李丹丹，劉　柱，丁明洋，李傳峰，陳宗艷，張淼濤，劉光清

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，楊凌 712100；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241；3.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，蘭州 530005）

犬瘟熱病毒N基因原核表達(dá)及多克隆抗體的制備

李丹丹1,2，劉柱1,2，丁明洋3，李傳峰2，陳宗艷2，張淼濤1，劉光清2

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，楊凌 712100；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241；3.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，蘭州 530005）

采用PCR方法擴(kuò)增犬瘟熱病毒N基因，將其克隆至原核表達(dá)載體pET-32a（+）中，構(gòu)建犬瘟熱N基因原核表達(dá)重組質(zhì)粒，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）菌株，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)重組N蛋白。從包涵體中純化重組蛋白，制備多克隆抗體，采用Western blot檢測其特異性。結(jié)果顯示PCR擴(kuò)增得到犬瘟熱N基因，重組N蛋白在大腸桿菌BL21（DE3）菌株中得到表達(dá)，制備的多克隆抗體能與N蛋白特異性反應(yīng)。

犬瘟熱病毒；N蛋白；原核表達(dá)；多克隆抗體

犬瘟熱病毒（Canine distemper virus，CDV）屬于副粘病毒科（Paramyxoviridae）、麻疹病毒屬（Morbillivirus），為單股不分節(jié)段的負(fù)鏈RNA病毒[1]。CDV基因組由15 690個(gè)核苷酸組成，編碼6個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白：核衣殼蛋白（N）、磷蛋白（P）、聚合酶蛋白（L）、基質(zhì)蛋白（M）、融合蛋白（F）及血球凝集素蛋白（H）[2]。CDV N蛋白基因由1572個(gè)核苷酸組成，編碼523個(gè)氨基酸，N 蛋白是病毒核衣殼的主要成分，有包裹及保護(hù)內(nèi)部基因的功能，且是保守性較強(qiáng)的免疫源性蛋白，當(dāng)病毒感染時(shí)可引起強(qiáng)烈抗體反應(yīng)[3]。

犬瘟熱病毒能引起犬、狐、貂等動(dòng)物的犬瘟熱疾病，近年也有犬瘟病毒熱感染大熊貓的病例。犬瘟熱是一種急性、高度接觸性傳染病，嚴(yán)重危害當(dāng)前養(yǎng)犬業(yè)和皮毛動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。雖然疫苗的應(yīng)用緩解了犬瘟熱的發(fā)展，但是近年來不斷有報(bào)道顯示，已接種疫苗的犬仍可感染CDV，犬瘟熱的宿主范圍也在不斷擴(kuò)大，推測其與新型CDV毒株出現(xiàn)有關(guān)[4]。本研究構(gòu)建 CDV N基因的重組表達(dá)質(zhì)粒 pETCDV-N，在大腸桿菌中表達(dá)后，對重組表達(dá)蛋白進(jìn)行純化，并制備多克隆抗體，以期為 CDV 免疫學(xué)檢測及進(jìn)一步研究 CDV N 蛋白的功能奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1菌株與質(zhì)粒Trans5α和BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；pET-32a（+）載體購自Novagen公司。

1.2主要試劑PFU高保真酶購自Tiangen公司；T4 DNA連接酶購自Promega公司；EcoR I和Hind III限制性內(nèi)切酶購自TaKaRa公司（大連）；二氨基聯(lián)苯胺顯色液購自武漢博士德公司；抗His標(biāo)簽鼠單克隆抗體及FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗購自北京康為世紀(jì)公司；HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗購自中杉金橋公司（北京）；瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自BioTake公司。

