高建鵬，田明星，鮑衍清，李　朋，劉佳萌，王少輝，丁　鏟，于圣青

（中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所，上海200241）

流產(chǎn)布魯菌ppdk基因缺失株的構(gòu)建及其生物學特性分析

高建鵬，田明星，鮑衍清，李朋，劉佳萌，王少輝，丁鏟，于圣青

（中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所，上海200241）

布魯菌病是由布魯菌感染引起的呈全球性分布的人畜共患細菌性傳染病。布魯菌是一種兼性胞內(nèi)菌，感染宿主依賴多種基因的表達和調(diào)控。近年來，胞內(nèi)菌的碳代謝與致病力的關(guān)系成為研究的熱點。前期研究發(fā)現(xiàn)碳代謝相關(guān)的丙酮酸磷酸雙激酶（ppdk）基因與布魯菌毒力相關(guān)。本研究利用同源重組方法構(gòu)建流產(chǎn)布魯菌ppdk基因缺失株，通過環(huán)境壓力因子耐受性實驗、胞內(nèi)存活實驗和動物致病性實驗等探討ppdk基因?qū)Σ剪斁玖Φ挠绊憽＝Y(jié)果顯示，ppdk基因缺失能減弱布魯菌對多粘菌素B和大牛血清的抵抗性，減弱細菌胞內(nèi)存活的能力和對小鼠的致病力，表明ppdk基因與流產(chǎn)布魯菌的毒力密切相關(guān)。

流產(chǎn)布魯菌；ppdk基因；毒力

布魯菌病是一種重要的人畜共患細菌性傳染病，病原為布魯菌，革蘭氏染色呈陰性。布魯菌感染主要導致懷孕動物流產(chǎn)、子宮炎、關(guān)節(jié)炎和公畜睪丸炎等，感染人可引起類似流感的波狀熱，轉(zhuǎn)為慢性后，主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)炎以及生育障礙，較難治愈，對人和動物健康構(gòu)成重大威脅[1-3]。布魯菌與其他致病菌相比，無經(jīng)典的毒力因子，如質(zhì)粒、莢膜，外毒素等[4]，其毒力主要體現(xiàn)在入侵宿主細胞并在胞內(nèi)增殖的能力[5]，布魯菌毒力相關(guān)基因的研究一直是國內(nèi)外學者研究的重點。

近年來，碳代謝對胞內(nèi)細菌毒力影響的研究成為新的熱點，碳代謝調(diào)控可能是胞內(nèi)病原菌適應胞內(nèi)生存的重要機制，如單核李斯特桿菌中的丙酮酸羧化酶基因（PycA）缺失株，其胞內(nèi)存活能力和對小鼠的致病性均減弱[6]；在志賀氏菌中與分支酸鹽合成相關(guān)的aroC和aroD基因、鳥苷一磷酸合成相關(guān)的guaA和guaB基因、胸苷酸合成相關(guān)的thyA基因均與細菌毒力相關(guān)[7,8]；結(jié)核桿菌的酰基輔酶A脫氫酶基因（fadE28）、烯酰輔酶A水合酶（echA20）等缺失后均導致細菌毒力顯著降低[9]。因此，碳代謝相關(guān)基因研究對于闡明胞內(nèi)菌致病機制具有重要意義。

布魯菌是一種典型的兼性胞內(nèi)寄生菌，胞內(nèi)碳代謝在其致病過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。在前期研究中，我們發(fā)現(xiàn)糖異生相關(guān)的丙酮酸磷酸雙激酶基因（ppdk）與流產(chǎn)布魯菌的毒力密切相關(guān)，該酶可逆催化磷酸烯醇式丙酮酸生成丙酮酸。本研究利用同源重組技術(shù)構(gòu)建流產(chǎn)布魯菌的ppdk基因缺失株，并對其部分生物學特性進行分析，表明ppdk基因是布魯菌發(fā)揮致病性必不可少的基因。本研究為探討碳代謝在流產(chǎn)布魯菌致病過程中的作用提供重要參考。

