張 瑾 趙欣媛 張建華

西安醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院產(chǎn)二科，陜西西安710024

基于VEGF調(diào)控SDF-1/CXCR4信號(hào)探討可樂定促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖和遷移

張 瑾 趙欣媛 張建華

西安醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院產(chǎn)二科，陜西西安710024

目的探討可樂定（CLO）對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞增殖、遷移的促進(jìn)作用及分子機(jī)制探討。方法不同濃度的CLO與HTR8-SVneo滋養(yǎng)細(xì)胞共培養(yǎng)，MTT和Transwell方法檢測(cè)HTR8-SVneo細(xì)胞的增殖和遷移，RT-PCR和Western blot技術(shù)檢測(cè)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、基質(zhì)細(xì)胞衍生因子（SDF-1）及其趨化因子受體（CXCR4）的表達(dá)水平；將CLO分別與VEGF受體抑制劑（DC101）、CXCR4抑制劑（AMD3100）共同作用于HTR8-SVneo細(xì)胞，檢測(cè)細(xì)胞的增殖、遷移能力和CXCR4的表達(dá)水平。結(jié)果CLO顯著促進(jìn)HTR8-SVneo細(xì)胞的增殖和遷移（P＜0.05），并上調(diào)VEGF、CXCR4的表達(dá)水平（P＜0.05）；抑制劑DC101和AMD3100均可抑制可樂定對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞增殖和遷移的促進(jìn)作用，且VEGF可調(diào)控SDF-1、CXCR4的表達(dá)（P＜0.05）。結(jié)論CLO可通過VEGF激活SDF-1/CXCR4信號(hào)，促進(jìn)HTR8-SVneo滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖和遷移。

可樂定；HTR 8-SVneo細(xì)胞；增殖遷移；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；基質(zhì)細(xì)胞衍生因子/基質(zhì)細(xì)胞衍生因子趨化因子受體

妊娠高血壓疾病是妊娠期特有的并發(fā)癥，嚴(yán)重危害母嬰健康，是孕產(chǎn)婦和胎兒發(fā)病和死亡的主要原因之一［1］。近年的研究表明，滋養(yǎng)層細(xì)胞通過遷移、入侵子宮內(nèi)壁，促進(jìn)胚胎著床穩(wěn)定，完善胎盤的生長(zhǎng)發(fā)育［2-3］。胚胎的穩(wěn)定著床、生長(zhǎng)發(fā)育和胎盤的形成都與絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖遷移和浸潤(rùn)等過程密切相關(guān)［4］?？蓸范ǎ╟lonidine，CLO）是咪唑類衍生物，化學(xué)名為N-（2，6-二氯苯基）-4，5-二氫-1H-咪唑-2-胺，是一種α2-腎上腺素受體激動(dòng)劑，臨床上用于治療高血壓的一種中樞性降壓藥［5-6］，主要用于治療中、高度高血壓，與其他類降壓藥合用時(shí)具有協(xié)同作用［7］。有研究表明［8］，CLO可以促進(jìn)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的生成，調(diào)節(jié)胎盤血管內(nèi)皮細(xì)胞與滋養(yǎng)層細(xì)胞之間的交聯(lián)。VEGF可以上調(diào)基質(zhì)細(xì)胞衍生因子（stromal cell-derived factor-1，SDF-1）及其趨化因子受體（chemokine receptor-4，CXCR4）的表達(dá)［9-11］，SDF-1/CXCR4信號(hào)具有抗凋亡作用［12］，而CXCR4拮抗劑可以抑制SDF-1/CXCR4信號(hào)，抑制人胰腺癌細(xì)胞的遷移和入侵［13］。本研究在已有工作的基礎(chǔ)上，以經(jīng)典的HTR8-SVneo滋養(yǎng)細(xì)胞為研究對(duì)象，探討CLO對(duì)滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖和遷移的影響及可能的分子機(jī)制。

1 料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料HTR8-SVneo細(xì)胞，購(gòu)于中科；上海生命科學(xué)研究；細(xì)胞中心。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑CLO粉劑、AMD3100（CXCR4抑制劑，Sigma公司；DC101（VEGF受體抑制劑，英國(guó)Imclone公司）；胎牛血清（FBS，美國(guó)Gibco公司）；RPMI-1640培養(yǎng)基（杭州四季青）；RT-PCR試劑盒、RTPCR引物（大連寶生物公司）；抗體（美國(guó)BIO SYSTEM公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組HTR8-SVneo細(xì)胞用RPMI-1640培養(yǎng)基（10%FBS）置于培養(yǎng)箱（37℃、5%CO2）中孵育，選用處于生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。分組如下：①control組（Con），②CLO組（CLO作用濃度分別為0.1、1、10μmol/L），③CLO+DC101組（10μmol/LCLO，40μg/mLDC101），④CLO+AMD3100組（10μmol/LCLO，1μmol/L AMD3100），⑤CLO+DC101+AMD3100組（10μmol/LCLO，40μg/mLDC101，1μmol/LAMD3100）。1.2.2 MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖細(xì)胞接種于培養(yǎng)板（0.2×104個(gè)/孔），按照以上分組分別加入不同濃度的CLO和抑制劑DC101、AMD3100，培養(yǎng)48 h后加入MTT，再培養(yǎng)4 h后加入DMSO，震蕩10min，酶標(biāo)儀測(cè)定570 nm處的OD值。

