張彧婷 孫 權(quán) 沙 峰 孫石柱 姚立杰 李靜平 沈 雷

齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室，黑龍江齊齊哈爾161006

高糖環(huán)境下人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合兔脫細(xì)胞真皮支架體外成骨能力檢測

張彧婷 孫 權(quán) 沙 峰 孫石柱 姚立杰 李靜平 沈 雷

齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室，黑龍江齊齊哈爾161006

目的探討脫細(xì)胞真皮支架在高糖環(huán)境下對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（hBMSC）的保護(hù)作用，以及促進(jìn)hBMSC向成骨細(xì)胞分化的能力。方法建立脫細(xì)胞真皮基質(zhì)和含300mmol/L葡萄糖的細(xì)胞高糖模型，在高糖環(huán)境下，培養(yǎng)hBMSC為高糖對(duì)照組，在高糖條件下，hBMSC種植在脫細(xì)胞真皮基質(zhì)上為基質(zhì)實(shí)驗(yàn)組，正常條件下培養(yǎng)的hBMSC為正常對(duì)照組，每組均進(jìn)行成骨細(xì)胞誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)。利用MTT實(shí)驗(yàn)檢測hBMSC的增殖情況；利用骨形成蛋白-1（BMP-1）免疫熒光染色檢測hBMSC成骨細(xì)胞分化情況，ELISA實(shí)驗(yàn)檢測各組hBMSC的BMP-1、堿性磷酸酶（ALP）的含量。結(jié)果與高糖對(duì)照組比較，基質(zhì)實(shí)驗(yàn)組hBMSC的細(xì)胞增殖光密度（OD值）升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；hBMSC在脫細(xì)胞真皮基質(zhì)的生長狀態(tài)良好，基質(zhì)實(shí)驗(yàn)組BMP-1染色陽性的細(xì)胞數(shù)目明顯高于高糖對(duì)照組（P＜0.01）；基質(zhì)實(shí)驗(yàn)組BMP-1、ALP等蛋白的含量明顯增高（P＜0.01）。結(jié)論高糖環(huán)境下，脫細(xì)胞真皮基質(zhì)有利于促進(jìn)hBMSC分化為成骨細(xì)胞。

高糖；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；脫細(xì)胞真皮基質(zhì)；成骨細(xì)胞

糖尿病是一種以高血糖為典型表現(xiàn)的復(fù)雜性全身疾病，高血糖狀態(tài)常導(dǎo)致血管、神經(jīng)發(fā)生嚴(yán)重的病理改變［1］。Palmer BF認(rèn)為：糖尿病及其并發(fā)癥已經(jīng)成為影響我國等國家發(fā)展的重要影響因素［2］，人口老齡化和糖尿病患病人數(shù)的增多常導(dǎo)致糖尿病患者骨質(zhì)疏松，骨折不易愈合等嚴(yán)重問題［3］，加重患者家庭及社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)［4］。如何改善糖尿病骨質(zhì)狀況，加速糖尿病性骨損傷的修復(fù)是迫切需要解決的問題。

脫細(xì)胞皮膚基質(zhì)間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSC）由于具有來源廣泛、低免疫性、多分化等優(yōu)勢，為逆轉(zhuǎn)糖尿病性組織缺氧和促進(jìn)組織修復(fù)帶來了希望，是細(xì)胞治療和骨組織工程技術(shù)首選的種子細(xì)胞［5］。皮膚組織的再生能力非常強(qiáng)，脫細(xì)胞真皮細(xì)胞外基質(zhì)具有復(fù)雜的三維結(jié)構(gòu)［6］，是具有廣泛應(yīng)用前景的生物組織支架材料，對(duì)支持移植細(xì)胞生長、促進(jìn)組織修復(fù)具有關(guān)鍵效果［6］。但是高糖狀態(tài)下，MSC在脫細(xì)胞真皮基質(zhì)的成骨分化尚鮮見報(bào)道。本研究擬揭示高糖環(huán)境下，MSC在脫細(xì)胞真皮基質(zhì)的生長和成骨分化情況，為MSC組織工程技術(shù)促進(jìn)骨組織新生，治療高糖缺氧性骨組織損傷奠定研究基礎(chǔ)。

