周春暉，周丹丹，劉婷婷，馬炳南

（廣東太陽神集團有限公司，廣東 廣州510665）

高效凝膠色譜法測定猴頭菇多糖分子量及含量

周春暉，周丹丹，劉婷婷，馬炳南

（廣東太陽神集團有限公司，廣東 廣州510665）

利用高效凝膠過濾色譜法（GFC），示差折光檢測猴頭菇子實體和猴頭菇口服液中的猴頭菇多糖的分子量和含量。通過建立不同分子量的葡聚糖標準品校正曲線，測定了猴頭菇多糖的分子量和分子量分布；以保留時間與猴頭菇多糖最接近的葡聚糖作為標準品，利用峰面積外標法定量測定猴頭菇多糖的含量。結(jié)果表明，猴頭菇子實體和猴頭菇口服液多糖數(shù)均分子量Mn均為1.6×104Da，重均分子量Mw均為1.7×104Da，分布寬D值在1.05～1.07范圍，重復(fù)良好。猴頭菇子實體多糖含量為0.66%，猴頭菇口服液多糖含量為37.1mg/100mL，方法學(xué)驗證基本符合要求。

猴頭菇多糖；凝膠過濾色譜法（GFC）；分子量；含量

猴頭菇（Hericium erinaceus）是一藥膳兩用菌，性平、味甘。研究證明，其提取物對多種消化系統(tǒng)疾病如慢性胃炎、消化不良和胃潰瘍都具有較好的療效，同時猴頭菌還具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗衰老、降血糖和保護神經(jīng)等活性［1-7］。目前已廣泛應(yīng)用于藥品、保健食品及食品等領(lǐng)域，隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的發(fā)展和臨床試驗的反復(fù)證明，猴頭菇的功效價值不斷地被挖掘出新的內(nèi)涵，在產(chǎn)品劑型上，在傳統(tǒng)的丸、片、湯劑基礎(chǔ)上開發(fā)出了口服液、浸膏、酒、粉劑、乳品、蛋糕、蜜餞、飲料、餅干等多種產(chǎn)品。其中猴頭菇口服液對胃黏膜損傷的保護功能尤為突出［8-9］。

一般認為，猴頭菇的主要活性成分是多糖。除多糖外，猴頭菌還含有低聚糖甾醇類猴頭菌素和猴頭菌酮等生物活性物質(zhì)［10］，其中研究最多的、最引起人們注意的是猴頭菇多糖類物質(zhì)。猴頭菇中糖類物質(zhì)主要以多糖、糖蛋白、糖苷的形式存在［11］。關(guān)于猴頭菇多糖的組成，多數(shù)認為是由葡萄糖、半乳糖、甘露糖組成，以葡萄糖為主，是由β（1→3）鍵連接的主鏈和β（l→6）鍵連接的支鏈構(gòu)成的葡聚糖［12-13］。多糖的活性，特別是抗腫瘤作用與其聚合度、分子量有關(guān)［14］，故掌握其多糖分子量和含量對猴頭菇運用具有較強的科學(xué)依據(jù)。

真菌多糖的應(yīng)用價值已受到人們的關(guān)注，但其各方面的研究缺乏系統(tǒng)性，對活性起決定作用的結(jié)構(gòu)和機理的研究不夠深入，另外在哪種提取和分析方法是否靈敏適用方面缺乏相應(yīng)的參考［15］。傳統(tǒng)的多糖含量可用硫酸-酚法測定，蛋白含量用Lowry法測定，分子量的測定常采用超濾、沉降法等測定［16］，其操作方法比較繁瑣。高效凝膠過濾色譜法（GFC）因其快速、簡便、準確，近年廣泛應(yīng)用于實驗室中多糖的分子量和含量測定［17-18］。目前，香菇多糖、太子參多糖、白芨多糖、多花黃精多糖和甘草多糖等分子量及含量測定已有此類方法驗證報道［19-23］。文獻表明［24-25］，猴頭菇多糖分子量及含量也可采用凝膠過濾色譜法進行檢測，但暫無方法驗證的系統(tǒng)報道。故本研究參考魏遠安［26］、陳軼蘭［27］、Eliza Malinowska［25］等用高效凝膠滲透色譜法測定多糖純度及分子量方法條件，對猴頭菇多糖分子量及含量進行方法系統(tǒng)研究探討。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

