吳 迪 祁永華 張 寧 李艷微 張春蕾 徐艷明 李建民

黑龍江中醫(yī)藥大學佳木斯學院中藥系，黑龍江佳木斯154007

水飛薊賓防曬霜安全性評價

吳 迪 祁永華 張 寧 李艷微 張春蕾 徐艷明 李建民

黑龍江中醫(yī)藥大學佳木斯學院中藥系，黑龍江佳木斯154007

目的評價水飛薊賓防曬霜外用安全性。方法與3種市售知名品牌化妝品和陰性對照品比較，以豚鼠為試驗對象，將水飛薊賓防曬霜、3種知名品牌、陰性對照品和陽性對照品涂抹在豚鼠背部脫毛區(qū)，進行急性經(jīng)皮毒性試驗和皮膚變態(tài)反應試驗，觀察皮膚變化情況，記錄動物死亡情況，并進行血象和臟器系數(shù)檢測與比較，評價水飛薊賓防曬霜外用安全性。結果水飛薊賓防曬霜急性經(jīng)皮毒性試驗豚鼠無死亡和行動異?，F(xiàn)象，血象和臟器系數(shù)檢測結果與3種知名品牌和陰性對照品比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；皮膚變態(tài)反應試驗未產(chǎn)生皮膚致敏現(xiàn)象。結論水飛薊賓防曬霜外用安全。

水飛薊賓；經(jīng)皮毒性試驗；刺激性試驗；安全評價

近年來，由于國內外屢次出現(xiàn)的化妝品事故，其中不乏皮膚永久性損傷，讓廣大愛美消費者對上市或即將上市化妝品的安全性和功效性產(chǎn)生了質疑，化妝品新產(chǎn)品上市的安全性及已上市產(chǎn)品日常監(jiān)測備受消費者關注［1-4］。經(jīng)皮毒性試驗和皮膚刺激性試驗是化妝品安全性評價最基本的方法，可以用來評價和檢測化妝品使用的可靠性［5］。水飛薊賓防曬霜是由黑龍江中醫(yī)藥大學（以下簡稱“我?！保﹨R集中醫(yī)名師研制而成，具有明顯抗光老化、延緩衰老的作用，具有很高的市場價值，可依托我校附屬企業(yè)佳木斯紅杏生物技術開發(fā)有限公司生產(chǎn)與銷售。為使這一成果給更多人帶去福音，應對其安全性進行評估，做好應用準備。

1 料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與動物水飛薊賓防曬霜（自制，批號：20150601）；3種市售知名品牌化妝品（以下簡稱“知名品牌”，購于黑龍江市化妝品商店，批號分別為20141207、20150120、20140701）；脫毛膏（廣州有喜化妝品有限公司，批號：20141107）；2，4-二硝基氯代苯（化學純，天津市光復精細化工研究所，批號：150102）；丙酮（分析純，天津市光復精細化工研究所，批號：140801）；戊巴比妥鈉（化學純，上海哈靈生物科技有限公司，批號：20140711），用生理鹽水制成體積分數(shù)2%的無菌溶液；500 U/mL肝素鈉生理鹽水注射液（化學藥品，南京生物化學制藥廠，批號：150303）；豚鼠［普通級健康7周齡，雌雄各半，體重300～400 g，由長春市億斯試驗動物技術責任有限公司提供，合格證號：SCXK-（吉）2014-0002］。

1.1.2 儀器設備全自動生化分析儀（URIT-8021A，邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司）；全自動血細胞分析儀（Bc2600，邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司）；電子天平（BSA124S，德國賽多利斯）。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組與處理實驗動物共分6組，標記為：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、IV、Ⅴ、Ⅵ組，Ⅰ～IV組統(tǒng)稱為給藥組，即給水飛薊賓防曬霜為Ⅰ組，給知名品牌Ⅰ為Ⅱ組，給知名品牌Ⅱ為Ⅲ組，給知名品牌Ⅲ為IV組，陰性對照組（生理鹽水）為Ⅴ組，陽性對照組（0.1%與1%的2，4-二硝基氯代苯丙酮溶液）為Ⅵ組，所有試驗動物在給藥前24 h進行脫毛。

