仲韻

南京醫(yī)科大學(xué)附屬淮安第一醫(yī)院老年科，江蘇淮安223300

單色多重?zé)晒鈱?shí)時(shí)定量PCR測(cè)定端粒長(zhǎng)度

仲韻

南京醫(yī)科大學(xué)附屬淮安第一醫(yī)院老年科，江蘇淮安223300

目的在羅氏LightCycler 480上建立單色多重?zé)晒鈱?shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（MMQPCR）方法測(cè)定端粒長(zhǎng)度。方法在羅氏480定量PCR儀上使用MMQPCR方法測(cè)定39例人外周血白細(xì)胞端粒長(zhǎng)度（相對(duì)T/S比值），并與DNA印跡法（Southern blot）測(cè)得的平均末端限制性片段（TRF）長(zhǎng)度作比較。結(jié)果MMQPCR方法測(cè)定端粒長(zhǎng)度相對(duì)T/S比值為1.13依0.21，Southern blot方法測(cè)量平均TRF長(zhǎng)度為（7.46依1.21）kb，兩種方法測(cè)定結(jié)果的相關(guān)性分析R2=0.6706（P<0.001）。結(jié)論本研究建立的MMQPCR方法測(cè)定端粒長(zhǎng)度重復(fù)性好、省時(shí)、簡(jiǎn)便、可靠，可高通量處理大量樣品。

端粒長(zhǎng)度；多重定量PCR；T/S比值；末端限制性片段

有研究表明，端粒長(zhǎng)度是生物學(xué)老化的標(biāo)志[1]，端?？s短被認(rèn)為與多種心腦血管病的發(fā)生及進(jìn)展有關(guān)[2-5]。端粒長(zhǎng)度的測(cè)定方法最早由Harley等[6]在1990年提出，即通過(guò)Southern blot測(cè)定末端限制性片段（TRF）的長(zhǎng)度，該方法雖然過(guò)程繁瑣，所需DNA量大，但至今仍是端粒長(zhǎng)度測(cè)量方法的野金標(biāo)準(zhǔn)冶。隨后人們提出了定量熒光原位雜交（Q-FISH）[7]和建立流式熒光原位雜交（Flow-FISH）[8]（流式熒光原位雜交）。2002年，Cawthon[9]首創(chuàng)了熒光定量PCR測(cè)定端粒相對(duì)長(zhǎng)度的方法，即通過(guò)計(jì)算端粒拷貝數(shù)（T）與單拷貝基因拷貝數(shù)（S）的比值T/S來(lái)反映平均端粒長(zhǎng)度，但該方法中端粒DNA和單拷貝基因的擴(kuò)增是在不同的反應(yīng)管中進(jìn)行，使得模板起始量的不同對(duì)結(jié)果的變異產(chǎn)生重要影響，為解決這一問(wèn)題，2009年，Cawthon[9]還提出了單色多重定量PCR方法（MMQPCR）[10]。該方法對(duì)熒光定量PCR儀有一定要求，即能夠在一個(gè)循環(huán)中兩次收集SYBR Green熒光信號(hào)，而國(guó)內(nèi)外實(shí)驗(yàn)室使用較多的ABI系列如7900HT、7700等無(wú)此功能。因此，目前研究者仍普遍采用Cawthon[11]于2002年提出的定量PCR方法測(cè)定端粒長(zhǎng)度。羅氏480（LightCycler480）熒光實(shí)時(shí)定量PCR儀被廣泛應(yīng)用于診斷和研究，但文獻(xiàn)中較少見(jiàn)到其被用于測(cè)定端粒長(zhǎng)度[11-13]，本文參照Cawthon[9]2009提出的MMQPCR，優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中的參數(shù)，闡述在羅氏480實(shí)時(shí)定量PCR儀上建立MMQPCR的過(guò)程，并與傳統(tǒng)的Southern b lot方法測(cè)量平均TRF長(zhǎng)度作相關(guān)性分析。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)標(biāo)本選自2013年11月1~30日南京醫(yī)科大學(xué)附屬淮安第一醫(yī)院（以下簡(jiǎn)稱(chēng)野我院冶）檢驗(yàn)科體檢者的肘靜脈新鮮EDTA抗凝血2 mL，共40例，其中男19例，女21例，年齡38~79歲，平均（61.46依11.58）歲。本研究獲得我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查通過(guò)，所有入選者均簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1 單色多重?zé)晒鈱?shí)時(shí)定量PCR測(cè)定端粒長(zhǎng)度使用富士核酸提取系統(tǒng)提取基因組DNA，操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。微量紫外分光光度計(jì)測(cè)DNA的濃度與純度，OD260/280為1.7~1.9為合格，記錄DNA的濃度。使用TB緩沖液將待測(cè)樣本DNA濃度稀釋至7 ng/滋L，任意選取一樣本作為標(biāo)準(zhǔn)品，使用Milli-Q超純水按1︰2.5的比例將標(biāo)準(zhǔn)品DNA濃度依次等比稀釋為45、18、7.2、2.88、1.152 ng/滋L，并放于-20益冰箱保存?zhèn)溆谩６肆ｉL(zhǎng)度的測(cè)定參照Cawthon2009年提出的MMQPCR[7]。反應(yīng)使用的引物由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成，序列如下院telg 5憶-ACAC-TAAGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTAGTGT-3憶；telc 5憶-TGTTAGGTATCCCTATCCCTATCCCTATC-CCTATCCCTAACA-3憶；hbgu 5憶-CGGCGGCGGGCG-GCGCGGGCTGGGCGGCTTCATCCACGTTCACCTTG-3憶；hbgd 5憶-GCCCGGCCCGCCGCGCCCGTCCCGCCG-GAGGAGAAGTCTGCCGTT-3憶。反應(yīng)體系院SYBR Green玉Master（羅氏公司）7.5滋L，樣本DNA 5滋L（待測(cè)樣本DNA含量為35 ng，標(biāo)準(zhǔn)品含量依次為225、90、36、14.4、5.76 ng），端粒引物telg、telc終濃度均為500 nmol/L；單拷貝基因引物HBGU、HBGD終濃度均為200 nmol/L。反應(yīng)在同一塊384孔板上進(jìn)行，標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣本均設(shè)置3復(fù)孔，另外設(shè)置以相同體積的超純水作為DNA的陰性對(duì)照，亦為3個(gè)復(fù)孔。使用儀器為L(zhǎng)ightCycler 480實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（羅氏公司）。反應(yīng)條件為玉院95益15 min；域院94益15 s，49益15 s，2個(gè)循環(huán)；芋院94益15 s，62益10 s，74益15 s，84益10 s，85益15 s，38個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后建立熔解曲線(xiàn)。從LightCycler480v1.5拷出原始數(shù)據(jù)，使用軟件野Conversion from LightCycler480 to Lin-RegPCR冶將其轉(zhuǎn)換并導(dǎo)入LinRegPCR（v12.15）軟件進(jìn)行分析。