猴頭菇子實體：購于福建省古田縣吉發(fā)食用菌有限公司；猴頭菇口服液：廣東太陽神集團有限公司。

葡聚糖標準品（1 g/支97%）：Flukar公司；無水乙醇、硫酸銅（五水）、檸檬酸鈉：廣州番禺力強化工廠；三氯乙酸、苯酚、氫氧化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉：天津市大茂化學(xué)試劑廠；無水硫酸鈉：廣州化學(xué)試劑廠；濃硫酸：衡陽市凱信化工試劑有限公司；疊氮化鈉（含量大于99%）：成都化夏化學(xué)試劑有限公司。

銅貯存液：稱取3.0 g硫酸銅（五水），30.0檸檬酸鈉加水溶解至1 L，此溶液可貯存2周；銅應(yīng)用溶液：取銅貯存液50 mL，加水50 mL混勻后加入無水硫酸鈉12.5 g，臨用現(xiàn)配；銅洗滌液：取水50 mL，加入10 mL銅應(yīng)用溶液，10 mL 2.5 mol/L氫氧化鈉溶液，混勻。除特殊要求外，所有試劑均為分析純。

1.2儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀1260（示差折光檢測器）：Agilent公司；凝膠色譜柱（GPC）：TSK Gel 4000 SWXL；分析天平（感量0.1mg）：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；FW100型粉碎機：天津市泰斯特儀器有限公司；LXJIIB型高速離心機：上海安亭科學(xué)儀器廠；BMC110kz水浴鍋：上海錦屏儀器儀表有限公司；KQ-300E型超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公；20目篩（孔徑0.9 mm）：浙江乙達金屬砂篩廠。

1.3方法

1.3.1供試品溶液制備

猴頭菇子實體多糖樣品：粉碎后，過20目篩，稱取2.00 g，于50℃浸泡2 h，超聲波振蕩提取20 min，抽濾，收集濾液；殘渣再加水30 mL，超聲波振蕩提取20 min，抽濾；合并兩次濾液，于90℃水浴濃縮至10 mL，冷卻至室溫，加30 mL無水乙醇（即乙醇濃度為75%）沉淀多糖；靜置過夜，于4 000 r/min離心5 min，棄去上清液，沉淀即為猴頭菇粗多糖。取其粗多糖，加10 mL水溶解，再加5 mL 33%乙醇沉淀大分子化合物，棄去沉淀；溶液再加5 mL 50%乙醇沉淀多糖。用5 mL水溶解沉淀，加入2.5 mol/L NaOH 5 mL，銅應(yīng)用溶液5 mL，混勻，在沸水浴中煮沸2 min，冷卻后以4 000 r/min離心5 min，棄去上清液；沉淀用銅洗滌液洗滌2次，加5%HCl乙醇溶液5 mL混合，4 000 r/min離心5 min，得沉淀為猴頭菇子實體中的多糖［28-30］。

猴頭菇口服液多糖樣品：直接采用75%醇沉方法得到，以上述乙醇分級沉淀和堿性銅試劑沉淀法純化［31-32］。

1.3.2對照溶液制備

分子量測定對照品溶液：稱取分子量分別為1.0× 103、5.0×103、1.20×104、2.50×104、5.00×104、8.00×104、1.50×105、2.70×105、4.100×105、6.70×105的一系列葡聚糖標準品，用流動相配制成每種標樣的質(zhì)量濃度約為1.0 mg/mL的系列標準溶液，將樣品用流動相溶解，搖勻，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后，即得。