1 料與方法

1.1 細(xì)胞來源

GFP標(biāo)記的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（hBMSC）購于廣州賽業(yè)生物公司。

1.2 主要試劑和實(shí)驗(yàn)儀器

體重2～3 kg雄性新西蘭白兔購自齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心［動(dòng)物合格證號(hào)：SYXK（黑）20140022］，胎牛血清（FBS）、α-MEM培養(yǎng)基、青鏈霉素和L-谷氨酰胺均購于廣州賽業(yè)生物公司，地塞米松、抗壞血酸、β-甘油磷酸鈉、VEGF、噻唑藍(lán)（MTT）和葡萄糖等均購于美國Sigma公司，兔抗人BMP-1抗體和TRITC標(biāo)記羊抗兔IgG購自美國Santa cruz公司，人骨形成蛋白-1（BMP-1）、堿性磷酸酶（ALP）的ELISA試劑盒購于美國R&D公司。Emax酶標(biāo)儀為美國Molecular Devices公司產(chǎn)品，F(xiàn)-7000熒光分光光度計(jì)為日立公司產(chǎn)品，BX50型顯微鏡和SU1510型掃描電子顯微鏡分別為日本OLYMPUS、日立公司的產(chǎn)品。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 脫細(xì)胞真皮的制備8只體重2～3 kg雄性新西蘭白兔，按照30 mg/kg耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉，常規(guī)備皮、消毒，切取背部6 cm×6 cm全層皮膚，清理周圍組織后，首先加入0.9%氯化鈉溶液，在37℃搖床孵育12 h，去除表皮層［6］；然后置于0.125%胰蛋白酶溶液中，37℃，消化24 h，依次經(jīng)過0.1%、0.5%十二烷基磺酸鈉（SDS）震蕩洗滌12 h，60Co消毒處理密封，-80℃保存。掃描電鏡觀察樣品結(jié)構(gòu)［7-8］。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)分組含10%FBS的α-MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)hBMSC，37℃、5%CO2培養(yǎng)者為正常對(duì)照組；若α-MEM培養(yǎng)基中含300mmol/L葡萄糖，則為高糖培養(yǎng)基。在細(xì)胞高糖模型下，未進(jìn)行任何刺激的hBMSC為高糖對(duì)照組；將hBMSC種植在脫細(xì)胞真皮基質(zhì)上進(jìn)行培養(yǎng)則為基質(zhì)實(shí)驗(yàn)組；每組細(xì)胞均進(jìn)行成骨誘導(dǎo)分化。成骨分化培養(yǎng)基為：α-MEM培養(yǎng)基中若含10%FBS、1×10-7mol/L地塞米松、50 mg/L抗壞血酸、10 mmol/Lβ-甘油磷酸鈉。

1.3.3 MTT法檢測細(xì)胞增殖情況按實(shí)驗(yàn)分組，或在96孔板底放置脫細(xì)胞真皮基質(zhì)，每組均添加1×104hBMSC后，在正常條件下培養(yǎng)24 h。每孔加入150μL含 0.1%FBS的正?；蚋咛铅?MEM培養(yǎng)基，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)12 h；每孔加入20μL的5%MTT孵育4 h，然后添加100μL二甲基亞砜，492 nm波長測定每個(gè)樣品吸光度（OD值）。

1.3.4 免疫熒光染色各組分化誘導(dǎo)的hBMSC，DAPI進(jìn)行細(xì)胞核標(biāo)記，4%多聚甲醛固定，4℃條件下，用兔抗人BMP-1抗體（1：200）孵育12 h后，添加山羊抗兔IgG（1：150），DAKO水溶性封片液進(jìn)行封片。

1.3.5 人BMP-1、ALP蛋白的檢測按照人BMP-1、ALP蛋白的ELISA試劑盒說明，裂解各組細(xì)胞，提取各組細(xì)胞裂解液，ELISA實(shí)驗(yàn)檢測人BMP-1、ALP蛋白的表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，并進(jìn)行方差分析或t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 果