1.3CDV N基因的擴(kuò)增根據(jù)GenBank中犬瘟熱的全基因組序列（登錄號(hào)：KM434239）設(shè)計(jì)擴(kuò)增N基因的引物，上游引物（F）：5′-CCGGAATTCCGGAT GGCTAGCCTTCTCAAGAGCCT - 3′（下劃線核苷酸為EcoR I識(shí)別位點(diǎn)）；下游引物（R）：5′-TTAA TTGAGTAGCTCCCTATCATTATAGACAGGCCCA AGCTTGGG-3’（下劃線核苷酸為Hind III識(shí)別位點(diǎn)），預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物長度為1572 bp。引物由上海生工生物工程公司合成。提取RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以獲得的cDNA為模板，用2×pfu DNA聚合酶擴(kuò)增N基因。PCR反應(yīng)體系：模板cDNA 2μL，pfu Mix 25 μL，上、下游引物（10 pmol/μL）各1 μL，加滅菌蒸餾水至50 μL。PCR反應(yīng)條件：95°C預(yù)變性5 min；94℃變性40 s，55℃退火30 s，72℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10 min。同時(shí)設(shè)立陰性對照，不加模板。取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，切膠并用BioTake公司凝膠回收試劑盒回收。

1.4重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定將純化的N基因和pET-32a（+）載體分別用EcoR I和Hind III雙酶切，然后用T4 DNA連接酶連接，再轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans5α感受態(tài)細(xì)胞。用氨芐抗性的平板篩選陽性克隆，提取重組質(zhì)粒，用EcoR I和Hind III 雙酶切進(jìn)行鑒定，送上海美吉生物公司測序，將鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為pET-32a-N。

1.5CDV N基因的誘導(dǎo)表達(dá)將pET-32a-N轉(zhuǎn)化到E.coil BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)氨芐抗性篩選后，挑取單克隆于氨芐抗性的LB培養(yǎng)基中，于37℃培養(yǎng)至OD600為0.8時(shí)，加入IPTG（終濃度為0.6 mmol/L）誘導(dǎo)，分別于不同時(shí)間點(diǎn)收集菌液1 mL，4℃、離心5 min，收集菌體沉淀，取合適菌量與5倍濃度上樣緩沖液混勻，100℃煮沸10 min，進(jìn)行SDSPAGE電泳分析[5]。

1.6CDV N融合蛋白的純化與定量小量收集鑒定菌液培養(yǎng)，稱量菌體濕重，每克菌體加入3 mL細(xì)胞裂解緩沖液Ⅰ，輕輕用玻璃棒使菌體懸起，每克濕重加入4 μL 100 mmol/L PMSF和80 μL 10 mg/mL溶菌酶，37℃攪動(dòng)20 min，超聲破碎直至不粘稠，超聲波工作電壓400 V，工作5 s，間隔5 s，4℃、12 000 ×g離心10 min，分別取上清和菌體沉淀進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，以確定CDV N蛋白的表達(dá)形式。擴(kuò)大培養(yǎng)表達(dá)CDV N蛋白的重組菌，誘導(dǎo)表達(dá)CDV N蛋白。參照分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，從包涵體中純化蛋白，對純化產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE電泳鑒定[6]。

1.7兔抗CDV N蛋白多克隆抗體的制備健康新西蘭大白兔飼養(yǎng)1周后進(jìn)行首次免疫，1 mg純化的重組蛋白與等體積弗氏完全佐劑完全乳化后皮下多點(diǎn)注射。2周后進(jìn)行第2次免疫，免疫劑量為1 mg純化后的重組蛋白，與等體積弗氏不完全佐劑完全乳化后皮下多點(diǎn)注射。此后每隔1周免疫1次，劑量與方法同第2次免疫。4免后d5耳緣靜脈采血，檢測抗體特異性[7]。加強(qiáng)免疫劑量為1 mg純化后的重組蛋白，耳緣靜脈注射。加強(qiáng)免疫后d7，心臟采血，離心制備血清，分裝后于-20℃保存。

1.8Western blot檢測多克隆抗體特異性加強(qiáng)免疫后1周，兔心臟采血，分離血清，于-80℃分裝保存。以CDV N融合蛋白為抗原，Western blot檢測多克隆抗體的特異性，待檢血清按照1:1000倍稀釋作為一抗，以HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG為二抗（1:2000稀釋），二氨基聯(lián)苯胺法顯色[9]。

