王　棟，王少輝，孟慶美，劉　新，許　漩，楊登輝，韓先干，丁　鏟，張煥榮，于圣青

（1. 西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，成都610041；2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

禽致病性大腸桿菌Ⅵ型分泌系統(tǒng)2 evfC基因缺失株的構(gòu)建及其生物學(xué)特性分析

王棟1,2，王少輝2，孟慶美2，劉新2，許漩2，楊登輝2，韓先干2，丁鏟2，張煥榮1，于圣青2

（1. 西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，成都610041；2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

為了分析VI型分泌系統(tǒng)2（Type VI secretion system2，T6SS2）核心組分EvfC對禽致病性大腸桿菌（Avian pathogenic Escherichia coli，APEC）生物學(xué)特性及致病性的影響，本研究采用Red同源重組系統(tǒng)構(gòu)建APEC evfC基因缺失株，并利用低拷貝質(zhì)粒pSTV28構(gòu)建互補株。然后比較分析野生株、缺失株與互補株的生長曲線、運動性、生物被膜形成能力、黏附侵襲能力、胞內(nèi)存活能力、動物致病力等生物學(xué)特性差異。結(jié)果表明，evfC基因缺失不影響APEC的生長速度、運動性、生物被膜形成能力、黏附侵襲能力。然而，缺失evfC可導(dǎo)致APEC在HD-11胞內(nèi)存活能力及對雛鴨的致病力降低。本研究為闡述APEC T6SS2的致病作用提供了參考依據(jù)。

禽致病性大腸桿菌；Ⅵ型分泌系統(tǒng)2；evfC基因；缺失

禽致病大腸桿菌（Avian pathogenic E. coli，APEC）屬于腸道外致病性大腸桿菌（Extraintestinal pathogenic E. coli，ExPEC），能夠引起雞、鴨和其他禽類局部或全身感染，造成家禽較高的死亡率和發(fā)病率，嚴(yán)重危害我國養(yǎng)禽業(yè)的健康發(fā)展[1]。另外，APEC與人ExPEC具有共同的毒力因子和致病機制，能夠引起人和哺乳動物發(fā)病[2,3]，對人類具有潛在威脅。

病原菌的毒力往往與毒力因子有關(guān)，毒力因子的轉(zhuǎn)運需要分泌系統(tǒng)的參與。Ⅵ型分泌系統(tǒng)（typeⅥ secretion system，T6SS）是僅存于革蘭陰性菌中一種蛋白轉(zhuǎn)運系統(tǒng)，屬于接觸依賴性分泌系統(tǒng)，能夠一步將效應(yīng)蛋白分泌到胞外或者靶細(xì)胞內(nèi)。研究表明T6SS與APEC的毒力有關(guān)[4]，然而T6SS在不同的細(xì)菌、不同的環(huán)境下具有不同甚至相反的功能，比如增強細(xì)菌毒力[5]、調(diào)節(jié)菌間關(guān)系[6]、以及抑制細(xì)菌的復(fù)制和毒力等[7]。T6SS由20多種蛋白組成，其中細(xì)胞器運輸?shù)鞍踪|(zhì)（DotU）、溶血素共調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)（Hcp）、纈氨酸谷氨酸重復(fù)蛋白（VgrG）、ATP水解酶（ClpB）和胞內(nèi)增殖蛋白（intracellular multiplication factor，IcmF）是其核心蛋白。DotU具有穩(wěn)定蛋白分泌裝置的作用，與細(xì)菌毒力密切相關(guān)[8，9]。Hcp是六形環(huán)長管道結(jié)構(gòu)，VgrG具有類似于T4噬菌體的針尖樣結(jié)構(gòu)，Hcp能夠和VgrG連接，利用VgrG穿刺包細(xì)胞膜將效應(yīng)蛋白注入靶細(xì)胞[10]。Hcp和VgrG不僅是T6SS結(jié)構(gòu)蛋白，而且還是T6SS的效應(yīng)蛋白。ClpB是AAA+ATP超家族的成員，具有ATP酶區(qū)域，普遍認(rèn)為其為分泌系統(tǒng)提供能量[11]。IcmF有3個跨膜螺旋結(jié)構(gòu)，參與穩(wěn)定分泌系統(tǒng)，IcmF（SciS）在沙門菌致病過程中發(fā)揮重要作用[12]。然而，但I(xiàn)cmF（EvfC）對APEC毒力的影響尚不清楚。因此，我們構(gòu)建了APEC DE719菌株T6SS2分泌系統(tǒng)evfC基因的缺失株及其互補株，對其生物特性進(jìn)行分析，為進(jìn)一步研究APEC的致病力提供參考。

