亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        ShRNA靶向沉默STX 8基因?qū)251細(xì)胞增殖和遷移侵襲的影響

        2016-11-22 07:27:11楊海峰楊亮畢艷華黃淑紅
        中國醫(yī)藥導(dǎo)報 2016年19期
        關(guān)鍵詞:實驗能力

        楊海峰 楊亮 畢艷華 黃淑紅

        1.北京市仁和醫(yī)院神經(jīng)外科,北京102600;2.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)外科,河北石家莊050000;3.華北石油管理局總醫(yī)院科研教學(xué)培訓(xùn)科,河北任丘062550;4.山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)生物學(xué)系,山東濟南250012

        ShRNA靶向沉默STX 8基因?qū)251細(xì)胞增殖和遷移侵襲的影響

        楊海峰1楊亮2畢艷華3黃淑紅4

        1.北京市仁和醫(yī)院神經(jīng)外科,北京102600;2.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)外科,河北石家莊050000;3.華北石油管理局總醫(yī)院科研教學(xué)培訓(xùn)科,河北任丘062550;4.山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)生物學(xué)系,山東濟南250012

        目的探討敲低STX8基因?qū)δX膠質(zhì)瘤細(xì)胞瘤U251細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響。方法構(gòu)建STX8-shRNA-pSuper表達載體轉(zhuǎn)染U251細(xì)胞,分別用CCK8法、劃痕實驗、Transwell實驗檢測細(xì)胞增殖、遷移侵襲能力。結(jié)果CCK8法、劃痕實驗、Transwell實驗結(jié)果顯示,STX8干擾后細(xì)胞增殖、遷移侵襲能力顯著下降。結(jié)論STX8基因的敲低能有效抑制U251細(xì)胞增殖、遷移侵襲能力,STX8基因有可能成為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤基因治療的新靶點。

        STX 8基因;膠質(zhì)細(xì)胞瘤;RNA干擾;U251細(xì)胞

        腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的原發(fā)性腫瘤之一,目前臨床治療手段療效有限[1-2],需要迫切尋找其關(guān)鍵致癌因子。近年來,研究發(fā)現(xiàn)SNARE蛋白在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用,其相關(guān)蛋白能否作為腫瘤治療的分子靶點也受到了很多關(guān)注[3-5]。成員之一Syntaxin8(STX8)參與了膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的發(fā)展[3]。目前尚未有STX8在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中參與哪些細(xì)胞功能的研究,本文通過分析腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251中STX8的作用,探討其在腦膠質(zhì)瘤中的發(fā)生發(fā)展和侵襲的意義。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        pSuper院OligoEngine公司,STX8抗體院BD Bio-sciences公司,茁-tubulin抗體院Sigma公司,HEK293細(xì)胞為實驗室保存,U251細(xì)胞系院中科院上海細(xì)胞庫。

        1.2 載體構(gòu)建及篩選

        將干擾序列溶解至3μg/滋L,取正反oligo各1滋L,溶于48滋L退火buffer。靶序列院1#GACCGAAGACA-GAACCTCTTGCTC;2#ATACGATTCTACTTGT-

        CAAATCTC。退火產(chǎn)物及載體(pSuper)酶切、連接、轉(zhuǎn)化、測序。使用測序成功的2個pSuper-STX8干擾質(zhì)粒(1#,2#)分別轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,為pSuper-STX8干擾組。空載體作為陰性對照。

        1.3 RT-PCR

        收集pSuper-STX8干擾組和陰性對照組細(xì)胞提RNA,反轉(zhuǎn)錄cDNA。STX8引物F院5ˊ-GAGGAGCCA-GAGGAGACCAG-3ˊ,R院5ˊ-TAGAGGAAAGGGCAT-CAAGG-3ˊ;內(nèi)參GAPDH引物F院5ˊ-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3ˊ,R院5ˊ-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3ˊ。反應(yīng)體系院模板cDNA 2滋L,2伊SYBRPremix Ex TaqTM域10滋L,引物(F+R)0.8滋L+ 0.8滋L,ddH2O 6.4滋L。反應(yīng)條件院95益預(yù)變性5min,95益變性15 s,60益退火延伸30 s,40個循環(huán)。重復(fù)3次,2-駐駐Ct分析法進行分析。

        1.4 W estern blot

        轉(zhuǎn)染48 h后收集pSuper-STX8干擾組和陰性對照組細(xì)胞提取蛋白BCA法測定濃度。剩余蛋白進行電泳,SDS-PAGE電泳后電轉(zhuǎn)至PVDF膜,5%脫脂奶粉封閉1 h,加一抗(1︰1000),4益孵育過夜,加二抗(1︰5000),孵育1h,電化學(xué)發(fā)光法(ECL)顯色。采用Image J分析圖像,以STX8/茁-tubulin灰度比值表示STX8蛋白的相對表達水平。