1.2.2 Southe rn b l o t測(cè)量平均TRF長(zhǎng)度實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)待測(cè)DNA的完整性，使用羅氏試劑盒TeloTAGGG Telomere Length Assay（羅氏公司）完成平均TRF的測(cè)定，瓊脂糖、尼龍膜亦購(gòu)于該公司，實(shí)驗(yàn)參照試劑盒提供的步驟進(jìn)行。具體為院限制性?xún)?nèi)切酶Hinf I和Rsa I酶切基因組DNA（1.2μg，包括試劑盒提供的對(duì)照DNA）2 h，將酶切DNA連同地高辛標(biāo)記的marker放于0.8%瓊脂糖凝膠中以5V/cm的電壓電泳10 cm，使用毛細(xì)管轉(zhuǎn)移法將DNA轉(zhuǎn)移至帶正電荷尼龍膜上，120益烘烤30 min，使用試劑盒提供的雜交液42益預(yù)雜交1 h后，用地高辛標(biāo)記的端粒探針42益雜交3 h，洗膜后，加入顯影底液，并將尼龍膜放入LAS-4000數(shù)字成像系統(tǒng)中進(jìn)行連續(xù)曝光，曝光時(shí)間15~20min，選擇曝光強(qiáng)度最適宜的一張照片進(jìn)行TRF長(zhǎng)度測(cè)定。使用圖像處理軟件Image J（v1.44p），根據(jù)公式TRF=移（ODi）/移（ODi/Li）計(jì)算平均TRF長(zhǎng)度。其中，ODi表示位置i的光密度值，Li表示位置i的marker長(zhǎng)度，不同批次的結(jié)果根據(jù)control DNA進(jìn)行校正。

1.3 觀察指標(biāo)

