嚴(yán)　妍，張錦霞，王東方，鄭光來(lái)，張守峰，扈榮良

（1. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)春 130118；2. 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所 吉林省人獸共患病預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)春 130122）

馬源抗犬瘟熱病毒免疫球蛋白的制備

嚴(yán)妍1,2，張錦霞2，王東方1,2，鄭光來(lái)2，張守峰2，扈榮良2

（1. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)春 130118；2. 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所 吉林省人獸共患病預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)春 130122）

將犬瘟熱病毒（Canine distemper virus，CDV）疫苗株接種Vero細(xì)胞，連續(xù)培養(yǎng)至TCID50為10-4.625/mL。采用肋間肌多點(diǎn)注射方法免疫馬，4周后每2周采集血液，分離血清，病毒中和試驗(yàn)測(cè)定血清中中和抗體效價(jià)，最高值達(dá)到212.5。以硫酸銨沉淀法純化IgG，病毒中和試驗(yàn)測(cè)定其中和抗體效價(jià)可達(dá)214。通過(guò)肌注犬觀察，無(wú)明顯不良反應(yīng)。研究結(jié)果證明，本試驗(yàn)制備的馬源免疫球蛋白可用于犬的抗體治療，為犬瘟熱的治療制劑研發(fā)開(kāi)辟了新方向。

犬瘟熱病毒；純化；免疫球蛋白；馬

犬瘟熱（canine distemper，CD）是由犬瘟熱病毒（Canine distemper virus，CDV）感染動(dòng)物引起的致死性全身性疾病，危害嚴(yán)重。CDV主要通過(guò)發(fā)病動(dòng)物的帶毒排泄物經(jīng)呼吸道感染，通過(guò)淋巴系統(tǒng)迅速傳播[1]，引起嚴(yán)重的免疫抑制從而引起疾病。部分動(dòng)物出現(xiàn)神經(jīng)癥狀（包括行為的改變、肌肉抽搐和痙攣），感染后可能長(zhǎng)期散毒。CDV對(duì)食肉動(dòng)物普遍易感[2]。不同感染動(dòng)物臨床癥狀嚴(yán)重程度差異很大，在某些物種能引起嚴(yán)重的全身性疾病從而導(dǎo)致死亡。

犬瘟熱可以通過(guò)免疫接種預(yù)防，常用疫苗包括五聯(lián)苗或六聯(lián)苗等弱毒活疫苗或滅活疫苗[3]。目前尚無(wú)特效的藥物治療方法，臨床上可采用皮下注射高免血清[4]或單克隆抗體治療。高免血清多為犬源血清，制備過(guò)程需宰殺免疫犬，而單克隆抗體價(jià)格昂貴且供應(yīng)量不足。本實(shí)驗(yàn)室通過(guò)用犬瘟熱病毒免疫馬獲得異源高免血清并經(jīng)傳統(tǒng)方法純化，可為犬瘟熱治療制劑的制備和生產(chǎn)提供新的途徑。

1　材料和方法

1.1毒株和細(xì)胞CDV疫苗株3株、Vero細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保存；細(xì)胞培養(yǎng)基為含 5%胎牛血清（購(gòu)自FBS）的DMEM（購(gòu)自Gibco公司）。

1.2病毒TCID50測(cè)定使用Vero細(xì)胞在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中進(jìn)行，結(jié)果按K?ber法計(jì)算[5]。

1.3抗CDV血清制備健康馬2匹，兩側(cè)肋間肌多點(diǎn)注射接種CDV病毒細(xì)胞培養(yǎng)物（104.625TCID50/0.1mL），80 mL/匹，每周免疫1次，連續(xù)免疫4周后，從第6周開(kāi)始頸靜脈采血，每2周采集1次，每次采集3 L。采集的血液樣品，4℃過(guò)夜后，7000 ×g離心20 min分離血清。

1.4抗CDV血清中和抗體效價(jià)的測(cè)定在96孔微型培養(yǎng)板中加入100μL 5% DMEM培養(yǎng)基，將待測(cè)血清56℃滅活30 min后，吸取50μL待測(cè)血清加入第1列孔內(nèi)，進(jìn)行倍比稀釋，設(shè)立4個(gè)重復(fù)，6個(gè)梯度。每孔加入100 TCID50CDV(50μL)，37℃中和1 h后，每孔加20 000個(gè)（50μL）Vero細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，觀察細(xì)胞病變情況。設(shè)立正常Vero細(xì)胞為陰性對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照為接毒Vero細(xì)胞。