含量測定對照品溶液：稱取分子量為2.50×104葡聚糖標準品，精確到0.000 1 g，用流動相配制成濃度為0.10、0.25、0.50、1.00、2.50、5.00、10.00 mg/mL的系列對照品溶液，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后，即得。

1.3.3猴頭菇多糖分子量和含量測定色譜條件

色譜條件：TSKGel3000SWXL凝膠色譜柱，7.8mm× 300 mm；柱溫35℃；流動相為0.025 mol/L NaH2PO4+ 0.025 mol/L Na2HPO4（pH=6.7）+0.05%NaN3；流速0.8mL/min；檢測器為示差折光檢測器（RID），恒溫35℃［26］。

1.3.4猴頭菇多糖分子量測定

1.3.4.1校正曲線的繪制

分別取一系列不同分子量的對照品溶液20 μL進入凝膠色譜測試，根據(jù)其凝膠色譜的保留時間和分子量數(shù)據(jù)，建立多糖分子量測定的標準校準曲線。

1.3.4.2分子量測定方法及重復(fù)性考察

取猴頭菇子實體和猴頭菇口服液樣品各6份，按照1.3.1中方法對多糖進行提取和純化處理，得到猴頭菇子實體和猴頭菇口服液多糖沉淀，用5 mL水溶解并定容，經(jīng)0.45 μm水系濾膜過濾，作為待測液，再按1.3.3色譜條件測定多糖的分子量。根據(jù)其保留時間和多糖分子量標準校正曲線，計算猴頭菇子實體、猴頭菇口服液中多糖的分子量。

1.3.5猴頭菇多糖含量測定

1.3.5.1標準曲線的繪制

進行凝膠色譜分析。通過色譜峰面積與標準溶液的質(zhì)量濃度進行線性回歸。

1.3.5.2含量測定方法

將1.3.4.2處理好的猴頭菇子實體多糖和猴頭菇口服液多糖的待測液，進行凝膠色譜測定，根據(jù)標準線性方程計算猴頭菇子實體、猴頭菇口服液中多糖的含量。

1.3.6猴頭菇多糖含量測定方法學(xué)驗證

1.3.6.1精密度考察

取猴頭菇子實體、猴頭菇口服液樣品，各平行6份，按照1.3.1中方法對多糖進行提取和純化處理，按1.3.3方法測定多糖含量，計算相對標準偏差（RSD）。

1.3.6.2回收率考察

取9份猴頭菇子實體樣品2.0 g，分別添加相當(dāng)于其猴頭菇多糖含量80%、100%、120%的分子量為2.50×104Da葡聚糖標準品，按照1.3.1方法對多糖進行提取和純化處理，用5 mL純化水溶解定容，上凝膠色譜測定其含量，平行測定3次；取猴頭菇口服液樣品10.0 mL，分別添加相當(dāng)于其猴頭菇多糖含量80%、100%、120%的分子量為2.50×104Da葡聚糖標準品，按照1.3.1方法對多糖進行提取和純化處理，用5 mL純化水溶解定容，上凝膠色譜測定其含量，平行測定3次。計算回收率和相對標準偏差（RSD）。

2　結(jié)果與分析

2.1猴頭菇多糖分子量測定

2.1.1校準曲線的建立

根據(jù)試驗結(jié)果中凝膠色譜的保留時間和分子量數(shù)據(jù)，建立多糖分子量測定的標準校準曲線，如圖1、圖2所示。

圖1　葡聚糖標樣的凝膠色譜（a）和多糖分子量測定的標準校正曲線（b）Fig.1　Gel chromatography of dextran standard（a）and standard calibration curve for molecular weight determination of polysaccharides（b）

圖2　猴頭菇子實體多糖的凝膠色譜（a）和猴頭菇口服液多糖的凝膠色譜（b）Fig.2　Gel chromatograms of Hericium erinaceus polysaccharide（a）and oral liquid prepared from Hericium erinaceus（b）

