石　坤，魏建超，邱亞峰，張克龍，李宗瑞，劉茜倩，李蓓蓓，劉　珂，邵東華，陳立志，馬志永

（1.中國農(nóng)業(yè)科學院特產(chǎn)研究所，長春 130117；2.中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

PCV2與PRRSV體外共感染對肺泡巨噬細胞系炎癥反應的影響

石坤1,2，魏建超2，邱亞峰2，張克龍2，李宗瑞2，劉茜倩2，李蓓蓓2，劉珂2，邵東華2，陳立志1，馬志永2

（1.中國農(nóng)業(yè)科學院特產(chǎn)研究所，長春 130117；2.中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

為了探討豬圓環(huán)病毒2型（Porcine circovirus type 2，PCV2）與豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）共感染后調(diào)控炎癥反應的機制，選用穩(wěn)定表達CD163的PAM細胞系3D4/21，分別設PCV2、PRRSV、PCV2+PRRSV（接種PCV2后12 h接種PRRSV）共感染組和對照組，利用間接免疫熒光檢測（indirect immuno fluorescene assay，IFA）方法檢測PCV2和PRRSV在PAM-CD163上的陽性率，采用RT-PCR檢測IL-6、IL-8、IL-1β、IL-10表達量的動態(tài)變化。結果顯示PCV2和PRRSV均能感染PAM-CD163；PCV2單獨感染PAM-CD163，早期促進了IL-6、IL-8、IL-1β的表達，晚期促進IL-10表達；PRRSV單獨感染PAM-CD163能在晚期促進IL-1β、IL-10的表達；與PCV2單獨感染PAM-CD163相比，PCV2+PRRSV共感染促進了IL-10表達并且持續(xù)增加；與PRRSV單獨感染PAM-CD163相比，PCV2+PRRSV共感染促使IL-6、IL-8、IL-1β的表達量較早出現(xiàn)增加，并且持續(xù)增加?？梢妰煞N病毒之間存在一定的相互作用，共同調(diào)節(jié)機體免疫系統(tǒng)。本研究結果有助于解析PRRSV與PCV2共感染調(diào)控炎癥反應的機理。

豬圓環(huán)病毒2型；豬繁殖與呼吸綜合征病毒；共感染；PAM-CD163；細胞因子

豬繁殖與呼吸綜合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）感染引起的，以母豬發(fā)熱、厭食、早產(chǎn)、流產(chǎn)、死胎、弱仔等繁殖障礙及各種年齡豬的呼吸系統(tǒng)疾病和高死亡率為特征?，F(xiàn)在PRRS已成為世界性疾病，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失[1]，在我國也呈蔓延趨勢。PRRSV 感染后導致嚴重的間質(zhì)性肺炎，提示炎癥反應在 PRRSV 的致病和組織損傷中具有十分重要的作用[2]。圓環(huán)病毒2型（Porcine circivirus type 2，PCV2）是斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（post weaning multisystemic wasting syndrome，PMWS）的主要病原體[3]。PCV2和PRRSV混合感染與PCV2單獨感染相比，出現(xiàn)了嚴重的增生性間質(zhì)性肺炎，損傷嚴重的絕大數(shù)組織細胞中可以檢測到PCV2和PRRSV抗原[4]。同時PCV2和PRRSV均能通過激活NF-κB信號通路促進炎性細胞因子的表達[5,6]。通過之前對PCV2流行病學調(diào)查和我們對上海市豬場疫病檢測結果表明，PCV2分布極為廣泛，并且多為混合感染，其中PCV2與 PRRSV的混合感染在PCV2陽性豬中占很大比例，在豬群中更加劇了規(guī)?；i場疫病的復雜性[7]。豬肺泡巨噬細胞（porcine alveolar macrophage，PAM）是PCV2與 PRRSV共同的靶細胞，并且是肺部免疫最早接觸病原微生物的免疫防御細胞之一，在豬執(zhí)行天然免疫和特異性免疫時起重要功能[8]。本研究采用穩(wěn)定表達CD163的PAM細胞系3D4/21，觀察兩種病毒在該細胞中的增殖規(guī)律，并檢測細胞因子IL-6、IL-8、IL-1β、IL-10的mRNA水平，從而分析PRRSV和PCV2共感染對PAM的炎癥反應的影響。