1　材料與方法

1.1菌株、質(zhì)粒、細(xì)胞和實驗動物APEC菌株DE719由本實驗室自病鴨體內(nèi)分離，經(jīng)鑒定為O2血清型，對雞、鴨具有致病性[8]；大腸桿菌DH5α購自天根（北京）生化科技有限公司；質(zhì)粒pKD46、pKD3、pCP20、pSTV28由本實驗室保存；雞成纖維細(xì)胞DF-1和禽巨噬細(xì)胞HD-11由本實驗室保存；1日齡櫻桃谷鴨購自江蘇省江陰市某種鴨場。

1.2主要試劑和儀器質(zhì)粒提取試劑盒購自天根（北京）生化科技有限公司；2×PCR Mix、DNA Marker購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；L-阿拉伯糖購自Sigma公司；限制性內(nèi)切酶購自大連TaKaRa公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自Gibco公司；PCR儀購自ABI公司；電轉(zhuǎn)化儀購自Bio-Rad公司。

1.3引物設(shè)計根據(jù)APEC DE719菌株T6SS2基因序列（GenBank登錄號：KM251715.1），設(shè)計evfC基因缺失引物、缺失鑒定引物及互補引物（表1），由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成。

表1　本研究中使用的引物Table 1　Primers used in this study

1.4缺失株及互補株構(gòu)建利用Red同源重組系統(tǒng)[13]構(gòu)建evfC基因缺失株。首先以引物evfC缺失-F/evfC缺失-R擴增含有evfC上下游基因同源臂的氯霉素抗性片段，將其電轉(zhuǎn)化入表達(dá)Red同源重組酶的DE719感受態(tài)細(xì)胞中，涂布氯霉素抗性平板。挑取單克隆，采用PCR及測序鑒定evfC基因缺失株。以DE719基因組為模板，以引物evfC互補-F/evfC互補-R擴增evfC基因，經(jīng)雙酶切后克隆至pSTV28質(zhì)粒，構(gòu)建互補質(zhì)粒pSTV28-evfC。測序正確后電轉(zhuǎn)化入缺失株DE719ΔevfC中，構(gòu)建互補株DE719CΔevfC。

1.5生長曲線及運動性測定測定不同菌株的生長速度及運動性，分析T6SS核心組分EvfC是否影響APEC的生長及運動特性。取新鮮培養(yǎng)的菌液，按1:100接種于LB培養(yǎng)基，37℃、200 r/m振蕩培養(yǎng)，每小時取樣并測定菌液的OD600，記錄并繪制生長曲線圖。培養(yǎng)至OD600=1時，將1 μL新鮮菌液分別點樣于0.3%瓊脂LB平板上，37℃靜置培養(yǎng)12 h，測定細(xì)菌運動直徑。

1.6生物被膜形成能力測定采用96孔微孔板法測定不同菌株的生物被膜形成能力。將野生株DE719、evfC基因缺失株、evfC基因互補株新鮮菌液按每孔200 μL加入96孔聚苯乙烯微孔板，37℃培養(yǎng)24 h。棄去培養(yǎng)液，用無菌PBS洗滌3次后加入200 μL結(jié)晶紫溶液染色30 min。然后用無菌PBS洗滌5次，自然風(fēng)干后加入200 μL 95%乙醇，作用5～10 min，測定OD595，以無菌培養(yǎng)基作為陰性對照。

