崔宏銳，滕巧泱，石　迎，陳鴻軍，李雪松，劉芹防，李澤君

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

利用反向遺傳技術(shù)構(gòu)建表達(dá)綠色熒光蛋白的H9N2禽流感重組病毒

崔宏銳，滕巧泱，石迎，陳鴻軍，李雪松，劉芹防，李澤君

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

H9N2 亞型禽流感病毒普遍存在于我國大部分地區(qū)，宿主范圍較廣，是世界衛(wèi)生組織發(fā)布的最具大流行潛力的病毒之一。為了利用H9N2亞型禽流感病毒表達(dá)綠色熒光蛋白（green fl uorescent protein，GFP），通過反向遺傳操作技術(shù)將A/Chicken/ Shanghai/2093/2009（H9N2）（SH2093）毒株的NS2基因連接到PB1基因下游，同時將GFP基因連接在NS1基因之后，拯救并獲得了 1 株表達(dá)GFP的重組病毒SH2093-GFP。雖然SH2093-GFP 在MDCK細(xì)胞上的增殖能力低于野生毒株 SH2093，但該病毒可以成功表達(dá)GFP，為進(jìn)一步研究H9N2亞型禽流感病毒作為外源基因表達(dá)載體等提供重要依據(jù)。

禽流感病毒；H9N2 亞型；反向遺傳操作；基因重組病毒

自1994年我國首次報道從雞群分離到H9N2亞型禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）以來，該亞型流感病毒開始廣泛存在于遼寧省、安徽省、山東省、廣東省、福建省、江蘇省、河南省、湖南省、上海市、廣西壯族自治區(qū)、云南省、四川省等全國大部分地區(qū)[1-3]，成為危害我國養(yǎng)殖業(yè)的最主要的低致病性禽流感病毒[4]。目前，H9N2亞型禽流感病毒感染禽類后還沒有出現(xiàn)大批死亡的現(xiàn)象，但可導(dǎo)致禽類產(chǎn)蛋量下降，出現(xiàn)免疫抑制病，并可與其他病原體共同感染從而導(dǎo)致高死亡率。同時H9N2亞型AIV傳播能力特別強(qiáng)，存在范圍極其廣泛，該病毒還可感染豬[2]和人[5,6]。有研究表明，2013～2014年間多次爆發(fā)于我國內(nèi)地多個省市，造成人感染和死亡的H7N9亞型AIV中，有6個內(nèi)部基因源于H9N2亞型AIV[7,8]。不僅如此，H9N2亞型AIV與其他亞型流感病毒共感染時很容易發(fā)生基因重組，產(chǎn)生能夠引起人畜共感染的新型病毒亞型[9]，如1997年爆發(fā)的H5N1亞型流感病毒[10]和近些年頻發(fā)的H7N9[11]和H10N8亞型流感病毒[12]。因此，H9N2亞型禽AIV已對我國養(yǎng)禽業(yè)和人類健康造成潛在威脅，也是亟待于研究的病毒之一。

新型病毒載體已經(jīng)廣泛應(yīng)用于跟蹤報告基因和生物活性分子，在基因治療和感染性疾病領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。由于分節(jié)段負(fù)鏈RNA病毒反向遺傳技術(shù)的發(fā)展，A型流感病毒（AIV）也被視為潛在的疫苗和治療載體[13,14]。Pena 等[15]成功構(gòu)建出用于表達(dá)多種外源基因（eGFP、GLuc、HA等）重組H9N2亞型AIV，并將該方法應(yīng)用于研究新型流感疫苗。不僅如此，在A型流感病毒基因組中插入并成功表達(dá)外源基因的方法還可以進(jìn)一步應(yīng)用于流感病毒聚合酶表達(dá)效率、病毒基礎(chǔ)變異速率等方面研究。

本研究以實(shí)驗(yàn)室保存的A/chicken/S h a n g h a i/ 2093/2009(H9N2）（SH2093）毒株為親本，構(gòu)建并拯救能夠表達(dá)GFP的禽流感重組病毒，為進(jìn)一步研究H9N2亞型禽流感病的變異速率等提供材料。