淤觀察PCR產(chǎn)物的熔解曲線(xiàn)、端粒與單拷貝基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)；于觀察T/S比值的重復(fù)性，計(jì)算批內(nèi)變異系數(shù)及批間變異系數(shù)；盂分析T/S比值與平均TRF長(zhǎng)度的相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 熔解曲線(xiàn)、標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)及相對(duì)T/S比值的計(jì)算

PCR產(chǎn)物的熔解曲線(xiàn)如圖1所示，熔解曲線(xiàn)為兩個(gè)完全分開(kāi)的雙峰，Tm值分別為78益和91益，分別為端粒擴(kuò)增產(chǎn)物和單拷貝基因擴(kuò)增產(chǎn)物。分別計(jì)算各個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)品端粒和單拷貝基因的平均Ct值，并以DNA含量的對(duì)數(shù)值log[DNA]作橫坐標(biāo)，以Ct值作縱坐標(biāo)，在Microsoft Excel中繪制端粒和單拷貝基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得出R2值和公式（圖2）。從圖中可以看出，端粒和單拷貝基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)R2均>0.99，且兩條標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)幾乎平行，說(shuō)明端粒和單拷貝基因擴(kuò)增效率相近，提示在225~5.76 ng范圍內(nèi)，使用該標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算待測(cè)樣本的端粒長(zhǎng)度可靠。將各個(gè)待測(cè)樣本的原始Ct值代入公式，進(jìn)行冪轉(zhuǎn)換，得到每個(gè)待測(cè)樣本相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)品的端粒的納克數(shù)（T）和單拷貝基因的納克數(shù)（S），最后計(jì)算3個(gè)復(fù)孔T/S比值的平均值，即得到每個(gè)待測(cè)樣本相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)品的T/S比值。

圖1 PCR產(chǎn)物熔解曲線(xiàn)

圖2 端粒和單拷貝基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

2.2 T/S比值的重復(fù)性檢驗(yàn)

計(jì)算每個(gè)待測(cè)樣本3個(gè)復(fù)孔T/S比值的變異系數(shù)，然后計(jì)算39個(gè)樣本變異系數(shù)的幾何均數(shù)，得出批內(nèi)變異系數(shù)為2.9%。為了檢驗(yàn)該MMQPCR方法的批間重復(fù)性，同樣的39個(gè)樣本于第2天進(jìn)行重復(fù)測(cè)量，仍為3個(gè)復(fù)孔，且保證每個(gè)樣本在384孔板上的位置與前一次不同，以減少位置效應(yīng)。兩次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)各個(gè)樣本T/S均值的相關(guān)性見(jiàn)圖3，可以發(fā)現(xiàn)線(xiàn)性回歸線(xiàn)的斜率接近于1，且在Y軸上的截距接近于零。計(jì)算兩次實(shí)驗(yàn)每對(duì)樣本T/S比值的變異系數(shù)，最后求得39對(duì)樣本變異系數(shù)的幾何均數(shù)，即批間變異系數(shù)為3.4%。

圖3 相同樣本兩次實(shí)驗(yàn)所得T/S均值的相關(guān)性

2.3 T/S比值與平均TRF長(zhǎng)度的相關(guān)性分析

計(jì)算39個(gè)樣本DNA的平均T/S比值為1.13依0.21，平均TRF長(zhǎng)度為（7.46依1.21）kb，從圖4可以看出兩種不同方法測(cè)得的結(jié)果存在明顯相關(guān)性（R2= 0.6706，P<0.001）。

圖4 相對(duì)T/S比值與平均TRF長(zhǎng)度的相關(guān)性

3 討論

MMQPCR將端粒和單拷貝基因置于同一個(gè)反應(yīng)管中擴(kuò)增，利用端粒和單拷貝基因豐度和產(chǎn)物Tm值的差異，使用SYBR Green染料在一個(gè)循環(huán)中順序收集端粒熒光信號(hào)和單拷貝基因熒光信號(hào)。該方法與傳統(tǒng)多重PCR不同的是兩個(gè)目標(biāo)基因的擴(kuò)增并不是同時(shí)進(jìn)行。端粒首先擴(kuò)增并在74益收集信號(hào)，由于端粒的豐度遠(yuǎn)比單拷貝基因高，此時(shí)單拷貝基因的Ct值仍在基線(xiàn)水平以下，因此74益的Ct值僅代表端粒。溫度繼續(xù)升高到85益，因?yàn)榇藭r(shí)端粒產(chǎn)物已完全解鏈，釋放DNA聚合酶用于單拷貝基因的擴(kuò)增，由于單拷貝基因引物5憶端被加了野GC鉗冶，提高了退火溫度，使其在85益仍能擴(kuò)增，因此此時(shí)收集的熒光僅代表單拷貝基因產(chǎn)物。該方法與之前的PCR方法比較，試劑和模板用量以及時(shí)間均減少了一半，更為重要的是消除了模板起始量不同對(duì)結(jié)果產(chǎn)生的影響，減少了批內(nèi)誤差。