2.1 hBMSC的增殖情況

正常對(duì)照組、高糖對(duì)照組和基質(zhì)實(shí)驗(yàn)組hBMSC增殖的OD值進(jìn)行方差分析，發(fā)現(xiàn)各組hBMSC增殖的OD值并不相等（F=247.35，P=0.0001）。與正常對(duì)照組OD值（1.453±0.164）比較，高糖對(duì)照組hBMSC的OD值（0.618±0.110）明顯降低，二者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與高糖對(duì)照組比較，基質(zhì)實(shí)驗(yàn)組hBMSC的細(xì)胞增殖OD值（1.294±0.135）升高比較明顯，二者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

2.2 脫細(xì)胞真皮基質(zhì)結(jié)構(gòu)

掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，未脫細(xì)胞的皮膚比較致密，見圖1A；脫細(xì)胞真皮基質(zhì)幾乎不含細(xì)胞，纖維組織比較豐富，空隙較大，見圖1B。

圖1 掃描電鏡觀察正常皮膚或脫細(xì)胞真皮基質(zhì)的形態(tài)

2.3 各組hBMSC的BMP-1染色和掃描電鏡觀察

與高糖對(duì)照組比較，基質(zhì)實(shí)驗(yàn)組BMP-1染色陽性的細(xì)胞明顯增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Q=9.535，P＜0.01），見圖2A、2B。掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，hBMSC突起較多，與脫細(xì)胞真皮基質(zhì)黏附在一起，生長狀態(tài)良好，見圖2C。

圖2 各組hBMSC在脫細(xì)胞真皮基質(zhì)的生長和成骨分化

2.4 ALP、BMP-1蛋白的檢測

與未脫細(xì)胞皮膚比較，脫細(xì)胞真皮基質(zhì)的ALP蛋白含量降低（P＜0.05）；相對(duì)于未脫細(xì)胞皮膚，脫細(xì)胞真皮基質(zhì)組的BMP-1蛋白含量降低（P＜0.05），見表1。與高糖對(duì)照組比較，基質(zhì)實(shí)驗(yàn)組的ALP蛋白含量明顯增高（P＜0.01）；相對(duì)于高糖對(duì)照組，基質(zhì)實(shí)驗(yàn)組的BMP-1蛋白含量明顯增高（P＜0.01），見表2。

表1 正常條件下未脫細(xì)胞皮膚與脫細(xì)胞真皮基質(zhì)的ALP、BMP-1含量（μg/mL，n=24）

表1 正常條件下未脫細(xì)胞皮膚與脫細(xì)胞真皮基質(zhì)的ALP、BMP-1含量（μg/mL，n=24）

注：ALP：堿性磷酸酶；BMP-12：骨形成蛋白-1

組別ALP BMP-1未脫細(xì)胞皮膚脫細(xì)胞真皮基質(zhì)t值P值11.352±0.841 1.386±0.538 48.894 0.037 17.121±0.915 2.823±0.393 70.339 0.021

表2 高糖條件下對(duì)照組與基質(zhì)實(shí)驗(yàn)組的ALP、BMP-1含量（μg/mL，，n=24）

表2 高糖條件下對(duì)照組與基質(zhì)實(shí)驗(yàn)組的ALP、BMP-1含量（μg/mL，，n=24）

注：ALP：堿性磷酸酶；BMP-12：骨形成蛋白-1

組別ALP BMP-1對(duì)照組基質(zhì)實(shí)驗(yàn)組t值P值4.539±0.221 8.947±0.625 118.712 0.00001 5.204±0.180 10.468±0.853 57.851 0.0001

3 論

隨著世界經(jīng)濟(jì)、交通高速發(fā)展，全球骨損傷的發(fā)病率逐年增加；外傷、感染或腫瘤切除導(dǎo)致的骨組織損傷、骨延遲愈合或不連接問題是世界性骨科難題。糖尿病及其并發(fā)癥已經(jīng)成為困擾人們的重要疾病，由于糖尿病的高血糖狀態(tài)常常導(dǎo)致多種離子、多糖成分代謝紊亂，進(jìn)而發(fā)生糖尿病性骨質(zhì)疏松等骨疾?。?］，嚴(yán)重影響著患病人群的健康和生命質(zhì)量。