1.9間接免疫熒光試驗(yàn)（indirect immunofluorescence assay，IFA）將接種CDV 48 h后的BHKSLAM細(xì)胞用4%多聚甲醛固定，4℃過夜封閉，用制備的N蛋白多克隆抗體為一抗（1:200稀釋），室溫孵育2 h后，加入FITC標(biāo)記的羊抗兔二抗（1:10 000稀釋），室溫孵育1 h，熒光顯微鏡下觀察。同時(shí)設(shè)置正常BHK-SLAM細(xì)胞為陰性對照。

2　結(jié)果

2.1目的基因的擴(kuò)增重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定以獲得的犬瘟熱cDNA為模板，成功擴(kuò)增出N基因，其長度為1572 bp（圖1A）。采用酶切、連接方法，將其插入到pET-32a（+）載體中，得到了pET-32a-N。進(jìn)一步酶切鑒定出現(xiàn)2條特異性條帶，分別為1572 bp左右和5900 bp左右（圖1B），表明目的基因已插入相應(yīng)的克隆位點(diǎn)，測序結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)載體構(gòu)建成功。

2.2CDV N蛋白表達(dá)pET-32a-N轉(zhuǎn)化E.coil BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞后，加入IPTG誘導(dǎo)，并取不同時(shí)間點(diǎn)的重組菌液對比表達(dá)情況。結(jié)果表明誘導(dǎo)4～6 h可使N融合蛋白得到最大表達(dá)，CDV N蛋白為57 kDa，His標(biāo)簽蛋白為18 kDa，獲得的重組蛋白大小在76 kDa（圖2A），與預(yù)期結(jié)果一致。CDV N蛋白優(yōu)化結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IPTG誘導(dǎo)6 h后，蛋白表達(dá)量達(dá)到最大[9]。

2.4表達(dá)產(chǎn)物的純化與定量按照上述方法對重組蛋白進(jìn)行純化，純化后得到1條76 kDa的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符（圖2B）。用碧云天公司蛋白定量試劑盒定量分析得到pET-32a-N融合蛋白濃度為1.2 mg/mL。

圖1　CDV N基因擴(kuò)增結(jié)果(A)及重組質(zhì)粒pET-32a-N雙酶切鑒定(B)Fig. 1　Amplifi cation of CDV N gene(A) and analysis of pET-32a-N by restriction enzyme digestion(B)

圖2　重組N蛋白的SDS-PAGE分析及純化Fig. 2　SDS-PAGE analysis and purifi cation of recombinant N protein

2.5重組蛋白pET-32a-N多抗的鑒定將純化后的N蛋白分4次免疫實(shí)驗(yàn)兔，得到抗N蛋白的高免血清，即多克隆抗體。為了檢測抗體的特異性，將純化的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，之后將蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，轉(zhuǎn)印條件均為：15 V、30 min。使用的一抗為本試驗(yàn)制備的抗N基因多克隆抗體（1:1000稀釋），二抗為HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG（1:2000稀釋）。Western blot檢測結(jié)果如圖3所示，在約76 kDa處出現(xiàn)特異性反應(yīng)帶，說明制備的多抗具有反應(yīng)原性。

圖3　重組 N 蛋白Western blot鑒定結(jié)果Fig. 3　Identifi cation of the recombinant N protein by Western blot

2.6間接免疫熒光試驗(yàn)（IFA） BHK-SLAM細(xì)胞接種CDV 48 h后，用IFA檢測抗原的表達(dá)情況。使用的一抗（1:200稀釋）為本試驗(yàn)制備的抗N基因多克隆抗體，二抗為FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG（1:10 000稀釋）。結(jié)果顯示，在熒光顯微鏡下可觀察出現(xiàn)特異性熒光（圖4A），陰性對照組無熒光（圖4B），說明所制備的多克隆抗體具有較好的特異性。

圖4　CDV感染BHK-SLAM細(xì)胞的間接免疫熒光檢測Fig. 4　IFA results of BHK-SLAM cells infected with CDV