1　材料和方法

1.1主要材料RNA提取試劑盒、去內(nèi)毒素小量抽提質(zhì)粒試劑盒購自QIAGEN公司；M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、Ribonuclease inhibitor、10 mmol/L dNTP mix、DH5α感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金公司；BspQΙ限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶購自New England Biolab公司；膠回收試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒購自 Axygen 公司；PCR mix 購自東盛生物公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）購自Gibco公司；Opti-MEM 購自Life technology公司；TransIT?-293 Transfection Reagent 購自Mirus Bio LLC公司；TPCK胰酶購自Sigma公司。

1.2病毒和細(xì)胞A/Chicken/Shanghai/2093/2009（H9N2）（簡稱為SH2093）病毒株、病毒SH2093/ H9N2反向遺傳操作系統(tǒng)（包括pBD-PB2、pBDPB1、pBD-PA、pBD-HA、pBD-NP、pBD-NA、pBD-M、pBD-NS）、pBD載體、pBD-GFP質(zhì)粒、293T細(xì)胞和MDCK細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3分子生物學(xué)分析軟件LaserGene 7 版本軟件包：EditSeq、MegAlign、SeqMan 、PrimerSelect等軟件。

1.4引物設(shè)計參照實(shí)驗(yàn)室前期工作測得的SH2093毒株、GFP的基因序列，使用Primer premier 5.0軟件設(shè)計各片段擴(kuò)增所需的引物，待融合的相鄰基因片段在相應(yīng)的引物上設(shè)計有至少15～25 nt的核苷酸重疊區(qū)域，如表1。其中，PB1基因和NS基因的首尾引物均添加Sap I 酶切位點(diǎn)，便于將基因連接到具有相同酶切位點(diǎn)的pBD 載體上。根據(jù)截短后的口蹄疫病毒（Foot and mouth disease virus，F(xiàn)MDV）的順式作用水解酶元件（CHYSEL）核苷酸序列（后文簡稱FMDV-2A）信息（5′-CTTCTGAACTTCGACCTCC TCAAGTTGGCGGGTGACGTTGAGTCCAACCCCG GGCCC- 3′），將此2A片段拆分加入到PB1、NS1片段的下游引物和GFP、NS2片段的上游引物中。

1.5重組質(zhì)粒pBD-PB1-NS2和 pBD-NS1-GFP的構(gòu)建參考文獻(xiàn)[15]介紹的構(gòu)建方案，以本實(shí)驗(yàn)室分離保存的SH2093病毒（A/Chicken/Shanghai/2093/2009（H9N2））為親本， 將NS基因上表達(dá)NS2（NS2）蛋白的ORF區(qū)域用手足口病病毒（FMDV）2A 順式作用水解酶元件（CHYSEL）（以下簡稱2A）連接在PB1基因的ORF后；將GFP熒光蛋白的核苷酸序列通過2A蛋白編碼序列連接在NS1基因的ORF之后，并且分別保留兩個基因節(jié)段的包裝信號（圖1）。將改造后的PB1-NS2基因節(jié)段和NS1-GFP基因節(jié)段分別插入到pBD雙向表達(dá)質(zhì)粒載體上，利用這兩種質(zhì)粒與其他6個轉(zhuǎn)錄流感病毒RNA的pBD質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，拯救表達(dá)GFP的H9N2重組病毒。以已有的SH2093病毒反向遺傳系統(tǒng)中的pBD-PB1質(zhì)粒為模板，分別以引物對SapI-PB1-1F、PB1-2A-R和引物對PB1-2743F、Sap I-PB1-2284R擴(kuò)增出PB1的ORF片段和PB1基因的3′端包裝信號PB1-3′Packing signal；同理擴(kuò)增出NS1片段和NS基因3′ 端包裝信號NS1-3′Packing signal。使用引物對Sap I-PB1-1F、NS2-R將片段PB1和NS2進(jìn)行融合PCR擴(kuò)增出PB1-2A-NS2片段，然后以此片段和PB1-3′Packing signal包裝信號進(jìn)行融合，得到完整的帶有PB1基因包裝信號和Sap I酶切位點(diǎn)的PB1-NS2全長片段。同樣，擴(kuò)增出NS1-GFP全長片段。擴(kuò)增出的全長片段用1%瓊脂糖電泳鑒定。PCR產(chǎn)物經(jīng)割膠純化后，用Sap I的同工酶（BspQ I酶）進(jìn)行酶切切，并連接于具有相同酶切位點(diǎn)的pBD載體中。構(gòu)建的重組質(zhì)粒經(jīng)PCR鑒定并測序。測序正確的質(zhì)粒使用去內(nèi)毒素小量抽提質(zhì)粒試劑盒提取質(zhì)粒，分裝保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