擴(kuò)增效率是影響定量PCR可靠性的最重要因素[14]，由于實(shí)時(shí)定量PCR通過(guò)Ct值來(lái)計(jì)算模板的起始量，因此所有樣本的擴(kuò)增效率一致顯得很重要。端粒的定量PCR利用兩個(gè)基因的擴(kuò)增來(lái)計(jì)算端粒長(zhǎng)度，其中任何一個(gè)都有可能存在效率誤差，因而對(duì)效率誤差尤為敏感。有文獻(xiàn)報(bào)道了端粒定量PCR可接受的效率范圍為95%~103%[16]，但這個(gè)范圍只是象征性的，如果所有的樣本的擴(kuò)增效率一致，具體的數(shù)值并不重要，80%和100%一樣可靠，因?yàn)閷?dǎo)致效率誤差的是樣本之間擴(kuò)增效率的差別[15]。另一個(gè)與擴(kuò)增效率有關(guān)的問(wèn)題與標(biāo)準(zhǔn)品有關(guān)。端粒定量PCR通過(guò)外部標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法計(jì)算端粒長(zhǎng)度，一般來(lái)說(shuō)應(yīng)使用任一個(gè)待測(cè)樣本，或多個(gè)樣本的混合作為標(biāo)準(zhǔn)品。因?yàn)樵谘獦颖镜谋４婕癉NA的提取過(guò)程中有很多化學(xué)物質(zhì)可抑制PCR反應(yīng)，如乙醇、酚、EDTA等[17]，而標(biāo)準(zhǔn)品與待測(cè)樣本來(lái)源相同可以控制抑制因子對(duì)PCR的影響，從而減少標(biāo)準(zhǔn)品與待測(cè)樣本之間的效率誤差[15]。相反，使用購(gòu)買(mǎi)的高度純化的標(biāo)準(zhǔn)品[18]和來(lái)自細(xì)胞系的標(biāo)準(zhǔn)品[19-20]則不能消除抑制因子的影響。

本實(shí)驗(yàn)在羅氏LightCycler480熒光定量PCR儀上進(jìn)行端粒與單拷貝基因的擴(kuò)增，利用LinRegPCR軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，解決了儀器自帶軟件無(wú)法分析數(shù)據(jù)的問(wèn)題，從而拓寬了MMQPCR方法測(cè)定端粒長(zhǎng)度的應(yīng)用范圍。與傳統(tǒng)的Southern blot方法比較，MMQPCR方法具有省時(shí)、簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，可高通量處理大量樣品。

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Telomere length measurem ent by m onochrom e m ultip lex quantitative PCR m ethod

ZHONG Yun
Department of Geriatrics,Huai憶an First People憶s Hospital,Nanjing Medical University,Jiangsu Province,Huai憶an 223300,China

Ob jective To establish amonochromemultiplex real-time quantitative polymerase chain reaction(MMQPCR), for telomere lengthmeasurementon theRoche LightCycler480(LC480)real-time PCR platform.M ethods Telomere lengths (T/S ratio)weremeasured from 39 DNA samples extracted from human white blood cells using the MMQPCR method on the LC480 platform,and were compared with terminal restriction fragment(TRF)lengthsmeasured by Southern blot. Results Relative T/S ratiomeasured by MMQPCR was 1.13依0.21,and mean TRF length was(7.46依1.21)kb.The cor-relation coefficient(R2)for the relationship of the two differentmethodswas 0.6706(P<0.001).Conclusion The MM-PQPCR method is reproducible,rapid,and simple,thus reliable for a high throughput of samples.

Telomere length;Multiplex quantitative PCR;T/S ratio;Terminal restriction fragment

R34

A

1673-7210（2016）07（a）-0014-04

院2016-03-21本文編輯院任念）

仲韻（1988.10-），女，碩士；研究方向院心腦血管病患者生物標(biāo)志物研究。