2.1.2猴頭菇多糖分子量及重復(fù)性

猴頭菇多糖分子量測定結(jié)果表明，猴頭菇子實體和猴頭菇口服液多糖數(shù)均分子量Mn均為1.6×104Da，重均分子量Mw均為1.7×104Da，分布寬（D）在1.05～1.07范圍，RSD值均小于1%，重復(fù)性良好。結(jié)果見表1，典型的猴頭菇子實體和猴頭菇口服液多糖見圖2。

表1　猴頭菇多糖的分子量及重復(fù)性Table 1　Molecular weight of hericium erinaceus polysaccharide and repeatability

2.2猴頭菇多糖含量測定的方法研究

2.2.1校準曲線的繪制

選擇分子量為2.50×104Da的葡聚糖標準系列，通過色譜峰面積與標準溶液的質(zhì)量濃度進行線性回歸。結(jié)果表明，多糖質(zhì)量濃度在0.1 mg/100 mL～10 mg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性，線性方程為y=354.9+1.926× 105x，相關(guān)系數(shù)為0.999 96，見圖3、圖4。

圖3　系列多糖標準溶液的凝膠色譜圖Fig.3　Gel chromatogram of a series of polysaccharide standard

圖4　多糖含量校準曲線Fig.4　Calibration curve of polysaccharide content

2.2.2猴頭菇多糖含量及重復(fù)性

根據(jù)峰面積外標法進行單點定量測定，猴頭菇子實體多糖含量為0.634%～0.679%，猴頭菇口服液多糖含量為36.4 mg/100 mL～37.9 mg/100 mL。結(jié)果見表2。

表2　猴頭菇多糖的含量及重復(fù)性Table 2　The content of polysaccharide of Hericium erinaceus and repeatability

2.3猴頭菇多糖含量方法學(xué)驗證

2.3.1精密度考察

由表2可知，猴頭菇子實體和猴頭菇口服液多糖含量的RSD分別為2.46%和1.71%，可見含量精密度良好，儀器連續(xù)進樣誤差小。

2.3.2回收率考察

根據(jù)猴頭菇多糖分子量試驗結(jié)果顯示，校正曲線中分子量為2.50×104Da的葡聚糖標準品保留時間與猴頭菇多糖最接近，故選擇其作為回收率加標的標準樣品。猴頭菇多糖的回收率見表3。

表3　猴頭菇多糖的回收率（n=9）Table 3　Hericium erinaceus polysaccharide recovery rate（n=9）

由表3可知，猴頭菇子實體多糖含量的回收率在84.0%～86.8%之間，猴頭菇口服液多糖含量的回收率在86.7%～88.5%之間，鑒于重復(fù)性較好，為更準確反映多糖的實際含量，故實際含量可以經(jīng)折算回收率后確定。

3　結(jié)論

本試驗通過利用高效凝膠過濾色譜法（GFC）配合示差折光檢測儀，以不同分子量的葡聚糖標準品系列繪制分子量曲線，通過猴頭菇分子量的檢測，得出其分子量的大致區(qū)間。試驗結(jié)果表明，猴頭菇子實體和猴頭菇口服液多糖數(shù)均分子量Mn均為1.6×104Da，重均分子量Mw均為1.7×104Da，分布寬D在1.05～1.07范圍，重復(fù)良好。用猴頭菇多糖相對應(yīng)分子量的葡聚糖標準品繪制含量校準曲線，測得猴頭菇子實體多糖和猴頭菇口服液多糖含量分別為0.66%和37.1 mg/ 100 mL。同時，猴頭菇多糖的分子量和含量測定方法學(xué)驗證均基本符合要求，獲得一個系統(tǒng)性的檢測方法。

本研究經(jīng)系統(tǒng)驗證獲得的高效凝膠過濾色譜法和示差折光法測定猴頭菇多糖的分子量及含量，方法新穎、選擇性好、靈敏度高、重復(fù)性好。為一種靈敏適用的猴頭菇多糖檢測與分析方法提供理論基礎(chǔ)與操作指導(dǎo)，同時為以猴頭菇為原料的功能性保健食品或藥品的的開發(fā)提供基礎(chǔ)研究技術(shù)支持，使猴頭菇的深加工產(chǎn)業(yè)具有更廣泛的發(fā)展前景。