1.7細(xì)胞黏附與侵襲試驗將新鮮培養(yǎng)菌液用DMEM洗滌后，按MOI=100感染雞成纖維細(xì)胞DF-1，于37℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中感染2 h，以DMEM作為陰性對照。然后以無菌PBS洗滌后，用Triton-X 100裂解細(xì)胞并倍比稀釋，涂平板，進(jìn)行菌落計數(shù)。細(xì)胞侵襲試驗與細(xì)胞黏附試驗的感染方式相同，感染2 h后以無菌PBS洗滌3次，用含有慶大霉素的DMEM作用1 h殺死胞外細(xì)菌。然后用Triton-X 100裂解細(xì)胞并倍比稀釋，涂平板，進(jìn)行菌落計數(shù)。

1.8胞內(nèi)存活試驗檢測不同菌株在禽吞噬細(xì)胞HD-11內(nèi)存活能力，細(xì)菌及細(xì)胞的準(zhǔn)備同黏附及侵襲試驗。細(xì)菌感染HD-11細(xì)胞1 h后，用PBS洗滌3次，再用含慶大霉素（100 μg/mL）的DMEM作用1 h殺死胞外細(xì)菌，此時計為侵襲始點（0 h），然后用含慶大霉素的DMEM繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞6、12、24 h，分別裂解細(xì)胞，倍比稀釋涂平板，進(jìn)行菌落計數(shù)，繪制胞內(nèi)存活曲線。

1.9LD50測定將處于對數(shù)生長期細(xì)菌用無菌PBS洗滌、重懸，調(diào)整OD600=1，10倍梯度稀釋后，以腿部肌肉注射攻毒7日齡櫻桃谷鴨（0.2 mL/只），每個稀釋度注射8只，連續(xù)觀察7 d，記錄發(fā)病死亡情況，按照改良寇氏法計算半數(shù)致死量（LD50）。

2　結(jié)果

2.1基因缺失株、互補株的構(gòu)建及鑒定挑取疑似基因缺失株進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果顯示缺失株DE719ΔevfC內(nèi)側(cè)鑒定引物無法擴增出evfC基因（圖1A）；外側(cè)鑒定引物可以擴增出替換evfC基因的氯霉素抗性片段（1623 bp）（圖1B）。PCR產(chǎn)物測序結(jié)果表明缺失株DE719ΔevfC構(gòu)建成功。以DE719基因組為模板，利用互補引物擴增evfC基因互補片段，構(gòu)建pSTV28-evfC互補質(zhì)粒，測序正確后，電轉(zhuǎn)化入缺失株DE719ΔevfC中，獲得互補株DE719CΔevfC（結(jié)果未展示）。

圖1　內(nèi)外側(cè)引物鑒定基因缺失株DE719ΔevfCFig. 1　Identifi cation of mutant strain DE719ΔevfC with different primers

2.2生長曲線和運動性檢測生長曲線結(jié)果顯示DE719、DE719ΔevfC和DE719CΔevfC的生長速度無顯著差異，表明evfC基因不影響DE719的生長速度（圖2A）?；蛉笔е昙盎パa株的運動性與野生株相比差異不具備顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（圖2B），表明T6SS2核心組分EvfC不影響APEC的運動性。

圖2　野生株DE719、缺失株DE719ΔevfC和互補株DE719 CΔevfC的生長曲線和運動性Fig. 2　Growth kinetics and motility assays of DE719, DE719ΔevfC and DE719CΔevfC

2.3生物被膜形成能力測定生物被膜形成能力測定結(jié)果顯示，DE719ΔevfC的生物被膜形成能力與野生株相同，表明T6SS2核心組分EvfC不影響APEC DE719生物被膜的形成（圖3）。

圖3　野生株DE719、缺失株DE719ΔevfC和互補株DE719 CΔevfC的生物被膜生成能力測定Fig. 3　Determination of the bacterial biofi lm formation for DE719, DE719ΔevfC and DE719CΔevfC

2.4黏附侵襲試驗黏附侵襲結(jié)果顯示，缺失株DE719ΔevfC對DF-1細(xì)胞的黏附侵襲能力高于野生株DE719，然而差異不具備顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（圖4），表明evfC基因不影響APEC對DF-1細(xì)胞的黏附及侵襲。