1　材料和方法

1.1質(zhì)粒、菌種及試劑流產(chǎn)布魯菌S2308株、小鼠巨噬細胞RAW264.7 由中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所保存；6～8周齡BABL/c品系小鼠購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司；大豆胰蛋白胨肉湯（TSB）購于BD公司；DH5α、質(zhì)粒提取試劑盒購自天根（Tiangen）生化科技有限公司；pSC質(zhì)粒由本課題組構(gòu)建和保存；Trizol總RNA提取試劑盒購于Invitrogen公司；RT-PCR試劑盒、Ligation Mix試劑盒以及各種限制性內(nèi)切酶購自大連寶生物工程有限公司；熒光定量試劑購于Promega公司；TURBO DNA-free kit、膠回收試劑盒、二氧化碳培養(yǎng)箱購自Thermo Fisher公司；生物安全柜購自LABCONCO公司；電轉(zhuǎn)儀購自BIO-RAD公司；搖床購自蘇州威爾實驗用品有限公司；電泳儀、全自動凝膠圖像處理系統(tǒng)購自上海天能科技公司。

1.2引物設計根據(jù)GenBank（NC_007618.1）公布的流產(chǎn)布魯菌S2308株基因組全序列，用Primer Premier 5.0軟件設計引物，引物序列見表1。

表1　本研究中所用引物序列Table 1　Primers used in this study

1.3自殺質(zhì)粒pSC-ppdk構(gòu)建參照文獻[10]，構(gòu)建pSC-ppdk自殺質(zhì)粒。以布魯菌S2308株基因組為模板，ppdk-UF/ppdk-UR為引物，擴增ppdk基因上游片段（1096 bp）；以ppdk-DF/ppdk-DR為引物，擴增ppdk基因下游（1027 bp）片段。瓊脂糖凝膠電泳回收上下游片段。以回收上下游片段為模板，ppdk-UF/ppdk-DR為引物，進行重疊PCR融合上下游片段。膠回收，純化PCR產(chǎn)物。用限制性內(nèi)切酶Xba I分別酶切回收產(chǎn)物和pSC質(zhì)粒（4018 bp）。Liagtion Mix連接酶切產(chǎn)物和pSC質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，陽性重組質(zhì)粒命名為pSC-ppdk質(zhì)粒。小量中提質(zhì)粒后，Xba I酶切鑒定自殺質(zhì)粒，酶切鑒定正確的質(zhì)粒送至上海英濰捷基公司測序。

1.4ppdk缺失株的構(gòu)建參照文獻[10]，流產(chǎn)布魯菌S2308株TSB培養(yǎng)至對數(shù)期，置于冰水混合物中，冰浴15 min；4℃、6000×g離心5 min，收集菌體；用滅菌去離子水洗滌菌體2遍，10%的甘油水懸浮沉淀，調(diào)整菌體濃度為2×1010CFU/mL，100 μL分裝；加入0.5～1 μg自殺質(zhì)粒pSC-ppdk，冰浴10 min，加入電極杯中，在2.4 kV、400Ω條件下將自殺質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細菌中，立即加入37℃預熱的TSB，體外復蘇培養(yǎng)過夜；涂布氨芐抗性TSB平板篩選，將篩選出的單菌落接種至無抗性TSB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)期；稀釋菌液后涂布于含5%蔗糖TSB平板進行篩選，挑取單菌落于無抗性的TSB中培養(yǎng)，PCR鑒定陽性克隆，25%甘油凍存細菌缺失株。通過實時熒光定量PCR（qRT-PCR）進一步分析ppdk基因缺失對上下游基因是否產(chǎn)生極性效應。

1.5細菌RNA的提取及qRT-PCR分析將流產(chǎn)布魯菌S2308株和ppdk缺失株培養(yǎng)至對數(shù)生長期，取0.2 mL新鮮菌液加入1 mL Trizol裂解液，劇烈震蕩，充分裂解，根據(jù)試劑盒說明書提 取細菌總RNA。使用TURBO DNA-free kit去除污染基因組，NanoDrop ND-1000分光光度計測定上清中RNA的濃度。取RNA溶液20 μL，參照TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄程序：37℃ 15 min；85℃5s。qRT-PCR反應體系為20 μL，其中，GoTaq qPCR mix 10 μL、上下游引物各0.5 μL（10 pmol/ μL）、cDNA1 μL，ddH2O補足20 μL。反應條件：95℃預變性 2 min；95℃變性 15 s，60℃退火和延伸 1 min，循環(huán)次數(shù)40次。以細菌GAPDH基因為內(nèi)參進行校準，用2-ΔΔCt（Livak）法來計算待測基因轉(zhuǎn)錄水平。

1.6生長曲線測定將培養(yǎng)至對數(shù)期的野毒株和缺失株稀釋至OD600≈1.0，按照1:100比例接種至TSB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)，分別于不同時間點取樣測定OD600值，每株菌重復3次，計算平均值，繪制細菌的生長曲線。