1.2.3 Transwe l l檢測(cè)細(xì)胞遷移Transwell板上室加入HTR8-SVneo單細(xì)胞懸液（1×105個(gè)/孔），再按照以上分組加入不同濃度的CLO和抑制劑DC101、AMD3100，下室加入RPMI-1640培養(yǎng)液（10%FBS），培養(yǎng)48 h后甲醇固定濾膜下表面的細(xì)胞，蘇木精染色，高倍顯微鏡（200×）下計(jì)數(shù)。

1.2.4 RT-PCR檢測(cè)VEGF、CXCR4 mRNA表達(dá)細(xì)胞接種于培養(yǎng)板（1×105個(gè)/孔），按照分組加入不同濃度的CLO和抑制劑DC101、AMD3100，培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞，Trizol提取細(xì)胞總RNA，加入引物逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，RNA反轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)條件：25℃5 min，42℃60 min，70℃5 min；SYBR-Premix Ex-TaqⅡ試劑盒及ABI7500 RT-PCR儀進(jìn)行DNA擴(kuò)增；產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，凝膠掃描成像。RT-PCR引物具體見表1。

1.2.5 Wes tern b l ot檢測(cè)VEGF、CXCR4蛋白表達(dá)細(xì)胞提取總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，總蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)膜，封閉1 h，再分別加入相應(yīng)的一抗稀釋液（1：1000），4℃封閉過夜，洗膜后加入二抗（1：500）孵育1 h，顯影成像。

表1 RT-PCR引物

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 11.5進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，電泳圖像用Quanity One軟件進(jìn)行灰度分析，正態(tài)分布計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用One-way ANOVA。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 果

2.1 CLO促進(jìn)HTR 8-SVneo細(xì)胞增殖和遷移

不同濃度CLO（0.1～10μmol/L）作用于HTR8-SVneo細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，和Con組比較，CLO顯著促進(jìn)細(xì)胞的增殖和遷移（P＜0.05），且呈劑量依賴關(guān)系。見圖1。

圖1 可樂定促進(jìn)HTR8-SVneo細(xì)胞增殖和遷移

2.2 可樂定上調(diào)VEGF、SDF-1、CXCR 4的表達(dá)水平

與Con組比較，CLO促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞VEGF、SDF-1和CXCR4mRNA和蛋白的表達(dá)，且隨著濃度的增加而上調(diào)（P＜0.05）。見圖2。由此可以推測(cè)，CLO對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞增殖、遷移的促進(jìn)作用可能與上調(diào)VEGF、SDF-1、CXCR4的表達(dá)水平有關(guān)。

圖2 可樂定促進(jìn)HTR8-SVneo細(xì)胞VEGF、CXCR4表達(dá)水平

2.3 DC101/AMD3100抑制HTR 8-SVneo細(xì)胞增殖和遷移

CLO（10μmol/L）分別與抑制劑DC101或AMD3100作用于滋養(yǎng)細(xì)胞，與CLO組比較，抑制VEGF、CXCR4的表達(dá)，滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖和遷移指數(shù)明顯下降（P＜0.05）。見圖3。由此可知，VEGF和CXCR4可以促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖和遷移。

圖3 DC101和AMD3100抑制HTR8-SVneo細(xì)胞的增殖和遷移

2.4 VEGF可調(diào)控SDF-1/CXCR 4信號(hào)

已知CXCR4是SDF-1特異受體，兩者交聯(lián)后可以產(chǎn)生信號(hào)通路，加入VEGF的抑制劑DC101后，SDF-1和CXCR4的表達(dá)水平顯著下降（P＜0.05）（圖4）。說明VEGF可以調(diào)節(jié)SDF-1/CXCR4信號(hào)的激活，進(jìn)而發(fā)揮作用。