表1　各片段PCR擴(kuò)增引物Table 1　Primers for every fragment

圖1　PB1和NS基因結(jié)構(gòu)示意圖Fig. 1　Recombinant gene of PB1 and NS

1.6轉(zhuǎn)染利用TransIT?-293 Transfection Reagent將構(gòu)建的質(zhì)粒pBD-PB1-NS2和pBD-NS1-GFP，以及SH2093病毒的其余6個基因的重組質(zhì)粒pBD-PB2、pBD-PA、pBD-HA、pBD-NP、pBD-NA和pBD-M共轉(zhuǎn)染生長密度為90%～95%的293T細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后6 h，棄去細(xì)胞上清，加入1 mL新鮮的OPTI-MEM培養(yǎng)液，于37℃、CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。

1.7病毒的拯救轉(zhuǎn)染48 h 后的細(xì)胞上清中加入2 μL TPCK胰酶（0.5 mg/mL），于37℃、CO2培養(yǎng)箱中作用1～2 h后，將細(xì)胞上清接種9～11日齡SPF 雞胚，置于37℃孵化器內(nèi)培養(yǎng)48 h，收獲雞胚尿囊液。通過血凝試驗(yàn)測定尿囊液凝集紅細(xì)胞能力，收集有血凝活性的尿囊液，分裝并凍存于-80℃，命名為重組病毒SH2093-GFP株。

使用RNA提取試劑盒，提取重組病毒SH2093-GFP的總RNA，使用流感通用反轉(zhuǎn)錄引物12 bp將病毒RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA第一鏈，以此cDNA為模板，分別用SapI-PB1-1F、SapI-PB1-2480R和引物對SapI-NS-1F、SapI-NS-890R為上下游引物（見表1）和流感病毒基因通用引物[16]，Pfx DNA Polymerase進(jìn)行PCR，擴(kuò)增重組病毒PB1-NS2、NS1-GFP基因和HA、NA、M基因，并送金唯智生物公司進(jìn)行基因序列的測定。

同時，SH2 093-GFP病毒稀釋1000倍后接種于長至80%的MDCK細(xì)胞六孔板中，使用2 mL含有TPCK胰酶的無血清 DMEM培養(yǎng)基于37℃孵化器內(nèi)培養(yǎng)24 h后觀察細(xì)胞質(zhì)中是否有熒光表達(dá)，以進(jìn)一步確認(rèn)SH2093-GFP病毒能夠穩(wěn)定表達(dá)GFP。

1.8病毒滴度的測定將病毒液按10倍梯度稀釋，將不同稀釋度的SH2093-GFP病毒感染96孔板中密度長至80%的MDCK細(xì)胞，每孔加入100 μL病毒，每個稀釋度做8個重復(fù)，吸附了病毒的細(xì)胞在CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)72 h，觀察細(xì)胞病變和細(xì)胞的熒光情況，利用Reed-Muench法計算TCID50。

1.9SH2093-GFP病毒在MDCK細(xì)胞上生長曲線的繪制將SH2093-GFP病毒和親本病毒SH2093毒株以0.1 MOI分別感染六孔板中長至80%的MDCK細(xì)胞，吸附1 h后，換入含有TPCK-Trypsin的無血清 DMEM培養(yǎng)液，接毒12、24、36、48、60、72 h后，分別收集其細(xì)胞上清200 μL并補(bǔ)液200 μL，測定血凝效價，每份樣品重復(fù)3次，比較SH2093-GFP病毒和親本病毒SH2093毒株在MDCK細(xì)胞上的生長情況。