1　材料與方法

1.1毒株、質(zhì)粒和細胞PCV2 SH株由本實驗室分離并保存，TCID50為10-5/mL；PRRSV JX1株由本實驗室保存，TCID50為10-6.8/mL；PCV2和PRRSV陽性質(zhì)粒和PAM-CD163細胞系由上海獸醫(yī)研究所茅翔研究員惠贈。

1.2主要試劑質(zhì)粒小提快速試劑盒購自Omega公司；Trizol、Primes STAR HS DNA聚合、快速反轉錄試劑、viral RNA/ DNA extraction Kit和SYBR?Green Real-time PCR Master Mix盒均購自TaKaRa公司；膠回收試劑盒購自天根公司；RPMI1640、胎牛血清和胰酶購于Gibco公司；羊抗豬二抗和羊抗小鼠二抗購自Invitrogen公司；DAPI染料購自Sigma公司。

1.3實驗設計在12孔細胞板上接種PAM-CD163，接種細胞量為2.5×105/孔。分為4組，分別為PCV2單獨感染、PRRSV單獨感染、PCV2+PRRSV共感染（先接種PCV2，12 h后接種PRRSV）以及空白對照組。各組要求接種1MOI的PCV2和PRRSV，空白對照組接種等體積的細胞培養(yǎng)液。分別在感染后24、36、48、60 h檢測每組中兩種病毒滴度、各種細胞因子的mRNA動態(tài)水平。

1.4間接免疫熒光法（indirect immunofluorescene assay，IFA）檢測PCV2和PRRSV用4%多聚甲醛于4℃固定細胞，加入PCV2陽性豬血清或者PRRSV的N蛋白單抗，37℃作用30 min，PBS洗3次，每次5 min；加入羊抗豬熒光二抗或者FITC-羊抗小鼠熒光二抗，37℃作用30 min，PBS洗3次，每次5 min；DAPI染色10 min于室溫，PBS洗3次，每次5 min；熒光顯微鏡下觀察。

1.5SYBR Green實時RT-PCR法檢測細胞因子mRNA的變化按Trizol試劑盒說明書提取細胞總mRNA，用實驗室已建立的實時RT-PCR定量檢測，檢測結果通過管家基因GAPDH校正，用2-△△Ct法與空白對照組作相對定量比較。

1.6數(shù)據(jù)統(tǒng)計對獲得每組檢測樣品中細胞因子及看家基因Ct值，應用2-△△Ct法對各組細胞因子進行比較，并進行t-檢驗差異分析。

2　結果

2.1PCV2和PRRSV檢測時間點的確定在感染PCV2和PRRSV的12、24、36、48 h后，用IFA分別檢測各組PCV2和PRRSV的感染情況，結果顯示，與24、36 h和對照組相比，PCV2單獨感染組中，PCV2感染48 h后陽性率最高，病毒主要均勻分布在胞漿和胞核內(nèi)，見圖1B。PCV2 +PRRSV混合感染組48 h 時，PCV2陽性率最高，并且熒光強度更強，見圖1C。PCV2單獨感染組中，病毒感染后36 h，感染率有所增加，見圖1B。PCV2 +PRRSV混合感染組中，病毒感染24 h后，出現(xiàn)PCV2感染的陽性細胞，見圖1B。PRRSV單獨感染組中，PRRSV感染24 h后陽性細胞率開始增加，36 h時達到最大，48 h時PRRSV陽性細胞率又開始減少，見圖1A。PCV2 +PRRSV混合感染組中病毒感染后的24、36、48 h 中PRRSV陽性細胞持續(xù)增加。