1.5硫酸銨沉淀法粗純化血清IgG按文獻(xiàn)[6]的方法適當(dāng)改進(jìn)。400 mL血清中加入等體積生理鹽水溶液，邊攪拌邊逐滴加入2倍體積的飽和硫酸銨溶液，4℃靜置90 min后，4℃、5000 ×g離心30 min，棄上清，保留沉淀。沉淀重新溶于400 mL生理鹽水溶液，邊攪拌邊滴加1/2體積飽和硫酸銨溶液，4℃靜置90 min，4℃、5000 ×g離心30 min，棄上清，保留沉淀，重復(fù)此步驟2次。將沉淀溶于100 mL生理鹽水溶液中，放入透析袋中于生理鹽水中充分透析。

1.6純化IgG中和抗體效價(jià)的測(cè)定方法同步驟1.4。

1.7SDS-PAGE 凝膠電泳分析純化的IgG用SDSPAGE鑒定其純度[7]。

1.8IgG安全性實(shí)驗(yàn)健康3月齡比格犬5只，每只犬肌注兩倍劑量[8]（2 mL）純化免疫球蛋白，觀察1周。

2　結(jié)果

2.1病毒培養(yǎng)病毒接種于Vero細(xì)胞中，48 h細(xì)胞開(kāi)始出現(xiàn)典型病變（圖1），細(xì)胞大量融合，產(chǎn)生顆粒樣變性、空泡。72 h后細(xì)胞逐漸脫落。

圖1　犬瘟熱病毒在Vero細(xì)胞中的培養(yǎng)結(jié)果Fig. 1　Culture results of Canine distemper virus in Vero cells

2.2病毒TCID50測(cè)定病毒連續(xù)培養(yǎng)至第9代，按K?ber法計(jì)算病毒滴度，CDV病毒最高滴度為T(mén)CID50=10-4.625/mL。

2.3抗CDV血清中和抗體效價(jià)的測(cè)定馬抗CDV血清中和抗體效價(jià)最高為212.5/mL，表明以CDV免疫制備的馬血清能夠有效中和CDV，具備純化應(yīng)用條件。

2.4純化IgG中和抗體效價(jià)的測(cè)定病毒中和試驗(yàn)測(cè)定粗提IgG中和抗體效價(jià)最高為214/mL，表明粗提的免疫球蛋白能夠有效中和CDV。

2.5SDS-PAGE 凝膠電泳分析將鹽析法純化的免疫球蛋白與蛋白A提取IgG相比較，結(jié)果顯示兩種方法獲得的免疫球蛋白純度均較高，白蛋白去除比較徹底，電泳均呈現(xiàn)清晰的重鏈和輕鏈條帶[9]（圖2）。

圖2　純化IgG的SDS-PAGE檢測(cè)Fig. 2　Identifi cation of purifi ed IgG by SDS-PAGE

2.6IgG安全性實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)5只健康比格犬肌注IgG后1周內(nèi)，注射部位無(wú)紅腫、發(fā)熱、明顯壓痛等炎癥反應(yīng)。所有受試犬均未出現(xiàn)發(fā)熱、寒戰(zhàn)、食欲減退等不良反應(yīng)，皮膚未出現(xiàn)過(guò)敏癥狀。結(jié)果表明單次肌注該免疫球蛋白不會(huì)引起犬的過(guò)敏反應(yīng)，對(duì)犬是安全的，可以用于犬的犬瘟熱治療。

3　討論

犬瘟熱是由CDV感染引起的一種致死性的全身性疾病。CDV可引起幼小動(dòng)物的高死亡率[10]。目前小動(dòng)物通過(guò)疫苗可以預(yù)防犬瘟熱，但是沒(méi)有可行有效地藥物治療方法。本實(shí)驗(yàn)將測(cè)定滴度為T(mén)CID50=10-4.625/mL的CDV免疫馬，在馬體內(nèi)免疫反應(yīng)良好，能持續(xù)穩(wěn)定產(chǎn)生一定水平的抗體。制備的抗CDV血清中和抗體效價(jià)最高可達(dá)212.5，該滴度血清可以達(dá)到治療犬瘟熱的效果。