2　結(jié)果

2.1重組質(zhì)粒pBD-PB1-NS2和 pBD-NS1-GFP的鑒定分別用引物對SapI-PB1-1F、SapI-PB1-2480R和引物對SapI-NS-1F、SapI-NS-890R，PCR 方法擴(kuò)增PB1-NS2和NS1-GFP全片段，1%瓊脂糖電泳檢測。分別擴(kuò)增出大小為2783 bp（圖2A）和1630 bp（圖2B）的特異目的條帶，與預(yù)期條帶大小一致。此外，以pBD-up、pBD-down為上下游引物，再分別以PB1-2A-R、NS2-2A-F和2A-GFP-F為中間引物進(jìn)行測序，測序結(jié)果表明序列與預(yù)期結(jié)果一致。

2.2重組病毒SH2093-GFP病毒的鑒定經(jīng)血凝實(shí)驗(yàn)測定，拯救重組病毒SH2093-GFP的血凝效價為28。收獲尿囊液，分裝并保存于-80℃冰箱備用。此外，取尿囊液提取病毒總RNA，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增PB1-NS2、NS1-GFP基因。拯救HA、NA和M基因，并回收PCR產(chǎn)物測序。測序結(jié)果顯示，拯救病毒SH2093-GFP株的PB1-NS2、NS1-GFP、HA、NA和M序列與親本病毒SH2093序列完全一致。

SH2093-GFP病毒株稀釋后接種MDCK細(xì)胞，于37℃孵化器內(nèi)培養(yǎng)24 h后使用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)全部細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中充滿綠色熒光，部分細(xì)胞已經(jīng)發(fā)生形態(tài)改變，少數(shù)細(xì)胞皺縮變圓發(fā)生脫落（圖3）。

圖2　重組質(zhì)粒pBD-PB1-NS2和 pBD-NS1-GFP的PCR鑒定Fig. 2　Identifi cation of recombinant plasmids pBD-PB1-NS2 and pBD-NS1-GFP by PCR

圖3　SH2093-GFP病毒株感染MDCK細(xì)胞后的細(xì)胞病變Fig. 3　Cytopathic effect in MDCK cells infected with H9N2-SH2093-GFP

2.3SH2093-GFP病毒株滴度顯微鏡下觀察96孔板中感染病毒72 h后MDCK細(xì)胞的病變和熒光情況。觀察到有1個細(xì)胞質(zhì)中有明顯熒光的MDCK細(xì)胞，即認(rèn)定該細(xì)胞孔為陽性，沒有明顯熒光的細(xì)胞孔為陰性。如此計數(shù)每個稀釋度的8個重復(fù)中的陽性個數(shù)，使用Reed-Muench法計算獲得SH2093-GFP病毒株滴度為1×105.5TCID50/100 μL。

2.4SH2093-GFP病毒株在MDCK細(xì)胞上的生長曲線按0.1MOI感染量分別感染重組病毒SH2093-GFP和親本病毒 SH2093毒株。SH2093-GFP株病毒感染后12 h血凝價沒有明顯升高，48 h達(dá)到生長曲線頂峰，血凝效價達(dá)到24，此后迅速下降，72 h時血凝效價基本回落到12 h 時的水平。而親本病毒SH2093毒株在感染后24 h效價便達(dá)到24，在48 h最高峰時的效價達(dá)到27，此后72 h雖有所下降但基本維持在這個水平（圖4）。

SH2093-GFP病毒株血凝效價上升趨勢與親本病毒SH2093毒株趨于一致，48 h達(dá)到峰值24后便開始下降，但總體血凝效價較低。

圖4　SH2093-GFP株和親本SH2093病毒株感染 MDCK細(xì)胞后不同時間的血凝效價Fig. 4　Hemagglutination titer of the supernatant of MDCK cells infected with recombinant infl uenza virus (SH2093-GFP) and wild-type SH2093 infl uenza virus at different hours post-infection