        1.5 CCK8實驗

        電轉(zhuǎn)U251細(xì)胞,轉(zhuǎn)染24 h后取pSuper-STX8干擾組和陰性對照組細(xì)胞制備懸液接種。接種后第24、48、72小時加CCK8溶液,混勻后培養(yǎng)2 h,酶標(biāo)儀測OD450nm值。

        1.6 劃痕實驗

        將電轉(zhuǎn)24 h后的U251細(xì)胞(pSuper-STX8干擾組和陰性對照組)接種于6孔板培養(yǎng)過夜,在孔中部劃一個區(qū)域,確保每組劃傷區(qū)域一致,PBS漂洗,加入無FBS培養(yǎng)基。每隔24 h拍照。

        1.7 Transwell實驗

        Transwell小室鋪膠,下室加無血清培養(yǎng)基;電轉(zhuǎn)U251細(xì)胞(pSuper-STX8干擾組和陰性對照組)24 h后饑餓培養(yǎng)12 h,制備細(xì)胞懸液;24孔板中加完全培養(yǎng)基,上室加200滋L細(xì)胞懸液,培養(yǎng)24 h;4%多聚甲醛固定小室底面,0.1%結(jié)晶紫染液染色;切下小室基底膜,計數(shù)穿過的細(xì)胞。

        1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

        采用SPSS 13.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析,計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)依標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,兩組間比較采用t檢驗,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 STX8的敲低效率

        RT-PCR結(jié)果顯示,2#質(zhì)粒干擾組STX8的mR-NA表達量是陰性對照組的(17.5依5.35)%,抑制率達(82.5依5.35)%兩組STX8mRNA表達量比較,差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),起到有效的抑制作用,見圖1A。Western blot結(jié)果顯示,2#質(zhì)粒干擾組的STX8蛋白表達量只有對照組的19.5%,兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),見圖1B。后續(xù)實驗采用2#質(zhì)粒。

        2.2 CCK8法檢測U 251細(xì)胞增殖能力

        結(jié)果顯示,培養(yǎng)48 h時,pSuper-STX8干擾組細(xì)胞的OD值(0.929依0.0485)顯著低于陰性對照組(1.191依0.0581),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);培養(yǎng)72 h時,pSuper-STX8干擾組細(xì)胞的OD值(1.194依0.0615)依然顯著低于陰性對照組(1.490依0.074),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),提示STX8的敲低顯著降低了U251細(xì)胞的增殖。見圖2。

        圖2 STX8 shRNA抑制U251細(xì)胞增殖能力

        2.3 劃痕實驗、Transwell實驗檢測細(xì)胞遷移侵襲能力

        在劃痕實驗中,48 h后陰性對照組細(xì)胞遷移覆蓋大部分劃痕區(qū),而pSuper-STX8干擾組細(xì)胞向劃痕區(qū)移動距離較小,劃痕區(qū)依然明顯存在(圖3),提示STX8敲低能明顯抑制U251細(xì)胞的遷移能力。在Transwell實驗中,STX8 shRNA干擾組細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)[(87依8)個]顯著低于陰性對照組[(46依5)個],差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖4)。

        圖3 STX8 shRNA抑制U251細(xì)胞遷移能力

        圖4 STX8 shRNA抑制U251細(xì)胞侵襲能力

        3 討論

        SNARE蛋白介導(dǎo)分泌囊泡與質(zhì)膜的錨定、融合,是真核細(xì)胞中調(diào)節(jié)膜融合的關(guān)鍵因子,參與許多細(xì)胞功能[6-7],如細(xì)胞自噬[8-9]。其成員STX8參與細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)運輸和膜融合過程[10];STX8蛋白可以與STX7、Vti1b、VAMP7或VAMP8蛋白形成復(fù)合體,啟動囊泡融合促進蛋白降解[11];STX8蛋白還參與Ca2+、K+離子通道和受體TrkA的胞內(nèi)運輸過程[12-15],與2型糖尿病相關(guān)[16]。

        SNARE蛋白在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用,STX6參與了食管癌的發(fā)生發(fā)展[17-18],研究發(fā)現(xiàn)多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中STX8結(jié)合MIG-6蛋白形成復(fù)合體,促進表皮生長因子受體從早期內(nèi)體進入晚期內(nèi)體并啟動降解[19]。表皮生長因子受體在人腦惡性膠質(zhì)瘤中會發(fā)生擴增、重排、突變和過度表達等變化,導(dǎo)致細(xì)胞失控和轉(zhuǎn)化[20]。但STX8具體參與到哪些細(xì)胞功能調(diào)控的研究尚無相關(guān)的報道。

