個復(fù)孔。37 ℃培養(yǎng)48h后，棄上清液，每孔加入20μLMTT溶液(質(zhì)量濃度為5mg·mL-1)，繼續(xù)在37 ℃下孵育4h，棄去上清液，每孔加入200μL的DMSO溶解甲簪沉淀，用微型振蕩器振蕩混勻，用酶標(biāo)儀在參考波長450nm，檢測波長570nm條件下測定每孔的吸光度，分別計(jì)算其抑制率和IC50。

3 結(jié)果

6個5-氟尿嘧啶前體藥物對4種腫瘤細(xì)胞株的增殖抑制活性結(jié)果見表1。活性篩選結(jié)果表明，這6種前體藥物對4種常見的人腫瘤細(xì)胞均具有不同程度的增殖抑制活性。對于人肝癌細(xì)胞7721來說，F(xiàn)U-6的抗腫瘤活性最好；此外，F(xiàn)U-6對人肺癌細(xì)胞(A549)和乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)的抑制活性也是最好的，特別是對乳腺癌細(xì)胞，其抗腫瘤活性優(yōu)于5-氟尿嘧啶，IC50值為5.06μmol·L-1，有較好的發(fā)展前景。在我們設(shè)計(jì)、合成的6個化合物中，化合物FU-6在抗肺癌和結(jié)腸癌藥物的研究中具有一定的發(fā)展前景。見表1。

表1 5-氟尿嘧啶前體藥物對不同腫瘤細(xì)胞株的抗增殖活性

Tab.1Theanti-proliferativeactivityof5-Fuprecursordrugsindifferenttumorcelllines

化合物7721細(xì)胞IC50/μmol·L-1A549細(xì)胞IC50/μmol·L-1MCF-7細(xì)胞IC50/μmol·L-1LOVO細(xì)胞IC50/μmol·L-1FU-156.9363.4814.2819.21FU-296.1243.2720.6629.69FU-3168.9395.576.5680.69FU-438.9257.4014.3059.37FU-557.79350.9611.52140.99FU-624.1529.615.0626.725-Fu7.0113.6021.7116.30

4 小結(jié)

在本文中我們設(shè)計(jì)、合成了6個5-氟尿嘧啶前體藥物，初步的體外抗腫瘤活性篩選結(jié)果表明，這6個前體藥物對于4種常見的人腫瘤細(xì)胞均具有一定程度的增殖抑制活性。特別是對人乳腺癌細(xì)胞MCF-7的抑制活性均優(yōu)于陽性對照，進(jìn)一步的體內(nèi)抗腫瘤活性篩選實(shí)驗(yàn)正在進(jìn)行中。研究結(jié)果表明,這一類新型含抗腫瘤片段的5-氟尿嘧啶前體藥物具有較好的應(yīng)用前景。

5-氟尿嘧啶一般需要靜脈持續(xù)給藥，給患者帶來極大的不便和痛苦。藥物消除動力學(xué)的非線性特性，使得患者自身或者患者之間會出現(xiàn)明顯的個體差異，這些都限制了5-氟尿嘧啶的臨床效果。因此，尋找代謝穩(wěn)定、半衰期長、療效好且毒性低的新型5-氟尿嘧啶前體藥物，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)新一代氟尿嘧啶類抗腫瘤藥物，具有十分廣闊的應(yīng)用前景。

[1] 王永川，魏麗娟，劉俊田，等.發(fā)達(dá)與發(fā)展中國家癌癥發(fā)病率與死亡率的比較與分析[J].中國腫瘤臨床，2012，39(10):679-682.

[2] 孫燕.腫瘤治療的新里程碑——靶向藥物治療[J].腫瘤藥學(xué)，2011，1(1):1-5.

[3] 馬瑛，田薇，楊浩.氟脲嘧啶微球的研制[J].西北藥學(xué)雜志，1996，11(3):121-122.

[4] 連佳芳，張三奇.5-氟尿嘧啶劑型研究進(jìn)展[J].西北藥學(xué)雜志，2005，20(5):238-240.

[5] 閆美興，徐文方，李德愛.5-Fu多級前體藥物的設(shè)計(jì)合成與體內(nèi)抗腫瘤作用[J].中國新藥雜志，2006，15(13):1067-1070.

[6]EngelD，NudelmanA，TarasenkoN，etal.Novelprodrugsoftegafurthatdisplayimprovedanticanceractivityandantiangiogenicproperties[J].JMedChem,2008，51(2):314-323.

[7]KametaniT，KigasawaK，HiiragiM，etal.Studiesonthesynthesisofchemotherapeutics.10.SynthesisandantitumoractivityofN-acylandN-(alkoxycarbonyl)-5-fluorouracilderivatives[J].JMedChem,1980，23(12):1324-1329.

[8]PhillipsA，BullockT，PlantN.Sodiumvalproateinducesapoptosisintherathepatomacellline，F(xiàn)aO[J].Toxicology，2003，192(2/3): 219-227.

[9]KametaniT，KigasawaK，HiiragiM，etal.Studiesonthesynthesisofchemotherapeutics.12.SynthesisandantitumoractivityofN-Phthalidyl-5-fluorouracilderivatives[J].JMedChem，1982，25(10):1219-1222.

[10]OuyangL，HeD，ZhangJ，etal.Selectivebonetargeting5-fluorouracilprodrugs:synthesisandpreliminarybiologicalevaluation[J].BioorgMedChem， 2011，19(12): 3750-3756.

[11]蔣慶琳，吳林艷，吳勇.N1-(芳)烷酰氧亞甲基-5-氟尿嘧啶的合成及其初步抗腫瘤活性的研究[J].華西藥學(xué)雜志，2005，20(1):12-14.

[12]秦愛方，李燕，宋宏銳，等.含吡啶-2-酰肼結(jié)構(gòu)的索拉非尼類似物的設(shè)計(jì)、合成及其抗腫瘤活性[J].藥學(xué)學(xué)報(bào)，2012，47(12):1623-1629.

Synthesis and anticancer evaluation of 5-fluorouracil prodrugs

YANGHao1，2，SHANYuanyuan1，CAOFang2，MAYing1*

(1.DepartmentofPharmacy，theFirstAffiliatedHospitalofXi′anJiaotongUniversity，Xi′an710061，China；2.DepartmentofPharmacy，ShaanxiProvincinalTumorHospital，Xi′an710061，China)

ObjectiveTosynthesizeandevaluatenovelandpotentprodrugsof5-fluorouracil(5-Fu).MethodsSixprodrugsof5-FuwerepreparedbyincorporatedvarioussubstituentsonN1andN3position.Thein vitroantiproliferativeactivityagainstfivecancercelllineswasevaluatedbyMTTassay.ResultsAllthesixprodrugsof5-Fudisplayedpotentantiproliferativeactivityagainstcancercelllines.ConclusionThesenovelprodrugsexhibitedpotentanticanceractivity，andwereworthoffurtherinvestigation.

5-fluorourail；prodrugs；anticancer；cancercelllines

陜西省社會發(fā)展攻關(guān)項(xiàng)目(編號：2013K14-02-08)

楊浩，男，副主任藥師

*通信作者：馬瑛，女，碩士，主任藥師

10.3969/j.issn.1004-2407.2016.06.018

R

A

2016-02-27)