楊海峰 楊亮 畢艷華 黃淑紅

1.北京市仁和醫(yī)院神經(jīng)外科，北京102600；2.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)外科，河北石家莊050000；3.華北石油管理局總醫(yī)院科研教學(xué)培訓(xùn)科，河北任丘062550；4.山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)生物學(xué)系，山東濟南250012

ShRNA靶向沉默STX 8基因?qū)251細(xì)胞增殖和遷移侵襲的影響

楊海峰1楊亮2畢艷華3黃淑紅4

1.北京市仁和醫(yī)院神經(jīng)外科，北京102600；2.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)外科，河北石家莊050000；3.華北石油管理局總醫(yī)院科研教學(xué)培訓(xùn)科，河北任丘062550；4.山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)生物學(xué)系，山東濟南250012

目的探討敲低STX8基因?qū)δX膠質(zhì)瘤細(xì)胞瘤U251細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響。方法構(gòu)建STX8-shRNA-pSuper表達載體轉(zhuǎn)染U251細(xì)胞，分別用CCK8法、劃痕實驗、Transwell實驗檢測細(xì)胞增殖、遷移侵襲能力。結(jié)果CCK8法、劃痕實驗、Transwell實驗結(jié)果顯示，STX8干擾后細(xì)胞增殖、遷移侵襲能力顯著下降。結(jié)論STX8基因的敲低能有效抑制U251細(xì)胞增殖、遷移侵襲能力，STX8基因有可能成為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤基因治療的新靶點。

STX 8基因；膠質(zhì)細(xì)胞瘤；RNA干擾；U251細(xì)胞

腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的原發(fā)性腫瘤之一，目前臨床治療手段療效有限[1-2]，需要迫切尋找其關(guān)鍵致癌因子。近年來，研究發(fā)現(xiàn)SNARE蛋白在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，其相關(guān)蛋白能否作為腫瘤治療的分子靶點也受到了很多關(guān)注[3-5]。成員之一Syntaxin8（STX8）參與了膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的發(fā)展[3]。目前尚未有STX8在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中參與哪些細(xì)胞功能的研究，本文通過分析腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251中STX8的作用，探討其在腦膠質(zhì)瘤中的發(fā)生發(fā)展和侵襲的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

pSuper院OligoEngine公司，STX8抗體院BD Bio-sciences公司，茁-tubulin抗體院Sigma公司，HEK293細(xì)胞為實驗室保存，U251細(xì)胞系院中科院上海細(xì)胞庫。

1.2 載體構(gòu)建及篩選

將干擾序列溶解至3μg/滋L，取正反oligo各1滋L，溶于48滋L退火buffer。靶序列院1#GACCGAAGACA-GAACCTCTTGCTC；2#ATACGATTCTACTTGT-

CAAATCTC。退火產(chǎn)物及載體（pSuper）酶切、連接、轉(zhuǎn)化、測序。使用測序成功的2個pSuper-STX8干擾質(zhì)粒（1#，2#）分別轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，為pSuper-STX8干擾組。空載體作為陰性對照。

1.3 RT-PCR

收集pSuper-STX8干擾組和陰性對照組細(xì)胞提RNA，反轉(zhuǎn)錄cDNA。STX8引物F院5ˊ-GAGGAGCCA-GAGGAGACCAG-3ˊ，R院5ˊ-TAGAGGAAAGGGCAT-CAAGG-3ˊ；內(nèi)參GAPDH引物F院5ˊ-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3ˊ，R院5ˊ-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3ˊ。反應(yīng)體系院模板cDNA 2滋L，2伊SYBRPremix Ex TaqTM域10滋L，引物（F+R）0.8滋L+ 0.8滋L，ddH2O 6.4滋L。反應(yīng)條件院95益預(yù)變性5min，95益變性15 s，60益退火延伸30 s，40個循環(huán)。重復(fù)3次，2-駐駐Ct分析法進行分析。

1.4 W estern blot

轉(zhuǎn)染48 h后收集pSuper-STX8干擾組和陰性對照組細(xì)胞提取蛋白BCA法測定濃度。剩余蛋白進行電泳，SDS-PAGE電泳后電轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，加一抗（1︰1000），4益孵育過夜，加二抗（1︰5000），孵育1h，電化學(xué)發(fā)光法（ECL）顯色。采用Image J分析圖像，以STX8/茁-tubulin灰度比值表示STX8蛋白的相對表達水平。

1.5 CCK8實驗

電轉(zhuǎn)U251細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24 h后取pSuper-STX8干擾組和陰性對照組細(xì)胞制備懸液接種。接種后第24、48、72小時加CCK8溶液，混勻后培養(yǎng)2 h，酶標(biāo)儀測OD450nm值。

1.6 劃痕實驗

將電轉(zhuǎn)24 h后的U251細(xì)胞（pSuper-STX8干擾組和陰性對照組）接種于6孔板培養(yǎng)過夜，在孔中部劃一個區(qū)域，確保每組劃傷區(qū)域一致，PBS漂洗，加入無FBS培養(yǎng)基。每隔24 h拍照。

1.7 Transwell實驗

Transwell小室鋪膠，下室加無血清培養(yǎng)基；電轉(zhuǎn)U251細(xì)胞（pSuper-STX8干擾組和陰性對照組）24 h后饑餓培養(yǎng)12 h，制備細(xì)胞懸液；24孔板中加完全培養(yǎng)基，上室加200滋L細(xì)胞懸液，培養(yǎng)24 h；4%多聚甲醛固定小室底面，0.1%結(jié)晶紫染液染色；切下小室基底膜，計數(shù)穿過的細(xì)胞。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)依標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 STX8的敲低效率