骨組織除了含有較多血管、神經(jīng)纖維外，還含有大量骨細(xì)胞，對(duì)骨的再生修復(fù)具有重要意義。雖然利用MSC分化為骨細(xì)胞對(duì)促進(jìn)骨組織損傷具有重要意義［10］，但是，如果能夠在三維環(huán)境下激發(fā)間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化活性，將對(duì)利用組織工程技術(shù)促進(jìn)糖尿病性骨損傷修復(fù)具有重要意義。皮膚是人體最大的器官，再生能力非常強(qiáng)，如果利用宿主皮膚構(gòu)建組織工程材料將降低患者排斥反應(yīng)，皮膚中含有的3D結(jié)構(gòu)和有效的活性因子將有效促進(jìn)種子細(xì)胞分化和生長，對(duì)治療糖尿病骨病等具有重要意義。研究發(fā)現(xiàn)，存在于骨髓、脂肪等多種組織的MSC，具有多分化性能、易適應(yīng)局部微環(huán)境生存等特咖［11］。在缺血性心臟病、糖尿病足皮膚潰瘍等許多由于缺氧引起的疾病治療中，利用MSC細(xì)胞治療技術(shù)或MSC組織工程技術(shù)具有喜人的治療效果和廣泛的應(yīng)用［12］，并認(rèn)為MSC的多分化特性更適用于糖尿病等多種組織損傷的病例［12］。也有研究發(fā)現(xiàn)，高糖缺氧環(huán)境會(huì)導(dǎo)致組織產(chǎn)生大量活性氧（reactive oxygen species，ROS）［13］，ROS粒子比較微小，由于存在未配對(duì)的自由電子，因此ROS十分活躍，呈現(xiàn)一種不穩(wěn)定自由基狀態(tài)，往往導(dǎo)致細(xì)胞膜脂質(zhì)、蛋白質(zhì)等發(fā)生變性，造成MSC、血管內(nèi)皮細(xì)胞等細(xì)胞器損傷，細(xì)胞生物活性降低，造成組織損傷等［14］。因此，抗高糖損傷一直是移植MSC技術(shù)確保移植細(xì)胞正常生長和分化的關(guān)鍵問題。如果利用自體生物組織材料既可以避免生物排斥反應(yīng)，又可以促進(jìn)MSC生長，達(dá)到修復(fù)骨組織損傷的目的，將較好地解決高糖環(huán)境下，移植的MSC活性降低等問題。相對(duì)于腸黏膜等部位組織，皮膚是人體最大的淺表器官，取材方便，再生能力強(qiáng)，符合自體生物組織材料的篩選條件［15］。

皮膚的細(xì)胞外基質(zhì)主要由膠原蛋白、纖維蛋白、整合素等多糖或蛋白質(zhì)構(gòu)成復(fù)雜的三維結(jié)構(gòu)，并具有良好的孔隙率和豐富的細(xì)胞活性因子等條件，可以更好地利于體內(nèi)細(xì)胞的生長［16］，如果良好模擬細(xì)胞的體內(nèi)生長基質(zhì)，將對(duì)細(xì)胞的生長具有積極作用。近年來發(fā)現(xiàn)，MSC、內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPC）在靜電紡絲制作的三維納米生物材料上尚能正常生長，并對(duì)糖尿病足具有促進(jìn)愈合的作用［17-18］，這些成果提示，構(gòu)建脫細(xì)胞的皮膚細(xì)胞外基質(zhì)會(huì)具有較好的三維立體結(jié)構(gòu)，皮膚基質(zhì)中的VEGF、EGF等多種細(xì)胞活性因子能夠促進(jìn)種植的MSC生長，對(duì)維持MSC功能、促進(jìn)MSC分化具有重要影響。在本實(shí)驗(yàn)中，掃描電鏡下也可以觀察到脫細(xì)胞真皮基質(zhì)的纖維組織間隙較大，纖維縱橫交錯(cuò)，細(xì)胞結(jié)構(gòu)分成非常少，說明皮膚脫細(xì)胞比較徹底，排除了皮膚細(xì)胞對(duì)實(shí)驗(yàn)的干擾。說明利用梯度SDS法脫細(xì)胞簡單可行。相對(duì)于高糖對(duì)照組，基質(zhì)實(shí)驗(yàn)組MSC增殖的OD值明顯升高，MSC在脫細(xì)胞真皮基質(zhì)的生長狀態(tài)良好，說明脫細(xì)胞真皮基質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)更好地模擬了體內(nèi)細(xì)胞生長環(huán)境［19］，適合MSC在高糖環(huán)境的生長，此外，還可能是由于皮膚基質(zhì)含有一定量的VEGF、EGF等細(xì)胞因子，這些因子對(duì)促進(jìn)細(xì)胞生長和黏附于三維介質(zhì)具有積極作用［20］，研究也發(fā)現(xiàn)，基質(zhì)實(shí)驗(yàn)組的MSC分化為成果細(xì)胞能力明顯強(qiáng)于高糖對(duì)照組，這進(jìn)一步說明脫細(xì)胞真皮基質(zhì)的確含有成骨誘導(dǎo)因子，可以促進(jìn)MSC分化為成骨細(xì)胞。本研究利用BMP-1染色的手段，也發(fā)現(xiàn)基質(zhì)實(shí)驗(yàn)組BMP-1染色的陽性細(xì)胞數(shù)明顯高于高糖對(duì)照組，說明脫細(xì)胞真皮機(jī)制包含的VEGF等因子［15］積極促進(jìn)了MSC在脫細(xì)胞真皮基質(zhì)向成骨細(xì)胞分化。