［1］Wong YangJing，ABDULLA M A，RAMAN J，et al，Gastroprotective Effects of Lion’s Mane Mushroom Hericium erinaceus（Bull.：Fr.）Pers.（Aphyllophoromycetideae）Extract against Ethanol-Induced Ulcer in Rats［J］.Hindawi Publishing Corporation Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine Volume，2013，2013（3）：492976

［2］KIM S P，KANG M Y，KIM J H，et al.Composition and Mechanism of Antitumor Effects of Hericium erinaceus Mushroom Extracts in Tumor-Bearing Mice［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2011，59（18）：9861-9869

［3］楊焱，周昌艷，王晨光，等．猴頭菌多糖調(diào)節(jié)機體免疫功能的研究［J］.食用菌學(xué)報，2000，7（1）：19-22

［4］HAN Zihua，YE Jianmin，WANG Guanfu.Evaluation of in vivo antioxidant activity of Hericium erinaceus polysaccharides［J］.International Journal of Biological Macromolecules，2013，52（1）：66-71

［5］LIANG Bin，GUO Zhengdong，XIE Fang，et al.Antihyperglycemic and antihyperlipidemic activities of aqueous extract of Hericium erinaceus in experimental diabetic rats［J］.BMC Complementary and Alternative Medicine，2013，13（13）：253

［6］貊潤翌，朱平．猴頭菌及其菌絲提取物的藥理與臨床研究進展［J］.華西藥學(xué)雜志，2009，24（5）：555-557

［7］MORI K，KIKUCHI H，OBARA Y，et al.Inhibitory effect of hericenone B from Hericium erinaceus on collagen-induced platelet aggregation［J］．Phytomedicine，2010，17（14）：1082-1085

［8］秦美蓉，李俊鵬，鐘敏.猴頭菇胃腸保健口服液對胃黏膜損傷的保護功能研究［J］.現(xiàn)代食品與藥品雜志，2007，17（6）：22-24

［9］范學(xué)工，吳安華，周平，等.猴頭菇口服液對胃上皮細胞的保護作用［J］.新消化病學(xué)雜志，1997，5（4）：270

［10］王曉玉，蔣秋燕，凌沛學(xué)，等．猴頭菌活性成分及藥理作用研究進展［J］.中國生化藥物雜志，2010，31（1）：70-72

［11］楊勇杰.猴頭多糖化學(xué)成分研究［D］.長春：吉林大學(xué)，2004

［12］陳明.抗癌菌類藥常用種類及近代研究進展［J］.食用菌，1994（2）：40-41

［13］USUI T，YOSHIO I，KATDUYUKI H，et al.Antitumor activity of water solutble 0-D-Glucane laborated by Ganoderma apPlanatum［J］. Agrie Biol Chem，1981，45（1）：323-332

［14］MIZUNO T，ITO H，SUZUKI C，et al.Antitumor-aetive Polysaeeharides isolated from the fruiting body of Herieium Erinaceus，an edible and mediclnal mushroom ealled yamabushitake or houtou［J］. Biosci Bioteehnol Bioehem，1992，56（2）：347-348

［15］樊偉偉，黃惠華.猴頭菇多糖研究進展［J］.食品科學(xué)，2008，29（1）：355-358

［16］邱龍新.真菌多糖化學(xué)研究［J］.龍巖師專學(xué)報，1999，3（17）：55-57

［17］李建，劉寧，陳平，等．香菇多糖分子質(zhì)量的測定方法研究［J］．哈爾濱商業(yè)大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2005，21（5）：644-648

［18］吳揚蘭，王遠亮，楊力．SEC-RI-MALLS技術(shù)在香菇多糖分子量與分子量分布分析方面的應(yīng)用研究［J］．藥物分析雜志，2011，31（12）：2256-2259