圖4　野生株DE719、缺失株DE719ΔevfC和互補株DE719 CΔevfC對DF-1細(xì)胞黏附侵襲能力Fig. 4　Adhesion and invasion capacity of DE719, DE719ΔevfC and DE719 CΔevfC to DF-1 cells

2.5胞內(nèi)存活能力檢測胞內(nèi)存活試驗結(jié)果顯示，缺失株DE719ΔevfC對禽巨噬細(xì)胞HD-11的侵襲能力高于野生株DE719，但差異不具備顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。然而，缺失株DE719ΔevfC在HD-11細(xì)胞內(nèi)的存活能力顯著低于野生株（P＜0.05），但互補株DE719CΔevfC的胞內(nèi)存活能力沒有回復(fù)到野生株水平（圖5）。

圖5　野生株DE719、缺失株DE719ΔevfC和互補株DE719ΔevfC的胞內(nèi)存活能力檢測Fig. 5　Invasion and intracellular survival capacity of DE719, DE719ΔevfC and DE719CΔevfC

2.6致病力測定分別以DE719、缺失株DE719ΔevfC和互補株DE719CΔevfC感染雛鴨，結(jié)果顯示缺失株DE719ΔevfC的致病力下降了1.5倍，但是互補株的致病力沒有回復(fù)到野生株水平。

表2　野生株DE719、缺失株DE719ΔevfC和互補株DE719ΔevfC的半數(shù)致死量結(jié)果Table 2　Calculations of LD50for DE719, DE719ΔevfC and DE719CΔevfC

3　討論

T6SS普遍存在于革蘭陰性菌中，超過四分之一的不同菌種的已測序革蘭陰性菌中都存在T6SS基因簇，其屬于Sec依賴性分泌系統(tǒng)。T6SS的功能具有多樣性，大部分位于細(xì)菌的毒力基因島上[14]，提示其與致病菌的致病力密切相關(guān)。但是T6SS并非只與致病力有關(guān)，共生菌的T6SS具有抑制自身毒力的作用，條件性致病菌的T6SS則可能涉及細(xì)菌間相互競爭[10]。同一細(xì)菌可以擁有多套T6SS，在致病過程中發(fā)揮不同作用。在APEC基因組發(fā)現(xiàn)了3個不同T6SS（T6SS1、T6SS2、T6SS3），其中T6SS1與腸黏附性大腸桿菌的T6SS相似，其核心組件ClpV和Hcp參與肌動蛋白在上皮細(xì)胞重排。T6SS3由于缺少核心組分Hcp和FHA，不具備分泌功能。T6SS2與新生兒腦膜炎大腸桿菌（newborn meningitis E. coli，NMEC）具有很高的同源性。NMEC菌株RS218的T6SS2核心組件Hcps在黏附和侵襲人腦血管內(nèi)皮細(xì)胞、細(xì)胞因子和趨化因子的釋放、細(xì)胞凋亡等過程中發(fā)揮重要作用[15]。我們前期已經(jīng)證實T6SS2核心組分Hcp、VgrG、DotU和ClpB與APEC致病性密切相關(guān)，本研究通過構(gòu)建evfC基因缺失株和互補株，分析EvfC對APEC生物學(xué)特性和致病性的影響。