3　討論

N蛋白是 CDV中含量最高的結(jié)構(gòu)蛋白，對病毒的轉(zhuǎn)錄、復(fù)制、裝配及持續(xù)感染都具有重要意義[10]。在CDV N蛋白281～289位連續(xù)9個(gè)氨基酸高度保守，是T細(xì)胞表位，在細(xì)胞免疫中發(fā)揮重要的功能[11]。CDV N蛋白可以刺激機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的抗體反應(yīng)，尤其在感染早期免疫應(yīng)答中起主導(dǎo)作用，發(fā)揮體液免疫功能。當(dāng)H和F蛋白的特異性抗體不能檢出時(shí)，仍可檢測到N蛋白的特異性抗體[11]。所以CDV N蛋白基因無論是做為診斷抗原還是基因工程疫苗都具有很高的價(jià)值。

鑒于 CDV N 蛋白良好的抗原性，本研究選取CDV N 蛋白構(gòu)建重組質(zhì)粒 pET-32-N，在大腸桿菌中表達(dá)重組蛋白 N，該蛋白以包涵體形式表達(dá)，降低了胞內(nèi)外源蛋白濃度，提高了重組蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)量[12]。通過純化得到高純度重組蛋白，Western blot 鑒定結(jié)果表明，表達(dá)的 CDV N重組蛋白具有良好反應(yīng)原性，可作為間接 ELISA診斷抗原，為建立ELISA 抗體診斷試劑盒奠定了基礎(chǔ)[13]。

雖然多克隆抗體特異性和穩(wěn)定性不如單克隆抗體，但其可識(shí)別同一抗原的多個(gè)表位，與抗原具有較高的親和性，故在免疫檢測中可提高檢測的靈敏度[14]。同時(shí)多克隆抗體具有制備簡單、成本低、耗時(shí)短等優(yōu)點(diǎn)，在免疫學(xué)研究中得到了廣泛應(yīng)用。本研究表達(dá)的重組蛋白抗兔 N 蛋白抗體可特異性識(shí)別感染細(xì)胞中的 CDV N蛋白，說明其具有良好的反應(yīng)原性，可用于病毒抗原檢測，制備的多克隆抗體同時(shí)也為進(jìn)一步進(jìn)行 N 蛋白功能分析研究奠定了基礎(chǔ)。

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PROKARYOTIC EXPRESSION OF N GENE OF CANINE DISTEMPER VIRUS AND PREPARATION OF POLYCLONAL ANTIBODIES

LI Dan-dan1,2, LIU Zhu1,2, DING Ming-yang3, LI Chuan-feng2, CHEN Zong-yan2, ZHANG Miao-tao1, LIU Guang-qing2

(1. Department of Animal Medicine of Northwest A&F University, Yanling 712100, China; 2. Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China ; 3. Gansu Agriculture University, Lanzhou 730070, China)

To study the function of N protein of Canine distemper virns (CDV), the CDV-N gene was amplifi ed in PCR and cloned into expression vector pET-32a(+). Subsequently, the recombinant plasmid pET-32a-N was transformed into E.coli BL21(DE3) cells prior to induction with IPTG. The CDV-N protein was purifi ed from the inclusion bodies. The PCR product of the CDV N gene was 1572 bp in length. The recombinant N protein was used to immunize rabbits to produce polyclonal antibodies. The rabbit antiserum was sampled and its specifi city for N protein was confi rmed in Western blot.

Canine distemper virns (CDV); N protein; prokaryotic expression; polyclonal antibody

S852.659.5

A

1674-6422（2016）03-0001-05

2016-02-02

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31270194、31502068）；上海市科技興農(nóng)重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目（2016043）；上海市科委創(chuàng)新項(xiàng)目(13391901602)；公益性農(nóng)業(yè)科研專項(xiàng)（201303046）；中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)（2016JB01、31101848)

李丹丹，女，碩士研究生，基礎(chǔ)獸醫(yī)學(xué)專業(yè)

劉光清，E-mail：liugq@shvri.ac.cn；張淼濤，E-mail：504888520@qq.com