1.2.2 急性經(jīng)皮毒性試驗取健康豚鼠50只，雌雄各半，按照“1.2.1”項下分組，?、瘛踅M，于試驗前24 h去除軀干背部毛，＜40 cm2，試驗前記錄體重。涂抹藥物與陰性對照物時只設一個高劑量，即＞2180mg/kg，每只試驗動物用藥1 g。將水飛薊賓防曬霜、知名品牌Ⅰ～Ⅲ和生理鹽水涂抹于背部脫毛區(qū)，用醫(yī)用紗布和膠帶覆蓋固定，每只試驗動物分開飼養(yǎng)，24 h后用溫開水去除試驗藥物，并在第7、14天稱量體重，觀察受試動物是否出現(xiàn)異常癥狀和死亡，試驗結束進行采血和尸檢，檢測主要器官生理生化指標，按照《化妝品衛(wèi)生規(guī)范》中“皮膚毒性分級標準”對試驗結果進行評定［6-12］。劇毒：半數(shù)致死量（LD50）＜5 mg/kg；高毒：5 mg/kg＜LD50＜45 mg/kg；中等毒，45 mg/kg＜LD50＜350 mg/kg；低毒，350 mg/kg＜LD50＜2180 mg/kg；微毒，LD50＞2180 mg/kg。

1.2.3 皮膚變態(tài)反應試驗取健康豚鼠60只，按照“1.2.1”項下分組，每組10只。實驗前24 h右側背部去毛＜5 m2，用蒸餾水清洗。將水飛薊賓防曬霜0.3 g、知名品牌Ⅰ～Ⅲ、陰性對照物生理鹽水0.3 mL及陽性對照物1%的2，4-二硝基氯代苯丙酮溶液0.3 mL均勻涂抹于豚鼠右側脫毛區(qū)，覆蓋兩層紗布及一層硫酸紙，外部用無刺激醫(yī)用膠布固定6 h，第7、14天以相同的方法重復一次。將末次誘導后14 d的豚鼠左側脫毛＜5 m2，涂抹相應的受試藥物、陰性對照物及陽性對照物0.1%的2，4-二硝基氯代苯丙酮溶液，用量及外部處理與第一次相同，激發(fā)24 h和48 h觀察皮膚反應并記錄，判斷致敏性［13-16］。

皮膚致敏強度評級標準：無致敏性，0%～8%；輕度致敏性，9%～28%；中毒致敏性，29%～64%；高度致敏性，65%～80%；極度致敏性，81%～100%。皮膚過敏反應評分標準見表1。

表1 皮膚過敏反應評分標準

1.2.4 統(tǒng)計學方法采用SPSS 20.0軟件對試驗結果進行統(tǒng)計學分析，兩組間采用方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 果

2.1 急性經(jīng)皮毒性試驗結果

各組試驗動物在觀察期內表現(xiàn)活潑，未見死亡、震顫、抽搐、流涎、腹瀉、嗜睡和昏迷癥狀，覓食、呼吸、生理活動正常；毛色光滑，試驗處皮膚未見水腫、紅斑現(xiàn)象，評價刺激指數(shù)為“0”，刺激性強度為無刺激性。各組試驗動物體重均有所增加，水飛薊賓防曬霜組增加幅度與知名品牌組、陰性對照組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），增加幅度各組別比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。對各組實驗動物進行尸檢及病理學檢查，水飛薊賓防曬霜組試驗動物的血、肝、腎功能檢查結果與知名品牌組、陰性對照組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），水飛薊賓防曬霜組臟器系數(shù)與知名品牌組、陰性對照組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。試驗結果提示，水飛薊賓防曬霜與知名品牌化妝品無急性經(jīng)皮毒性反應。結果見表2～4。

2.2 皮膚變態(tài)反應試驗結果

按照中華人民共和國衛(wèi)生部《化妝品衛(wèi)生規(guī)范》有關規(guī)定對水飛薊賓防曬霜、知名品牌及陰性對照物進行皮膚刺激反應評分和致敏強度分級評價［17］。各組試驗動物中，水飛薊賓防曬霜、知名品牌及陰性對照物均未引起豚鼠皮膚產(chǎn)生紅斑和水腫反應，致敏率為“0”；陽性對照物2，4-二硝基氯代苯丙酮溶液有明顯激發(fā)紅斑和水腫反應明顯，致敏率為70%，具有極強的致敏性。試驗結果提示，水飛薊賓防曬霜、知名品牌均無皮膚致敏性。結果見表5。