［19］王國佳，曹紅，邢俊波，等.凝膠色譜法同時測定香菇多糖制劑中多糖分子量和含量［J］.中國藥事，2013，27（10）：1090-1094

［20］史文濤，龐文生，胡娟.高效凝膠色譜法測定太子參均一多糖分子量［J］.中國民族民間醫(yī)藥，2015（2）：20，30

［21］李楠，李卓，張燕.高效分子排阻色譜法同時測定白及多糖分子量和含量［J］.藥物分析雜志，2012，32（10）：1801-1803

［22］徐曉霞，李炎，劉華.高效凝膠色譜法測定多花黃精多糖分子量與分子量分布［J］.四川生理科學(xué)雜志，2008，30（3）：102-103

［23］趙穎，宋新波，張麗娟.高效凝膠色譜法測定甘草多糖分子量及其分子量分布［J］.天津中醫(yī)藥，2015，32（1）：46-48

［24］WU Dingtao，LI Wenzhi，CHEN Jun，et al.An evaluation system for characterization of polysaccharides from the fruiting body of Hericium erinaceus and identification of its commercial product［J］.Carbohydrate Polymers，2015，124：201-207

［25］MALINOWSKA E，KRZYCZKOWSKI W，LPIENIS G，et al.Densitometric determination of carbohydrates：Application to purification and molecular weight determination of polysaccharide from Hericium erinaceum mushroom［J］.Food Research International，2010，43：988-995

［26］魏遠安，方積年.高效凝膠滲透色譜法測定多糖純度及分子量［J］.藥學(xué)學(xué)報，1989，24（7）：532-536

［27］陳軼蘭，王友茹，馬立人.用高效凝膠滲透色譜法測定多糖分子量［J］.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊，1988，12（1）：71-73

［28］張樹海.猴頭菇多糖提取及純化的研究［J］.食品研究與開發(fā)，2006，27（11）：103-105

［29］胡斌杰.超聲法提取猴頭菇多糖最佳工藝優(yōu)化研究［J］.化學(xué)世界，2009（9）：557-560

［30］肖麗霞，丁洪濤，胡曉松，等.猴頭菇多糖的純化工藝［J］.食品科學(xué)，2011，32（24）：186-190

［31］孟祥敏，王輝.猴頭多糖口服液的制備工藝研究［J］.食品工業(yè)，2013，34（3）：65-68

［32］陳勇，朱炳輝，陸惠文.猴頭菇口服液中多糖的分離和測定［J］.中國藥品標準，2002，4（3）：21-23

Determination of Molecular Weight and Content of Hericium erinaceus Polysaccharide by High Performance Gel Chromatography

ZHOU Chun-hui，ZHOU Dan-dan，LIU Ting-ting，MA Bing-nan
（Guangdong Apollo Co.，Ltd.，Guangzhou 510665，Guangdong，China）

High performance gel filtration chromatography（GFC）and differential refraction detection were used to carry out the molecular weight and quantitive analysis on polysaccharide in the fruiting body of Hericium erinaceus and oral liquid prepared from Hericium erinaceus.A standard calibration curve was first established with different molecular weight dextran and determination of Hericium erinaceus polysaccharide molecular weight and its molecular weight distribution were performed.The retention time was used as the standard and the peak area external standard method was used to determine the content of polysaccharides of Hericium erinaceus. The results showed that polysaccharide of Hericium erinaceus fruiting body and Hericium erinaceus oral liquid had molecular weight 16 000 Da to 17 000 Da，and wide D distribution from 1.05 to 1.07.Polysaccharide content of the average was 0.66%in Hericium erinaceus fruiting body and 37.1 mg/100 mL in oral liquid.The validation of the method meets the basic requirements.

Hericium erinaceuspolysaccharide；gelfiltrationchromatography（GFC）；molecularweight；content

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.21.028

廣東省省級科技計劃項目（2013B090600008）

周春暉（1974—），女（漢），高級工程師，碩士，研究方向：保健食品的研究與開發(fā)。

2015-12-23