1.7耐受性試驗將野毒和缺失株培養(yǎng)至對數(shù)生長中期（OD600≈1.0），用無菌PBS溶液稀釋菌液至濃度約為4×105CFU/mL，分別取等體積細菌懸液與待測溶液混合，37℃作用1 h，10倍梯度稀釋后涂布TSA平板，37℃培養(yǎng)3～5 d，計數(shù)細菌菌落數(shù)，以PBS組做對照，計算細菌存活率。雙氧水耐受試驗用于測定細菌抗氧化應激能力，所用雙氧水終濃度為1、2.5、5 mmol/L；多粘菌素B耐受性試驗用于測定細菌抗陽性殺菌肽能力，所用多粘菌素B終濃度為50、100、200 μg/mL；大牛血清耐受性試驗用于測定細菌抗自然血清殺菌能力，所用大牛血清終濃度為50%，滅活的50%大牛血清做陰性對照。

1.8胞內(nèi)存活試驗小鼠巨噬細胞系 RAW264.7接種于24孔細胞培養(yǎng)板中，每孔接種細胞約5×105個，37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)至單層，PBS洗滌細胞2遍，每孔加500 μL DMEM。TSB培養(yǎng)細菌至對數(shù)生長期（OD600≈1.0），調(diào)整細菌濃度至 4×109CFU/ mL，然后接種至細胞中，接種MOI約為200:1。為保證同步感染，將接種細菌的培養(yǎng)板置于水平離心機中，400×g室溫離心5 min，37℃孵育1 h，用DMEM培養(yǎng)基洗滌細胞3次，去除未黏附的胞外細菌，用含有100 μg/mL慶大霉素DMEM培養(yǎng)基孵育2 h殺死未入侵細胞的細菌。用DMEM培養(yǎng)基洗滌細胞3次，此時間點計為2 h。隨后更換含有慶大霉素20 μg/mL的DMEM培養(yǎng)基維持細胞，于感染后8、24、48 h去除培養(yǎng)基，PBS洗滌3次，用0.2% Triton X-100裂解細胞，10倍梯度稀釋后涂布TSA平板進行細菌菌落計數(shù)，比較ppdk缺失株和野毒株胞內(nèi)存活能力。

1.9小鼠致病性分析參照文獻[10]，將野生株、ppdk缺失株接種于TSB中，培養(yǎng)至對數(shù)期（OD600≈1.0），用PBS稀釋至1×107CFU/mL。將6～8周齡的BABL/c小鼠分為2組，每組12只，分別腹腔注射野毒和缺失株稀釋液（0.1 mL/只）。感染后第1周和第5周每組各撲殺老鼠6只，取脾臟稱重后，加5 mL 0.2%TritonX-100水研磨脾臟組織，10倍梯度稀釋后涂布TSA平板，37℃、5%CO2中培養(yǎng)3～5 d，計算脾臟重量以及脾臟載菌量。

2　結(jié)果

2.1質(zhì)粒構(gòu)建PCR擴增ppdk基因上游片段大小為1096 bp，下游片段為1027 bp，融合PCR后片段大小為2123 bp，如圖1所示，PCR擴增結(jié)果與預期結(jié)果一致。將自殺質(zhì)粒pSC-ppdk經(jīng)XbaΙ酶切鑒定，得到4018 bp和2123 bp兩個片段（見圖1），并將其送至上海英濰捷基公司測序，測序結(jié)果正確，無堿基突變。

圖1　自殺質(zhì)粒的構(gòu)建Fig. 1　Construction of the suicide plasmid

2.2缺失株構(gòu)建經(jīng)過氨芐抗生素和蔗糖兩輪篩選，采用內(nèi)側(cè)引物進行PCR鑒定，鑒定引物擴增位置如圖2A所示，結(jié)果顯示，缺失株無特異性條帶擴增，與預期結(jié)果一致（圖2B），ppdk基因缺失成功。qRT-PCR結(jié)果顯示缺失株中檢測不到ppdk基因的轉(zhuǎn)錄，并且ppdk基因的缺失并不影響上下游基因的轉(zhuǎn)錄（圖2C）。可見，該基因缺失并未對上下游基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生極性效應。

2.3生長曲線測定結(jié)果結(jié)果顯示，ppdk缺失株生長與野毒株略有差異，在生長早期（≤8 h）和對數(shù)生長前期（8～20 h），ppdk缺失對布魯菌生長影響不大，然而，在對數(shù)生長中晚期（20～48 h），ppdk缺失株生長明顯慢于野生株。當細菌生長達到平臺期以后（≥48 h），兩者之間無明顯差異（圖3）。結(jié)果表明，ppdk基因的缺失對細菌對數(shù)生長中晚期有明顯影響(P≤0.05)，對其他生長階段無影響。