本研究最初選用市售國(guó)產(chǎn)五聯(lián)苗和進(jìn)口三聯(lián)苗進(jìn)行免疫，由單次免疫1支疫苗增加到單次免疫3支，但均未有抗體產(chǎn)生或抗體水平很低。原因可能是疫苗在保存過(guò)程中，病毒逐漸失活，實(shí)際免疫效率有所降低。疫苗中病毒含量無(wú)法定量，很難確定免疫毒量，選用細(xì)胞培養(yǎng)物可精確計(jì)算免疫毒量，利于后期實(shí)驗(yàn)結(jié)果評(píng)價(jià)。本研究所得細(xì)胞培養(yǎng)物病毒滴度高，成本低廉，可刺激機(jī)體產(chǎn)生高水平抗體，并且持續(xù)穩(wěn)定，具有廣闊的發(fā)展前景。

馬源血清對(duì)于犬來(lái)說(shuō)屬于異源蛋白，多次注射可能引起機(jī)體過(guò)敏反應(yīng)。本研究獲得的IgG效價(jià)較高，單次注射即可能實(shí)現(xiàn)對(duì)犬瘟熱病情的控制，這在一定程度上避免了多次注射可能引起的不良反應(yīng)，對(duì)比格犬進(jìn)行肌注試驗(yàn)，結(jié)果顯示該免疫球蛋白安全性良好，對(duì)犬是安全適用的。

分離純化通常采用綜合技術(shù)，其中鹽析沉淀法常用于IgG粗制品的提取。蛋白質(zhì)在不同濃度的鹽溶液中相對(duì)溶解度不同，血清免疫球蛋白主要為γ-球蛋白，在一定濃度中性鹽溶液中易于沉淀，而其他蛋白質(zhì)組分不易沉淀，通過(guò)離心可將兩者分離。經(jīng)硫酸銨沉淀法粗提所得到的IgG，病毒中和試驗(yàn)測(cè)定其中和抗體效價(jià)可達(dá)214，此效價(jià)的IgG可有效中和犬瘟熱病毒，達(dá)到預(yù)期的治療效果，對(duì)犬進(jìn)行了免疫治療，結(jié)果也比較理想。鑒于異源蛋白仍存在導(dǎo)致不良反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)，后續(xù)研究中將進(jìn)一步進(jìn)行IgG抗體Fc片段的切除，并進(jìn)行高度純化，以期獲得高質(zhì)量的馬源抗犬瘟熱病毒免疫球蛋白。

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PREPARATION OF HORSE IMMUNOGLOBULINS AGAINST CANINE DISTEMPER VIRUS

YAN Yan1,2, ZHANG Jin-xia2, WANG Dong-fang1,2, Zheng Guang-lai2, ZHANG Shou-feng2, HU Rong-liang2

(1. College of Animal Science and Technology, Jilin Agriculture University, Changchun 130118, China; 2.Key Laboratory of Jilin Province for ZoonosisPrevention and Control, Military Veterinary Research Institute, Academy of Military Medical Sciences, Changchun 130122,China)

In the present study, the antiserum containing neutralizing antibodies produced in horses provided a feasible treatment for canine distemper. Production of Canine distemper viruses (CDVs) were conducted by inoculating and passaging the commercial CDV vaccine onto Vero cells until the virus titers reached to TCID50of 10-4.625/mL. Four weeks after immunization of horses with CDVs, antiserum samples were obtained and afterwards harvested every two weeks. The immunoglobulins (IgGs) were purifi ed by ammonium sulfate precipitation. The pure IgGs were titrated to be 1:214as measured for virus neutralizing activity. Five Beagle dogs were injected with the IgG preparation and no side-effects were observed, indicating its safety for canines.

Canine distemper virus; purifi cation; immunoglobulin; horse

S852.659.5

A

1674-6422（2016）03-0012-04

2016-01-20

新型動(dòng)物疫病診斷技術(shù)應(yīng)用研究（201203056）

嚴(yán)妍，女，碩士研究生，預(yù)防獸醫(yī)學(xué)專業(yè)

扈榮良，E-mail：ronglianghu@hotmail.com