        本實驗通過構(gòu)建特異性敲低STX8的shRNA載體,檢測STX8功能缺失對腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的影響。CCK8結(jié)果顯示,STX8的敲低顯著降低了U251細(xì)胞的增殖速度;劃痕實驗和Transwell侵襲實驗結(jié)果顯示,STX8 shRNA能明顯抑制U251細(xì)胞的遷移侵襲能力。因此,STX8的敲低會顯著影響細(xì)胞增殖、遷移侵襲能力。

        綜上所述,腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的STX8基因可能參與了多種細(xì)胞功能的調(diào)控,在未來腦膠質(zhì)瘤的基因治療中可以作為潛在靶點。但STX8在腦膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中的具體機制還有待研究。

        [1]Bao S,Wu Q,McLendon RE,etal.Gliomastem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response[J].Nature,2006,444(7120):756-760.

        [2]Yan K,Wu Q,Yan DH,et al.Glioma cancer stem cells secrete Grem lin1 to promote their maintenance within the tumor hierarchy[J].Genes Dev,2014,28(10):1085-1100.

        [3]Meng J,Wang J.Role of SNARE proteins in tumourigenesis and their potential as targets for novel anti-cancer therapeutics[J].Biochimica et Biophysica Acta,2015,1856(1):1-12.

        [4]Collins LE,DeCourcey J,Soledad d LM,etal.An emerging role for snare proteins in dendritic cell function[J]. Frontiers in Immunology,2015,6院133.

        [5]ChenYA,SchellerRH.SNARE-mediatedmembrane fusion[J]. Nat Rev Mol Cell Biol,2001,2(2):98-106.

        [6]ZhouQ,LaiY,BacajT,etal.Architectureofthesynaptotagmin-SNARE machinery for neuronal exocytosis[J].Nature,2015,525(7567):62-67.

        [7]Tamm LK.How SNARE Assembly and Foldingmay Drive Membrane Fusion[J].Biophys J,2014,106(2):637a.

        [8]Moreau K,Renna M,Rubinsztein DC,et al.Connections between SNARSand autophagy[J].TrendsBiochem Sci,2013,38(2):57-63.

        [9]Tak佗ts S,Pircs K,Nagy P,et al.Interaction of the HOPS complex with Syntaxin17 mediates autophagosome clearance in Drosophila[J].Mol Biol Cell,2014,25(8):1338-1354.

        [10]Golebiewska EM.Identification and functional characterisation of novel SNARE proteins in platelets[D]. University of Bristol,2014.

        [11]Bogdanovic A,Bennett N,Kieffer S,et al.Syntaxin7,syntaxin8,Vti1 and VAMP7(vesicle-associated membrane protein 7)form an active SNARE complex for early macropinocytic compartment fusion in Dictyosteliumdiscoideum[J].Biochem J,2002,368(5):29-39.[12]Barnes DM,HarrisWH,Smith P,et a1.Immunohistochemica1determination of oestrogen recep tor:comparison of differentmethods of staining and corre1ation with c1inica1 outcomeofbreastcancer[J].Br JCancer,1996,74(9):1445-1451.

        [13]Renigunta V,F(xiàn)ischer T,Zuzarte M,et a1.Cooperative endocytosis of the endosoma1SNARE protein syntaxin8 and the potassium channe1TASK-1[J].Mo1Bio1Ce11,2014,25(12):577-589.

        [14]Bing C,Ling Z,Xian L,eta1.Syntaxin8modu1ates the postsynthetic trafficking of the TrkA receptor and inf1ammatory pain transmission[J].JBio1Chem,2014,289(28):19 556-19 569.

        [15]陳冰.Syntaxin8調(diào)節(jié)TrkA受體合成后轉(zhuǎn)運及炎性相關(guān)痛傳導(dǎo)的研究[D].山東大學(xué),2014.

        [16]Lancha A,López-Garrido S,Rodríguez A,eta1.Expression of Syntaxin8 in Viscera1Adipose Tissue Is Increased in Obese Patients with Type2 Diabetes and Re1ated to Markers of Insu1in Resistance and Inf1ammation[J].Arch Med Res,2014,46(1):47-53.

        [17]史輝,蔣淑干,劉俊華,等.STX6和p53在食管癌組織中的表達及相互關(guān)系的研究[J].實用腫瘤雜志,2012,27(3):237-239.