圖2　PCR和qRT-PCR鑒定Δppdk缺失株Fig. 2　Identifi cation of the Δppdk mutant by PCR and qRT-PCR

圖3　流產(chǎn)布魯菌S2308株和ppdk缺失株生長曲線測定(*, P≤0.05)Fig. 3　Determination of bacterial growth curves for Brucella S2308 strain and Δppdk mutant (*, P≤0.05)

2.4ppdk缺失株胞內(nèi)存活試驗分析結(jié)果顯示，與野毒株相比，ppdk缺失株在感染細胞24 h后，其胞內(nèi)細菌載量明顯降低。感染48 h后，二者胞內(nèi)載菌量差異更加顯著，約為10倍差異?？梢?，ppdk基因缺失影響布魯菌的胞內(nèi)存活。

圖4　流產(chǎn)布魯菌S2308株和ppdk缺失株在巨噬細胞內(nèi)存活測定(***, P≤0.001; ****, P≤0.0001)Fig. 4　Detection of intracellular survival of Brucella S2308 strain and Δppdk mutant in macrophages (***, P≤0.001; ****, P≤0.0001)

2.5耐受性試驗結(jié)果比較Δppdk和S2308對雙氧水、多粘菌素B和大牛血清敏感性發(fā)現(xiàn)，ppdk缺失減弱布魯菌對大牛血清和多粘菌素B的抵抗性（圖5A、B），而對雙氧水的抵抗性兩者差異無明顯統(tǒng)計學意義（圖5C）。在血清殺菌試驗中，ppdk缺失株存活能力明顯低于野毒，存活率僅為45%，野毒存活率達到80%左右（圖5A）。在多粘菌素B抵抗性試驗中，當多粘菌素B濃度為50 μg/mL時，ppdk缺失株存活率僅為20%，顯著低于野毒株，隨著多粘菌素B濃度的增加，二者差異更為顯著（圖5B）。

2.6ppdk缺失株對小鼠的致病力分析脾臟是布魯菌感染的靶器官之一，通常將脾臟腫脹程度和脾臟載菌量作為評價細菌致病力的重要指標[11]。為了進一步分析ppdk基因?qū)Σ剪斁玖Φ挠绊?，用野毒和缺失株感染成年BABL/c小鼠評價細菌毒力，在感染小鼠1周和5周后，分別測定脾臟重量和脾臟載菌量。結(jié)果顯示，感染1周后，ppdk缺失株在小鼠體內(nèi)載菌量顯著降低，低于野毒近2log值（約200倍），脾臟重量（腫脹程度）也顯著降低，低于野毒約0.1 g。在感染5周時，ppdk缺失株載菌量差異更加顯著，低于野毒約6log值，脾臟腫脹差異也更加顯著，缺失株感染小鼠脾臟重量低于野毒近0.2 g（圖6）。該結(jié)果表明，ppdk基因缺失明顯減弱布魯菌對小鼠的致病力。

3　討論

布魯菌作為胞內(nèi)寄生菌，能在感染細胞內(nèi)獲取足夠的營養(yǎng)或能量是其營寄生生活的關(guān)鍵。其中，碳代謝是細菌生長所必需的重要代謝途徑，據(jù)報道，多種碳代謝相關(guān)基因與布魯菌相關(guān)。豬種布魯菌gluP、gnd、rbsK、pyc、pgi等基因缺失明顯減弱細菌胞內(nèi)存活能力[12-14]，羊種布魯菌的毒力與dbsA、ugpA、glpD及若干赤酰糖醇代謝基因相關(guān)[15,16]，而流產(chǎn)布魯菌gluP、gnd、gltD、gcvB基因的缺失對其致病性同樣發(fā)揮著重要作用[17-19]，由此可見，碳代謝對布魯菌完成胞內(nèi)復制并發(fā)揮致病作用起到關(guān)鍵作用。