3　討論

本研究中，我們參考了Troy Sutto[15]介紹的構(gòu)建方案，以本實(shí)驗(yàn)室分離保存的SH2093病毒（A/ Chicken/Shanghai/2093/2009（H9N2））為背景，將NS基因上表達(dá)NS2（NS2）蛋白的ORF區(qū)域用FMDV-2A連接在PB1基因的ORF后；將GFP熒光蛋白的核苷酸序列通過FMDV-2A蛋白編碼序列連接在N S1基因的ORF之后，并且分別保留兩個基因節(jié)段的包裝信號，以保證插入外源基因后的重組基因序列的順利包裝表達(dá)[17]。反向遺傳操作技術(shù)在國內(nèi)的發(fā)展已經(jīng)相當(dāng)成熟，為從分子水平研究流感病毒致病性、種間傳播能力、病毒變異機(jī)制提供了良好的平臺和基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)成功建立了H9N2亞型禽流感病毒SH441毒株的反向遺傳系統(tǒng)[18]，為本研究的順利進(jìn)行提供參考和依據(jù)。

本研究結(jié)果表明，拯救得到的SH2093-GFP株能夠順利表達(dá)GFP，但是在MDCK細(xì)胞上的復(fù)制能力不及親本病毒SH2093株。這是由于H9N2亞型禽流感病毒自身的致病性和復(fù)制能力不高，再加上對病毒復(fù)制能力和致病性有影響的PB1基因和NS基因進(jìn)行了基因截斷和插入的生物學(xué)操作，可能會對病毒的復(fù)制能力產(chǎn)生影響。Sutto等[15]對NS1蛋白C端進(jìn)行截短，保留NS1肽鏈的1～99個氨基酸。本研究為了盡量減少對SH2093親本毒株基因上的改變，保留了NS1蛋白的完整性，沒有對其進(jìn)行截短。Li等[19]以A/ PR/8/34 （PR8）為親本比較了外源基因（eGFP）插入到NS基因5′端和3′端的差異，結(jié)果表明，將外源基因插入到3′端時蛋白的表達(dá)比較分散，會在細(xì)胞核和細(xì)胞膜上同時表達(dá)，與本研究觀察到的結(jié)果一致。本研究中拯救獲得的重組病毒可以在后續(xù)的體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)中使用，且這種基因重組構(gòu)建方法可以嘗試應(yīng)用于其他亞型流感病毒。由于不同亞型流感病毒的致病性差異較大，且相關(guān)基因重組的操作會不同程度影響重組病毒的致病性。因此，此方法應(yīng)用于其他研究前需要對病毒的致病性等特性進(jìn)行確認(rèn)。

總之，本研究以SH2093毒株為親本，參考相關(guān)文獻(xiàn)報道，成功插入并表達(dá)外源基因GFP，得到的SH2093-GFP病毒株的滴度達(dá)到1×105.5TCID50/100 μL，可以進(jìn)一步應(yīng)用于體內(nèi)和體外試驗(yàn)。病毒株為實(shí)驗(yàn)室后期進(jìn)一步研究禽流感病毒變異、其他外源基因的表達(dá)和病毒載體在治療和免疫方面的應(yīng)用提供了平臺和基礎(chǔ)。

[1] Li S, Zhou Y, Song W, et al. Avian influenza virus H9N2 seroprevalence and risk factors for infection in occupational poultry-exposed workers in Tai′an of China [J]. J Med Virol, 2016, 88 (8): 1453-1456.

[2] Wang J, Wu M, Hong W, et al. Infectivity and transmissibility of Avian H9N2 influenza viruses in pigs[J]. J Virol, 2016, 90 (7): 3506-3514.

[3] Chen J, Ma J, White S K, et al. Live poultry market workers are susceptible to both avian and swine influenza viruses, Guangdong Province, China[J]. Vet Microbiol, 2015, 181 (3-4) : 230-235.

[4] Ge F, Li X, Ju H, et al. Genotypic evolution and antigenicity of H9N2 influenza viruses in Shanghai, China [J]. Arch Virol, 2016, 161(6): 1437-1445.

[5] Huang Y, Li X, Zhang H, et al. Human infection with an avian influenza A (H9N2) virus in the middle region of Chi na [J]. J Med Virol, 2015, 87 (10): 1641-1648.

[6] Yu H, Zhou Y J, Li G X, et al. Genetic diversity of H9N2 influenza viruses from pigs in China: a potential threat to human health?[J]. Vet Mi crobiol, 2011, 149 (1-2): 254-261.