        [18]Du J,Liu X,Wu Y,et a1.Essentia1 ro1e of STX6 in esophagea1 squamous ce11 carcinoma growth and migration[J].Biochem Biophys Res Commun,2016,472(1):60-67.

        [19]Haoqiang Y,Hongwu Z,Kenneth S,et a1.Mig-6 contro1s EGFR trafficking and suppresses g1iomagenesis[J].Proc Nat1Acad Sci U SA,2010,107(15):6912-6917.

        [20]Roy SH.Monoc1ona1antibody to target epiderma1growth factor recepyor positive tumors[J].Cancer,2002,94(5):1593.

        Effect of ShRNA targeted silencing of STX8 gene on p roliferation and m igration of U251 cells

        YANGHaifeng1YANG Liang2BIYanhua3HUANG Shuhong4
        1.Department of Neurosurgery,Beijing Renhe Hospital,Beijing 102600,China;2.Department of Neurosurgery,the Second Hospital of Hebei Medical University,Hebei Province,Shijiazhuang 050000,China;3.Department of Research Teaching and Training Section,General Hospital of North China Petroleum Administration Bureau,Hebei Province, Renqiu 062550,China;4.Department of Neurobiology,Medical Academy of Shandong University,Shandong Province, Ji'nan 250012,China

        Objective To study the effect of knockdown STX8 gene on proliferation and migration of U251 cells.Methods STX8-shRNA-pSuper expression vector,transfected U251 cells were constructed,cell proliferation,migration and invasion ability were determined by CCK8 test,scratch test and transwell assay respectively.Results The cell prolifer-ation,migration and invasion ability of STX8 interference group was significantly decreased.Conclusion Knockdown of STX8 inhibits the proliferation,migration and invasion ability of U251 cells,STX8 genemay be a new target for gene therapy of glioblastoma.

        STX8 gene;Glioma;RNA interference;U251 cell

        R739.41

        A

        1673-7210(2016)07(a)-0004-04

        2016-04-03本文編輯:任念)

        國家自然科學(xué)基金資助項目(31271519)。

        畢艷華(1977.11-),女,副主任醫(yī)師,主要從事神經(jīng)外科危重癥及腫瘤精準(zhǔn)治療研究;黃淑紅(1978.6-),女,副教授;研究方向院分子神經(jīng)生物學(xué)。

        猜你喜歡
        實驗能力
        記一次有趣的實驗
        消防安全四個能力
        微型實驗里看“燃燒”
        幽默是一種能力
        做個怪怪長實驗
        大興學(xué)習(xí)之風(fēng) 提升履職能力
        你的換位思考能力如何
        努力拓展無人機飛行能力
        無人機(2017年10期)2017-07-06 03:04:36
        NO與NO2相互轉(zhuǎn)化實驗的改進
        實踐十號上的19項實驗
        太空探索(2016年5期)2016-07-12 15:17:55
        A亚洲VA欧美VA国产综合| 三叶草欧洲码在线| 少妇厨房愉情理伦片免费| 成在线人视频免费视频| 精品亚洲一区二区在线观看| 免费a级毛片18禁网站| 欧洲一卡2卡三卡4卡免费网站| 国产精品18久久久久网站| 视频一区中文字幕日韩| 色偷偷色噜噜狠狠网站30根 | 日本岛国精品中文字幕| 国产精品高湖呻呤久久av| 日韩av无码一区二区三区不卡| 人成午夜免费大片| 国产成人精品男人的天堂网站| 亚洲精品第四页中文字幕| 无码人妻丰满熟妇啪啪网站| 精品乱码卡1卡2卡3免费开放| 亚洲一二三四五区中文字幕| 国产免费二区三区视频| 九九热线有精品视频86| 国产丝袜在线精品丝袜不卡| 日本小视频一区二区三区| 国产香港明星裸体xxxx视频| 亚洲av无码日韩精品影片| 亚洲国产日韩在线精品频道| 色播视频在线观看麻豆| 久久精品国产亚洲av电影网| 精品国产亚洲一区二区在线3d| 国产精品高清一区二区三区人妖| 亚洲av午夜成人片精品电影| 少妇被躁爽到高潮无码文| www久久久888| 91精品国产福利在线观看麻豆| 国产如狼似虎富婆找强壮黑人| 香蕉国产人午夜视频在线观看| 国产在线观看女主播户外| 国产成人精品a视频| 国产无线乱码一区二三区 | 亚洲精品在线免费视频| 97色伦综合在线欧美视频|