RT-PCR結(jié)果顯示，2#質(zhì)粒干擾組STX8的mR-NA表達量是陰性對照組的（17.5依5.35）%，抑制率達（82.5依5.35）%兩組STX8mRNA表達量比較，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），起到有效的抑制作用，見圖1A。Western blot結(jié)果顯示，2#質(zhì)粒干擾組的STX8蛋白表達量只有對照組的19.5%，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），見圖1B。后續(xù)實驗采用2#質(zhì)粒。

2.2 CCK8法檢測U 251細(xì)胞增殖能力

結(jié)果顯示，培養(yǎng)48 h時，pSuper-STX8干擾組細(xì)胞的OD值（0.929依0.0485）顯著低于陰性對照組（1.191依0.0581），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；培養(yǎng)72 h時，pSuper-STX8干擾組細(xì)胞的OD值（1.194依0.0615）依然顯著低于陰性對照組（1.490依0.074），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），提示STX8的敲低顯著降低了U251細(xì)胞的增殖。見圖2。

圖2 STX8 shRNA抑制U251細(xì)胞增殖能力

2.3 劃痕實驗、Transwell實驗檢測細(xì)胞遷移侵襲能力

在劃痕實驗中，48 h后陰性對照組細(xì)胞遷移覆蓋大部分劃痕區(qū)，而pSuper-STX8干擾組細(xì)胞向劃痕區(qū)移動距離較小，劃痕區(qū)依然明顯存在（圖3），提示STX8敲低能明顯抑制U251細(xì)胞的遷移能力。在Transwell實驗中，STX8 shRNA干擾組細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)[（87依8）個]顯著低于陰性對照組[（46依5）個]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）（圖4）。

圖3 STX8 shRNA抑制U251細(xì)胞遷移能力

圖4 STX8 shRNA抑制U251細(xì)胞侵襲能力

3 討論

SNARE蛋白介導(dǎo)分泌囊泡與質(zhì)膜的錨定、融合，是真核細(xì)胞中調(diào)節(jié)膜融合的關(guān)鍵因子，參與許多細(xì)胞功能[6-7]，如細(xì)胞自噬[8-9]。其成員STX8參與細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)運輸和膜融合過程[10]；STX8蛋白可以與STX7、Vti1b、VAMP7或VAMP8蛋白形成復(fù)合體，啟動囊泡融合促進蛋白降解[11]；STX8蛋白還參與Ca2+、K+離子通道和受體TrkA的胞內(nèi)運輸過程[12-15]，與2型糖尿病相關(guān)[16]。

SNARE蛋白在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，STX6參與了食管癌的發(fā)生發(fā)展[17-18]，研究發(fā)現(xiàn)多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中STX8結(jié)合MIG-6蛋白形成復(fù)合體，促進表皮生長因子受體從早期內(nèi)體進入晚期內(nèi)體并啟動降解[19]。表皮生長因子受體在人腦惡性膠質(zhì)瘤中會發(fā)生擴增、重排、突變和過度表達等變化，導(dǎo)致細(xì)胞失控和轉(zhuǎn)化[20]。但STX8具體參與到哪些細(xì)胞功能調(diào)控的研究尚無相關(guān)的報道。

本實驗通過構(gòu)建特異性敲低STX8的shRNA載體，檢測STX8功能缺失對腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的影響。CCK8結(jié)果顯示，STX8的敲低顯著降低了U251細(xì)胞的增殖速度；劃痕實驗和Transwell侵襲實驗結(jié)果顯示，STX8 shRNA能明顯抑制U251細(xì)胞的遷移侵襲能力。因此，STX8的敲低會顯著影響細(xì)胞增殖、遷移侵襲能力。

綜上所述，腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的STX8基因可能參與了多種細(xì)胞功能的調(diào)控，在未來腦膠質(zhì)瘤的基因治療中可以作為潛在靶點。但STX8在腦膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中的具體機制還有待研究。

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Effect of ShRNA targeted silencing of STX8 gene on p roliferation and m igration of U251 cells

YANGHaifeng1YANG Liang2BIYanhua3HUANG Shuhong4
1.Department of Neurosurgery,Beijing Renhe Hospital,Beijing 102600,China;2.Department of Neurosurgery,the Second Hospital of Hebei Medical University,Hebei Province,Shijiazhuang 050000,China;3.Department of Research Teaching and Training Section,General Hospital of North China Petroleum Administration Bureau,Hebei Province, Renqiu 062550,China;4.Department of Neurobiology,Medical Academy of Shandong University,Shandong Province, Ji'nan 250012,China

Objective To study the effect of knockdown STX8 gene on proliferation and migration of U251 cells.Methods STX8-shRNA-pSuper expression vector,transfected U251 cells were constructed,cell proliferation,migration and invasion ability were determined by CCK8 test,scratch test and transwell assay respectively.Results The cell prolifer-ation,migration and invasion ability of STX8 interference group was significantly decreased.Conclusion Knockdown of STX8 inhibits the proliferation,migration and invasion ability of U251 cells,STX8 genemay be a new target for gene therapy of glioblastoma.

STX8 gene;Glioma;RNA interference;U251 cell

R739.41

A

1673-7210（2016）07（a）-0004-04

2016-04-03本文編輯：任念）

國家自然科學(xué)基金資助項目（31271519）。

畢艷華（1977.11-），女，副主任醫(yī)師，主要從事神經(jīng)外科危重癥及腫瘤精準(zhǔn)治療研究；黃淑紅（1978.6-），女，副教授；研究方向院分子神經(jīng)生物學(xué)。