在前期研究中，我們發(fā)現(xiàn)ppdk與布魯菌毒力相關(guān)，本研究對ppdk缺失株的生物學特性進行了分析。ppdk缺失首先影響布魯菌在對數(shù)生長中晚期的生長，在體外營養(yǎng)豐富的TSB培養(yǎng)基中，布魯菌主要通過葡萄糖酵解途徑獲取能量，其中ppdk可以催化磷酸烯醇式丙酮酸轉(zhuǎn)化丙酮酸釋放1分子ATP，可能在為布魯菌快速生長提供能量中發(fā)揮一定的作用。此外，ppdk又作為糖異生的關(guān)鍵酶，在合成六碳糖中發(fā)揮著重要的作用。布魯菌營胞內(nèi)寄生偏噬代謝三碳和四碳糖[20,21]。丙酮酸在細胞內(nèi)貯存豐富，是很多胞內(nèi)寄生菌利用的主要組分。布魯菌糖異生途徑對于其胞內(nèi)存活和致病性發(fā)揮至關(guān)重要作用，ppdk在糖異生中極有可能幫助布魯菌合成六碳糖，而六碳糖是細菌脂多糖、核糖等分子合成的基本組分，脂多糖在布魯菌抵抗不利環(huán)境壓力因子方面發(fā)揮重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)ppdk缺失株減弱對多粘菌素B和自然血清的抵抗性，預示ppdk缺失可能影響布魯菌外膜結(jié)構(gòu)。據(jù)報道流產(chǎn)布魯菌ppdk缺失株在基礎培養(yǎng)基中產(chǎn)生凝集現(xiàn)象[22]，同樣預示著布魯菌外膜結(jié)構(gòu)發(fā)生重要變化，與我們報道的結(jié)果一致。外膜結(jié)構(gòu)修飾可能改變細菌表面電荷分布，提高了對陽性殺菌肽以及自然血清中補體殺菌的敏感性。這一假設同樣解釋ppdk在感染小鼠早期減毒的原因，感染早期ppdk缺失株抵抗小鼠體內(nèi)先天免疫殺菌因子的能力減弱，不能順利定植于網(wǎng)狀內(nèi)皮組織系統(tǒng)，如肝臟和脾臟等。定植于胞內(nèi)的細菌不能最優(yōu)的利用胞內(nèi)三碳或四碳糖代謝，最終不能在宿主體內(nèi)建立慢性感染而被清除，這可能是ppdk缺失株毒力減弱的主要原因之一。

圖5　布魯菌耐受性試驗(*, P≤0.05; ***, P≤0.001; ****, P≤0.0001)Fig. 5　Tolerance analysis of Brucella(*, P≤0.05; ***, P≤0.001; ****, P≤0.0001)

圖6　布魯菌S2308株和ppdk缺失株對小鼠致病性分析(**, P≤0.01; ****, P≤0.0001)Fig. 6　Analysis of Brucella S2308 strain and Δppdk mutant virulence to mouse (**, P≤0.01; ****, P≤0.0001）

綜上所述，本研究通過構(gòu)建ppdk基因缺失株并測定缺失株的生物學特性，為進一步研究ppdk基因的功能及其胞內(nèi)菌碳代謝與毒力的相關(guān)性提供了重要資料，為布魯菌代謝缺陷型減毒活疫苗研究奠定了基礎。

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CONSTRUCTION AND BIOLOGICAL CHARACTERIZATION OF A PPDK MUTANT OF BRUCELLA ABORTUS

GAO Jian-peng, TIAN Ming-xing, BAO Yan-qing, LI Peng, LIU Jia-meng, WANG Shao-hui, DING Chan, YU Sheng-qing

(Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China)

Brucellosis caused by Brucella spp. has been one of the most prevalent bacterial zoonosis worldwide. The etiological agent is a facultative intracellular bacterium, and infects hosts depending on the expression and regulation of virulence genes. Recently, one research hotpot is about links between carbon metabolism and virulence for intracellular bacteria. In our previous study, we found that a metabolism related pyruvate phosphate dikinase (ppdk) encoded by ppdk gene was associated with Brucella virulence. In this study, we constructed a ppdk mutant via homologous recombination method. In order to study the function of ppdk gene on Brucella virulence, we tested its resistance to environmental stress factors, survival within RAW264.7 cells and pathogenecity to BALB/c mice. As compared with the wild-type parent strain S2308, the ppdk mutant was more sensitive to polymyxin B and natural bovine serum, decreased survival ability within RAW264.7, and attenuated virulence in mice, suggesting that ppdk gene plays a crucial role on the Brucella virulence.

Brucella abortus; ppdk gene; virulence

S852.614

A

1674-6422（2016）03-0027-08

2016-03-16

中國農(nóng)業(yè)科學院科技創(chuàng)新工程專項經(jīng)費(SHVRI-ASTIP-2014-8)；中國博士后科學基金面上資助(2015M570184)；中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務費(2016JB06)

高建鵬，男，碩士研究生，預防獸醫(yī)學專業(yè)

于圣青，E-mail：yus@shvri.ac.cn