本研究采用Red同源重組系統(tǒng)構(gòu)建APEC DE719菌株evfC基因缺失株，可獲得無耐藥性基因缺失株，不會存在生物安全隱患。Red同源重組系統(tǒng)的另外一個優(yōu)點是不會對缺失基因的下游基因產(chǎn)生極性效應(yīng)，因此廣泛用于大腸桿菌、沙門菌等細(xì)菌的基因缺失株構(gòu)建[13]。生物學(xué)特性分析結(jié)果表明T6SS2核心組分EvfC不影響APEC的生長速度、運動性、生物被膜的形成。細(xì)胞試驗結(jié)果顯示evfC缺失株與野生株對DF-1細(xì)胞和HD-11細(xì)胞的黏附侵襲能力無明顯差異，表明T6SS2核心組分EvfC在 APEC黏附及侵襲細(xì)胞過程中不發(fā)揮作用。然而，de Pace等[16]證明APEC T6SS中的icmF基因缺失株與野生株相比對上皮細(xì)胞的黏附侵襲能力、胞內(nèi)增殖能力、生物被膜生成能力、運動性均降低。綠膿假單胞菌中T6SS（H1-T6SS、H2-T6SS和H3-T6SS）分別發(fā)揮不同作用，其中H1-T6SS針對原核生物發(fā)揮毒性作用，H2-T6SS和H3-T6SS主要參與細(xì)菌和宿主相互作用[17]。APEC也擁有三套T6SS，其作用亦不相同[18]，因此在APEC T6SS1和T6SS2的 IcmF（EvfC）缺失株表現(xiàn)出不同的生物學(xué)特性。

胞內(nèi)存活試驗結(jié)果表明缺失株DE719ΔevfC在HD-11胞內(nèi)的存活能力顯著低于野生株，因此導(dǎo)致DE719ΔevfC對雛鴨的致病力下降。然而，互補株的胞內(nèi)存活能力及致病力均未回復(fù)至野生株水平，有可能因為質(zhì)?；パa不能使EvfC發(fā)揮穩(wěn)定T6SS系統(tǒng)作用。研究表明沙門菌T6SS IcmF（SciS）及嗜肺性軍團(tuán)菌T4SS IcmF（EvfC）具有維持分泌系統(tǒng)穩(wěn)定的作用，從而有利于細(xì)菌在細(xì)胞內(nèi)的增殖[12,19]。本研究與其他研究結(jié)果一致，表明EvfC對細(xì)菌在胞內(nèi)的生存繁殖發(fā)揮重要作用。本研究分析了T6SS2核心組分EvfC對APEC生物學(xué)特性和致病性的影響，為深入研究T6SS2的功能及防控禽大腸桿菌病提供參考。

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CONSTRUTION AND BIOLOGICAL CHARACTERISTICS ANALYSIS OF TYPE VI SECRETION SYSTEM 2 CORE COMPONENT EVFC MUTANT IN AVIAN PATHOGENIC ESCHERICHIA COLI

WANG Dong1,2, WANG Shao-hui2, MENG Qing-mei2, LIU Xin2, XU Xuan2, YANG Deng-hui2, HAN Xian-gan2, DING Chan2, ZHANG Huan-rong1, YU Sheng-qing2

(1. College of Life Science and Technology, University of Southwest Nationalities, Chengdu 610041, China; 2. Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China)

To determine the roles of type VI secretion system 2 core component EvfC in Avian pathogenic Escherichia coli (APEC), we constructed the evfC gene mutant strain and complementary strain of APEC DE719 by the Red recombination system and low-copy plasmid pSTV28. Then the growth curve, motility, biofilm formation, adhesion and invasion capacity, intracellular survival capacity and virulence to duck of wild-type strain, mutant strain and complementary strain were compared and analyzed. The results showed that inactivation of evfC gene did not affect the growth, motility capacities, biofi lm formation, nor the adhesion and invasion capacities of APEC. However, the evfC gene mutant showed signifi cantly decreased survival capacity and attenuated virulence in ducks. These study would help us to understand the pathogenicity T6SS 2 in APEC.

Avian pathogenic Escherichia coli; type VI secretion system 2; evfC gene; mutant

S852.612

A

1674-6422（2016）03-0021-06

2016-03-16

國家自然科學(xué)基金項目(31572523、31370045)；公益性農(nóng)業(yè)（科研）專項項目（201303044）；上海市科技興農(nóng)重點攻關(guān)項目（滬農(nóng)科攻字(2015)第1-9號）

王棟，男，碩士研究生，預(yù)防獸醫(yī)學(xué)專業(yè)

于圣青，E-mail：yus@shvri.ac.cn；張煥容，E-mail：zhrong05@163.com；王少輝，E-mail：shwang0827@126.com