3 論

CLO可用于治療妊娠高血壓［5］，尤其與其它類降壓藥合用時(shí)具有協(xié)同作用，療效更加顯著［14］，但其作用機(jī)制還不十分清楚。我們前期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CLO在0.1～10μmol/L濃度范圍可顯著促進(jìn)HTR8-SVneo滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖和遷移。VEGF是血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，在妊娠過程中，VEGF及其受體主要在胎盤組織的滋養(yǎng)層細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，可以促進(jìn)滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖、侵襲等［15-16］。趨化因子SDF-1在胚胎發(fā)育、血管生成等生理過程中發(fā)揮重要作用［17］，文獻(xiàn)報(bào)道，CXCR4是目前已知的SDF-1特異受體［18］，兩者交聯(lián)后可以產(chǎn)生信號(hào)通路，參與人體很多生理活動(dòng)，例如促進(jìn)血管的生成［19-20］，作為淋巴細(xì)胞的共刺激分子參與免疫調(diào)節(jié)作用，參與妊娠期胚胎的著床過程［21］等。為了進(jìn)一步探究可樂定的促滋養(yǎng)細(xì)胞增殖遷移的作用是否與VEGF和CXCR4有關(guān)，通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)可樂定可以上調(diào)滋養(yǎng)細(xì)胞VEGF和SDF-1/CXCR4的表達(dá)，且具有劑量依賴性，進(jìn)一步探究可知，分別抑制VEGF、CXCR4的表達(dá)，可樂定對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞增殖、遷移的促進(jìn)作用被減弱，說明CLO促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞增殖和遷移的作用機(jī)制與VEGF、SDF-1/CXCR4的表達(dá)有關(guān)，且VEGF可以正向調(diào)控SDF-1/CXCR4的激活，從而得出結(jié)論，CLO通過VEGF激活SDF-1/CXCR4信號(hào)，從而發(fā)揮促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞增殖和遷移的作用。絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞在妊娠期發(fā)揮著十分重要的作用［22］，滋養(yǎng)層細(xì)胞的正常增殖、遷移、浸潤(rùn)等，可以確保胎盤著床穩(wěn)定，胎兒健康發(fā)育［23］，還可分泌各種分子，促進(jìn)子宮內(nèi)血管生成［24］。研究表明，娠高征患者胎盤著床淺，子宮螺旋小動(dòng)脈障礙［25］，絨毛血管發(fā)生異常，這些病癥與滋養(yǎng)層細(xì)胞的增殖、遷移、浸潤(rùn)至子宮肌壁間等密切相關(guān)［26-28］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明CLO可以促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖和遷移，且通過VEGF激活SDF-1/CXCR4信號(hào)發(fā)揮作用，說明VEGF和SDF-1/CXCR4信號(hào)可以作為CLO治療妊娠高血壓的新靶咖，為臨床研究提供依據(jù)。然而體內(nèi)是一個(gè)極其復(fù)雜的環(huán)境，各種分子和信號(hào)通路相互交聯(lián)相互作用，故具體的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步的深入研究。

圖4 DC101抑制HTR8-SVneo細(xì)胞SDF-1和CXCR4的表達(dá)

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Clonidine promotes HTR8-SVneo cells proliferation and m igration ability via activating SDF-1/CXCR4 signal by VEGF

ZHANG Jin ZHAO Xinyuan ZHANG Jianhua
The Second Division of Obstetrics，Second Affiliated Hospital to Medical School of Xi'an Medical College，Shaanxi Province，Xi'an 710024，China

Ob jective To investigate the effects of Clonidine on proliferation and migration of HTR8-Svneo cells and exploremechanism.Methods MTT and Transwellmethodswere used to determine the proliferation andmigration abilities of HTR8-SVneo cells after incubated with Clonidine.Vascular endothelial growth factor（VEGF）and stromal cellderived factor-1（SDF-1），chemokine receptor-4（CXCR4）were evaluated by RT-PCR and Western blot.The proliferation and migration weremeasured after incubated with VEGFR inhibitor（DC101）or CXCR4 antagonist（AMD3100）.And CXCR4 expression level was evaluated after incubated with DC101.Results Clonidine can promote proliferation and migration of HTR8-SVneo cells（P＜0.05）.VEGF and CXCR4 expression level were notably up-regulated（P＜0.05）. DC101 and AMD3100 inhibit HTR8-SVneo cells proliferation，migration and DC101 suppressed CXCR4 expression（P＜0.05）.Conclusion Clonidine promotes proliferation and migration abilities of HTR8-SVneo cells by activating SDF-1/CXCR4 signaling via VEGF.

Clonidine；HTR8-SVneo cells；Proliferation；Migration；Vascular endothelial growth factor；Stromal cellderived factor-1/chemokine receptor-4

R714.25

A

1673-7210（2016）05（c）-0035-05

2016-02-17本文編輯：蘇暢）