圖1　PCV2(A)，PRRSV(B)和PCV2+PRRSV(C)感染PAM-CD163的間接免疫熒光檢測Fig. 1　PCV2 (A), PRRSV(B) and PCV2+PRRSV(C) detection in PAM-CD163 by IFA

2.2相對定量PCR檢測細胞因子IL-6、IL-8、IL-1β、IL-10的mRNA的表達PCV2與PRRSV單獨感染均可刺激IL-6、IL-8、IL-1β、IL-10的表達。PRRSV單獨感染PAM-CD163組中，在晚期IL-1β、IL-10的表達量迅速上升；PCV2單獨感染PAM-CD163時，細胞因子IL-6、IL-8、IL-1β持續(xù)大量表達，感染后期IL-10表達量顯著增加。與PCV2單獨感染PAM-CD163相比，PCV2/PRRSV共感染促進了IL-10表達并且持續(xù)增加；與PRRSV單獨感染PAM-CD163相比，PCV2/PRRSV共感染促使IL-6、IL-8、IL-1β的表達量較早出現(xiàn)增加，并且持續(xù)增加。

圖2　不同時間點各感染組中IL-6、IL-8、IL-10、IL-1βmRNA的檢測結果(*P＜0.05,**P＜0.01)Fig. 2　Effects of PCV2 and/or PRRSV infection on the secretion of IL-6，IL-8，IL-10，IL-1β mRNA in PAMCD163 at different points post infection(*P＜0.05,**P＜0.01)

3　討論

大量流行病學研究表明，PCV2與其他病原體混合感染是造成養(yǎng)豬業(yè)嚴重損失的重要因素。其中PCV2與 PRRSV的混合成為PMWS的常見病原，并且呈上升趨勢。2001年美國的流行病學調(diào)查顯示，兩種病毒的混合感染率為60%[7]，在荷蘭有PMWS臨床癥狀的豬場中PRRSV和PCV2的混合感染率高達83%，無PMWS癥狀的豬群中PRRSV和PCV2的混合感染率為35%[8]。我國華東地區(qū)PRRSV和PCV2的混感率達47.7%[9]。同時兩種病毒感染均能引起免疫抑制，增強機體對多種病原體易感性，引起嚴重的臨床癥狀[10]。

PAM能夠抵御各種病原體的感染，是肺臟初級防御中的重要細胞，同時又是PCV2與 PRRSV 共同的靶細胞[11]。研究發(fā)現(xiàn)PRRSV最顯著的作用是破壞PAM，減少肺內(nèi)PAM的數(shù)量，同時感染后期刺激PAM分泌大量細胞因子介導炎癥反應。本研究IFA結果顯示PCV2和PRRSV均能感染PAM-CD163，并且能持續(xù)感染。PCV和PRRSV混合感染可造成PAM大量死亡，破壞肺部的初級防御系統(tǒng)，為兩種病毒的擴散和疾病的發(fā)展提供了有利的條件。IL-6、IL-8、IL-1β均是重要的促炎性反應細胞因子，在病毒感染中致炎過程中扮演著十分重要的角色。IL-6連同與促炎性細胞因子IL-1β一起產(chǎn)生。IL-6通常在機體急性反應的情況下被誘導，參與調(diào)節(jié)炎癥反應[12]。IL-8也稱CXCL8，是一種促炎性CXC家族的趨化因子家族中一員，其趨化活性最強，對中性粒細胞、嗜酸性粒細胞和T淋巴細胞有強烈趨化作用，在炎癥反應和免疫調(diào)節(jié)中起重要作用[13]。IL-1β是一種主要由巨噬細胞、單核細胞、淋巴細胞共同產(chǎn)生的促炎性細胞因子，是機體調(diào)節(jié)免疫和炎癥反應的中心介質(zhì)，能介導多種炎癥反應，誘導致炎性細胞因子的基因表達及分泌[14]。IL-10是一種重要的免疫抑制因子，抑制單核細胞介導的促炎因子，如IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α和巨噬細胞刺激因子，IL-10在肺部炎癥中是主要的調(diào)節(jié)者，但IL-10過量表達能抑制機體免疫反應和削弱對病原微生物的清除能力[15]。本研究中，PRRSV單獨感染時IL-1β、IL-10后期表達量顯著增加；PCV2單獨感染時，IL-6、IL-8、IL-1β表達量持續(xù)增顯著加；PCV2 /PRRSV共感染時，IL-6、IL-8、IL-1β表達量較PCV2單獨感染有所減少，IL-10表達量比PRRSV單獨感染時減少?？赡苁谴傺滓蜃覫L-6、IL-8、IL-1β與免疫抑制因子IL-10之間產(chǎn)生一定相互抑制作用，說明PRRSV和PCV2之間可能相互干擾和影響，調(diào)節(jié)機體免疫系統(tǒng)，使得促炎因子IL-6、IL-8、IL-1β和抑炎因子IL-10的表達發(fā)生改變。推測共感染早期，由于PCV2先感染，誘導PAM產(chǎn)生IL-6、IL-8、IL-1β，三者均引起肺部的炎癥反應，激活肺部淋巴細胞，提高血管的通透性，誘導發(fā)熱，招募中性粒細胞、嗜堿性細胞等活動，共感染后期PRRSV產(chǎn)生的IL-1β加劇了肺部的炎癥反應，從而引起肺臟炎性細胞浸潤和肺組織損傷。