綜上所述，利用脫細(xì)胞真皮基質(zhì)將對(duì)保護(hù)MSC抗高糖缺氧損傷，為促進(jìn)MSC分化為成骨細(xì)胞帶來機(jī)遇。由于皮膚基質(zhì)中含有大量成骨因子，如果將含MSC的脫細(xì)胞真皮基質(zhì)移植到糖尿病組織損傷區(qū)域，將對(duì)加快修復(fù)糖尿病性組織疾病具有重要意義。下一步擬將血管活性因子、趨化因子等轉(zhuǎn)染到MSC內(nèi)，構(gòu)建含修飾后MSC的人工皮膚，觀察MSC組織工程治療糖尿病骨損傷，動(dòng)員血管內(nèi)皮細(xì)胞等宿主細(xì)胞歸巢，加速組織損傷修復(fù)的作用和機(jī)制，為移植MSC的臨床應(yīng)用和細(xì)胞歸巢的研究提供基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)。

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Detection of human bonemarrow mesenchym al stem cells integrate rabbit acellular dermal matrix stenting of in vitro osteogenesis ability in high glucose environment

ZHANG Yuting SUN Quan SHA Feng SUN Shizhu YAO Lijie LIJingping SHEN Lei
Department of Anatomy，QiqiharMedical School，Heilongjiang Province，Qiqihar 161006，China

Objective To investigate the protective effect of human bonemarrowmesenchymal stem cells（hBMSC）with the acellular dermalmatrix stenting in the high glucose environment，and the differentiation ability with the promotion form human bone marrow mesenchymal stem cells to osteoblasts.Methods Acellular dermal matrix and the high glucose model of containing 300 mmol/L glucose were established.With the high glucose environment，hBMSC was cultured to be the controlgroup.With the high glucose condition，hBMSC was planted to be the acellular dermalmatrix experimental group.With the normal condition，hBMSC was planted to be the normal control group.All groups had the osteoblasts induction experiment，the proliferation of hBMSC was detected by using MTT.the osteoblasts differentiation of hBMSC was detected by using fluorescence staining，and the content of BMP-1 and ALP in the experiment groups was detected by using ELISA.Results Compared with the high glucose control group，cell proliferation and matrix optical density（OD）of the hBMSCmatrix experiment group was increased，with significant statistic difference（P＜0.01）；hBMSC was in good condition in the acellular dermalmatrix.The number of BMP-1 positive cells in the culture group was significantly higher than that in the high glucose group（P＜0.01）；The contents of BMP-1，ALP proteins were significantly increased（P＜0.01）.Conclusion In the high glucose environment，the acellular dermalmatrix has the significantpromotion of differentiation from hBMSC to osteoblasts.

High glucose；Bonemarrow mesenchymal stem cells；Acellular dermalmatrix；Osteoblast

R318.06

A

1673-7210（2016）05（c）-0021-04

2016-01-29本文編輯：趙魯楓）

黑龍江省教育廳面上項(xiàng)目（12541901）。

張彧婷（1978-），女，碩士，主要從事骨組織修復(fù)研究。

沈雷（1975-），男，碩士，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事干細(xì)胞組織工程與再生醫(yī)學(xué)研究。