3 論

皮膚衰老主要分為自然老化和光老化兩種形式。光老化是指皮膚暴露在紫外線（UA）下，受到的損傷逐漸積累，無規(guī)則的色素沉著，表皮角化出現(xiàn)不良反應，真皮彈性纖維變性以及降解產(chǎn)物蓄積等各種生理變化，獨自或疊加在皮膚上的表現(xiàn)［18］。光老化主要是日光中的中波紫外線（UVB）和長波紫外線（UVA）引起的，光老化的機制主要包括兩種：一種是UV照射使皮膚產(chǎn)生活性氧簇等自由基，使DNA受到氧化性損傷，進而影響蛋白質的正常合成而損傷皮膚；另一種是UV照射使血管周圍的巨噬細胞和肥大細胞活性被激發(fā)，產(chǎn)生并釋放細胞因子和致炎介質，激發(fā)真皮炎性反應，同時釋放組織溶解酶，從而導致真皮基質成分降解，引發(fā)炎性反應，形成皮膚彈性衰退、皺紋數(shù)增加、色素沉著等［19-21］皮膚衰老表現(xiàn)。皮膚衰老變現(xiàn)為皮膚紅斑和延遲性色素沉著，皮膚變粗、皺紋增多、角質增厚等。

表2 水飛薊賓日霜、市售化妝品及陰性對照品對豚鼠急性經(jīng)皮毒性試驗結果

表2 水飛薊賓日霜、市售化妝品及陰性對照品對豚鼠急性經(jīng)皮毒性試驗結果

組別給藥劑量（g）動物數(shù)量（只）死亡數(shù)（只）死亡率（%）毒性級別體重（g）0 d 7 d 14 dⅠ組Ⅱ組Ⅲ組Ⅳ組Ⅴ組11111 10 10 10 10 10 364.34±12.43 352.78±13.54 349.88±12.67 359.03±14.18 360.19±11.74 367.17±12.65 357.38±12.67 354.51±14.18 363.46±12.47 362.93±13.28 371.72±11.98 359.51±14.32 357.22±11.53 366.83±12.59 367.29±11.14 00000 00000無無無無無

表3 豚鼠經(jīng)皮毒性試驗的血、肝、腎功能檢查結果

表3 豚鼠經(jīng)皮毒性試驗的血、肝、腎功能檢查結果

組別血紅蛋白（g/L）紅細胞數(shù)（×1012/L）白細胞數(shù)（×109/L）白細胞分類（%）淋巴中性單核轉氨酶（U/L）尿素氮（mmol/L）Ⅰ組Ⅱ組Ⅲ組Ⅳ組Ⅴ組144.38±7.63 139.63±8.27 138.66±8.97 140.72±9.10 141.68±7.63 5.84±0.94 4.93±1.19 5.88±1.29 6.35±1.06 5.04±0.84 5.37±1.14 5.46±0.94 6.11±0.79 4.98±1.09 5.83±0.59 69.47±7.83 68.37±8.87 70.67±6.88 71.33±8.43 68.95±7.73 29.67±6.45 30.67±7.17 27.39±6.48 27.81±7.46 28.57±8.16 8.58±1.05 8.34±1.21 8.96±1.07 8.69±1.44 9.04±1.27 42.67±8.12 40.66±7.81 42.83±8.06 39.77±7.57 39.63±1.47 8.39±2.06 7.51±1.74 7.77±2.52 9.42±1.88 8.78±2.06

表4 豚鼠急性經(jīng)皮毒性試驗主要臟器系數(shù)結果

表4 豚鼠急性經(jīng)皮毒性試驗主要臟器系數(shù)結果

組別心肝脾肺腎Ⅰ組Ⅱ組Ⅲ組Ⅳ組Ⅴ組0.403±0.032 0.410±0.031 0.415±0.018 0.408±0.009 0.411±0.021 3.75±0.27 3.82±0.30 3.85±0.32 3.79±0.29 3.81±0.33 0.212±0.019 0.209±0.020 0.205±0.028 0.211±0.021 0.207±0.030 0.642±0.081 0.658±0.072 0.651±0.079 0.639±0.088 0.647±0.094 0.895±0.101 0.912±0.082 0.889±0.105 0.904±0.093 0.907±0.097