總之，PRRSV與PCV2共感染可能引起炎癥反應嚴重失衡導致免疫系統(tǒng)紊亂，影響特異性免疫功能的正常運轉，以及機體免疫應答的有效發(fā)揮和對病毒的有效清除。

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INFLAMMATORY RESPONES OF A PULMONARY ALVEOLAR MACROPHAGE IN VITRO RESPONSE TO PORCINE CIRCOVIRUS TYPE 2 AND PORCINE REPRODUCTIVE AND RESPIRATORY SYNDROME VIRUS CO-INFECTION

SHI Kun1,2, WEI Jian-chao2, QIU Ya-feng2, ZHANG Ke-long2, LI Zong-rui2, LIU Xi-qian2, LI Bei-bei2, LIU Ke2, SHAO Dong-hua2, CHEN Li-zhi1, MA Zhi-yong2

(1. Institute of Special Wild Economic Animal and Plant Science, CAAS, Changchun 130117, China; 2. Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China)

This study was to determine pathogenesis of co-infection of Porcine circovirus type 2 (PCV2) and Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) in vitro. A cell line stably expressing CD163 (designated PAM-CD163) were infected with PCV2, PRRSV and PCV2+PRRSV. The changes of mRNAs of cytokines (IL-6, IL-8, IL-1β, IL-10) in PAM-CD163 were analyzed using a realtime fl uorescent quantitative PCR (real-time FQ-PCR) and indirect immunofl uorescence assay (IFA). The results showed that both PCV2 and PRRSV could replicate in PAM-CD163. When PAM-CD163 was infected with PCV2 alone, the expression of IL-6, IL-8, IL-1β increased at early stage, and IL-10 increased at later stage. While in PAM-CD163 infected with PRRSV, the expression levels of IL-1β,IL-10 were promoted in advanced stage. IL-6, IL-8 and IL-1β in PAM-CD163began to grow under PCV2+PRRSV co-infection ahead of that under PCV2 infection, and the increase continued. The fi ndings suggested there were interaction between PCV2 and PRRSV in regulating the immune system.

Porcine circivirus type 2(PCV2); Porcine reproductive and respiratory syndrome virus(PRRSV); co-infection; PAM-CD163; cytokines

S852.659.6

A

1674-6422（2016）03-0016-05

2016-01-12

國家重點基礎研究發(fā)展計劃（2014CB542703）

石坤，女，碩士研究生，預防獸醫(yī)學專業(yè)

馬志永，E-mail：zhiyongma@shvri.ac.cn；陳立志，E-mail：tcsclz@126.com