[7] 中科院研究稱 新型H7N9病毒或?yàn)椤爸许n混血”[J] . 稀土信息, 2013, (5): 39.

[8] 董曉毅, 孫長貴. H7N9禽流感病毒感染及其實(shí)驗(yàn)室診斷[J]. 實(shí)驗(yàn)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué), 2013:105-107+114.

[9] Ediri H, ThieleS, Schwalm F, et al. PB2 subunit of avian influenza virus subtype H9N2: a pandemic risk factor [J]. J Gen Virol, 2016, 97 (1) : 39-48.

[10] Influenza A virus subtype H5N1 infection in humans [J]. C ommun Dis Rep CDR Wkly, 1997, 7 (50): 441.

[11] Zhu H, Lam T T, Smith D K, et al.Emergence and development of H7N9 influenza virus es in China [J]. Curr Opin Virol, 2016,16:106-113.

[12] Xiao C, Ma W, Sun N, et al. PB2-588 V promotes the mammalian adaptation of H10N8, H7N9 and H9N2 avian influenza viruses [J]. Sci Rep, 2016, 6:19 474.

[13] Hoffmann E, Neumann G, Kawaoka Y, et al. A DNA transfection system for generation of influenza A virus from eight plasmids [J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2000, 97(11) : 6108-6113.

[14] 卞成蓉. 流感病毒為載體的重組FLU-RSV疫苗株構(gòu)建及免疫保護(hù)效果研究[D]. 銀川: 寧夏醫(yī)科大 學(xué), 2013.

[15] Pena L, Sutton T, Chockalingam A, et al. Influenza viruses with rearrangedgenomes as live-attenuated vaccines [J]. J Virol, 2013, 87 (9) : 5118-5127.

[16] Inoue E, Wang X, Osawa Y, et al. Full genomic amplification and subtypingof influenza A virus using a single set of universal primers [J]. Microbiol Immunol, 2010, 54 (3): 129-1 34.

[17] 任超超. 流感病毒包裝并表達(dá)的外源基因特性研究[D].北京: 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院, 2014.

[18] 任超超, 滕巧泱, 申偉霞, 等. 利用反向遺傳技術(shù)構(gòu)建細(xì)胞高適應(yīng)性的H9N2流感病毒 [J]. 中國動物傳染病學(xué)報, 2014, 122 (2) :7-12.

[19] Li F, FengL, Pan W, et al. Generation of replicationcompetent recombinant influenza A viruses carrying a reporter gene harbored in the neuraminidase segme nt [J]. J Virol, 2010, 84 (22) : 12075-12081.

GENERATION OF A RECOMBINANT H9N2 INFLUENZA VIRUS EXPRESSING GFP BY REVERSE GENETIC MANIPULATION

CUI Hong-rui, TENG Qiao-yang, SHI Ying, CHEN Hong-jun, LI Xue-song, LIU Qin-fang, LI Ze-jun
(Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China)

The H9N2 Avian infl uenza virus (AIV) circulating in most parts of China with a wide host range, has been on the list of World Health Organization for the greatest pandemic potential. To obtain a H9N2 AIV expressing enhanced green-fl uorescent protein (GFP), reverse genetics system was used to manipulate the AIV strain A/Chicken/Shanghai/2093/2009 (H9N2) (SH2093) in order to develop the recombinant virus (SH2093-GFP). Rearrangement of the infl uenza genome was accomplished by inserting the NS2 gene downstream of the PB1 gene to express NEP protein and GFP gene downstream of a full-length NS1 gene. The recombinant virus SH2093-GFP expressed GFP on MDCK cells successfully though its replication was not effi cient as compared with its parental virus SH2093, suggesting that the H9N2 AIV might be a promising vector candidate for expression of other exogenic proteins.

Avian infl uenza virus; H9N2 subtype; reverse genetics; recombinant virus

S852.659.5

A

1674-6422（2016）03-0006-06

2015-12-18

國家自然基金（31472206）

崔宏銳，女，碩士研究生，預(yù)防獸醫(yī)學(xué)專業(yè)

李澤君，E-mail：lizejun@shvri.ac.cn