表5 水飛薊賓防曬霜、市售化妝品對豚鼠皮膚變態(tài)反應試驗結果（只）

水飛薊賓是從菊科藥用植物提取出的有效成分最多的一種水飛薊素，其作用也最強，具有抗氧化、抗炎癥、免疫調節(jié)、促進肝細胞再生等作用。水飛薊賓的抗氧化作用是通過消除氧自由基，抑制脂質過氧化及5-脂氧酶活性來降低被損傷機體組織中丙二醛以及白三烯的含量。在此過程中，最主要的是提升超氧化歧化酶含量，抑制脂質過氧化反應，保護、維持細胞膜的流動性［22］。水飛薊賓常用于肝臟功能的調節(jié)、抗病毒、抗腫瘤［23-24］。隨著近年來研究發(fā)現(xiàn)［25-26］，水飛薊賓在抗皮膚光老化有較好的作用，并有廣闊的開發(fā)前景。其抗光老化機制為：通過調節(jié)細胞外基質成分的合成與降解、抑制炎癥因子對肝星狀細胞的活化，使UV所致的角質形成（HaCaT）細胞的脂質過氧化損傷程度得以降低，控制HaCaT細胞乳酸脫氧酶活力，減少炎性因子的釋放等途徑以及UA所致細胞的不可逆損害，維持表皮角質形成細胞、真皮成纖維細胞正常功能。本研究將水飛薊賓制備成化妝品，改變其給藥方式，以化妝品日常護理的形式對抗UV所引起的損害，將其直接涂敷于皮膚表面，直接滲透到皮膚細胞中，維持和保護機體細胞的生理功能，開發(fā)出一款具有應用靈活、擁有無限未來的應用產(chǎn)品。

化妝品安全性風險評估是保證化妝品安全的重要手段，可降低避免出現(xiàn)安全隱患，保證產(chǎn)品上市安全可靠。試驗方法主要包括急性經(jīng)皮毒性試驗、皮膚刺激性試驗、眼部刺激性試驗、皮膚變態(tài)反應試驗和皮膚光毒性試驗。安全性評價主要采用實驗動物來進行，多以豚鼠、SD大鼠、裸鼠及家兔為實驗動物，主要針對眼部和脫毛背部進行接觸性試驗，可以直觀地反映被試化妝品的安全性。目前由于歐盟禁止在其范圍內銷售的化妝品采用動物進行安全性測試，因此出現(xiàn)了一些代替試驗，如人工皮膚、離體細胞等［27-28］，但因其重復性、關聯(lián)性的局限，無法得到有力證據(jù)驗證方法的可靠性，因此動物實驗仍然是化妝品安全評價的主要方法。

本試驗通過急性經(jīng)皮試驗和皮膚變態(tài)試驗評估水飛薊賓防曬霜的安全性，急性經(jīng)皮毒性試驗無豚鼠死亡現(xiàn)象，血象、各內臟主要器官功能以及臟器系數(shù)與知名品牌和陰性對照品比較，差異無統(tǒng)計學意義；皮膚變態(tài)試驗時，與陽性對照比較，皮膚完好，無紅斑和水腫現(xiàn)象，不會引起豚鼠皮膚過敏反應，與陰性對照和知名品牌評價結果相同［29-30］。試驗結果提示，水飛薊賓防曬霜安全性評價結果與已上市的知名品牌相同，無毒性和致敏性反應，符合《化妝品衛(wèi)生規(guī)范》合格產(chǎn)品要求，可以放心應用。

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Safety evaluation of Silybin Sunscreen

WU Di QIYonghua ZHANGNing LIYanwei ZHANGChunlei XU Yanming LIJianmin
Department of Traditional Chinese Medicine，Jiamusi College，Heilongjiang University of Chinese Medicine，Heilongjiang Province，Jiamusi 154007，China

Objective To evaluate the external use security of Silybin Sunscreen.M ethods Compared with three kinds of famous brand cosmetics and negative reference，cavy was experiment subject，cavy's hair removal back area was smeared silybin screen，three kinds of famous brand cosmetics，negative reference and positive reference，acute dermal toxicity test and skin allergic reaction experiments were conducted，skin change phenomenon was observed，animal dead phenomenon was recorded，blood picture and viscera coefficient test were conducted and compared in order to evaluate the external use security of silybin sunscreen.Results In Silybin sunscreen acute dermal toxicity test，therewas no sign for cavy's death and abnormal phenomenon；there was no significant difference for blood picture and viscera coefficient test and three kinds of famous brand cosmetics，negative reference and positive reference（P＞0.05）.There was no skin sensitization phenomenon in skin allergic reaction test.Conclusion The external use of silybin sunscreen is safe.

Silybin；Dermal toxicity test；Irritation test；Safety evaluation

R965.3

A

1673-7210（2016）05（c）-0135-04

2016-01-01本文編輯：趙魯楓）

黑龍江省應用技術研究與開發(fā)計劃項目（PC13S15）。

吳迪（1982.1-），男，碩士；研究方向：藥物緩釋控釋及靶向研究。

李建民（1964.10-），男，碩士，教授，碩士生導師；研究方向：中藥藥效物質基礎研究。