吳艷立，丁之恩，閆晗，董敏，常慧，亢金秀

（安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)，安徽合肥230036）

黑豆皮中花青素大孔吸附樹脂分離純化工藝研究

吳艷立，丁之恩*，閆晗，董敏，?；?，亢金秀

（安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)，安徽合肥230036）

不同的大孔樹脂對(duì)花青素的吸附能力不同，本試驗(yàn)依據(jù)花青素的特征，大孔樹脂的特性，篩選出DM301、ADS-17、HPD-417 3種不同型號(hào)的大孔樹脂，以吸附率α和解吸率β為評(píng)價(jià)指標(biāo)，選擇兩種大孔樹脂進(jìn)行組合，對(duì)黑豆皮花青素粗提物進(jìn)行吸附與解吸試驗(yàn)，采用UPLC-MS對(duì)純化物進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明：最佳的樹脂比例組合是DM301：HPD-417為4∶1（質(zhì)量比），乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)65%，解吸液pH 3.5，動(dòng)態(tài)吸附上樣流速0.5 mL/min，洗脫液流速1.5 mL/min是最佳的選擇，純化的花青素主要成分為矢車菊素-3-O-葡萄糖苷。

黑豆皮；提?。换ㄇ嗨兀淮罂讟渲?；組合；純化；檢測(cè)

黑豆在我國(guó)產(chǎn)量豐富［1］，其皮富含花青素［2］，大量研究證實(shí)，花青素具有抗突變［3］、抗腫瘤［4］、抗過(guò)敏［5］、抗氧化［6］、清除氧自由基及抑制脂質(zhì)過(guò)氧化［7］、抑制血小板凝固、預(yù)防血栓、心臟?。?］、保護(hù)胃粘膜、降低血糖［9］等多種生理功能。

鑒于花青素的保健作用，越來(lái)越多的商家在投入對(duì)花青素的生產(chǎn)。花青素粗提物中通常含蛋白質(zhì)、還原糖等，它們對(duì)花青素的穩(wěn)定性及品質(zhì)有很大程度的影響，因此有必要對(duì)花青素粗提物進(jìn)行純化。

1　材料與方法

1.1材料、儀器與試劑

黑豆：市售，產(chǎn)地為山東。

ML204/02精密電子天平：上海梅特勒-托利多儀器有限公司；UV-1800紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海美諾達(dá)儀器有限公司；SHA-B雙功能水浴恒溫振蕩器：金壇市杰瑞爾電器有限公司；FDU-2100真空冷凍干燥機(jī)：上海愛(ài)朗儀器有限公司；錐形瓶；層析柱（內(nèi)徑1 cm，徑高20 cm）：上海煊盛生化科技有限公司）；Agilent6460+1290超高效液相色譜-三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國(guó)Agilent公司。

檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液：北京雷根生物技術(shù)有限公司；無(wú)水乙醇、乙腈（色譜純）、甲酸（色譜純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；DM301型大孔吸附樹脂：天津市海光化工有限公司；ADS-17型大孔吸附樹脂、HPD-417型大孔吸附樹脂：滄州寶恩化工有限公司。大孔吸附樹脂的物理性能見(jiàn)表1。

表1　吸附樹脂的物理性能Table 1 Physical properties of adsorption resins

1.2方法

1.2.1黑豆皮花青素的提取

用檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液（pH為3）在提取溫度50℃，提取時(shí)間100 min，液料比20∶1（mL/g）條件下對(duì)黑豆皮花青素進(jìn)行恒溫水浴振蕩提取，并將提取液濃縮后用真空冷凍干燥機(jī)冷凍干燥，備用。

1.2.2大孔樹脂預(yù)處理

將型號(hào)為DM301、ADS-17、HPD-417的大孔樹脂分別先用95%的乙醇溶液浸泡24 h，用去離子水洗至中性無(wú)醇味；再5%NaOH溶液浸泡12 h，去離子水洗至中性；最后用5%的鹽酸浸泡12 h，去離子水洗至中性，備用［10-11］。

1.2.3大孔樹脂吸附率、解吸率的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取一定量花青素粗提物，置于三角瓶中加V0mL去離子水，波長(zhǎng)530 nm測(cè)其吸光值A(chǔ)0。取足量經(jīng)預(yù)處理的大孔樹脂加入到三角瓶中，置恒溫振蕩器上20℃、120 r/min振蕩24 h，充分吸附后，過(guò)濾，測(cè)濾液體積V1、吸光值A(chǔ)1。向?yàn)V出的樹脂中加入V0mL pH為3.0的60%乙醇溶液，20℃、120 r/min振蕩24 h，充分解吸后過(guò)濾，測(cè)濾液體積V2、吸光值A(chǔ)2，計(jì)算吸附率α和解吸率β［12］。

式中：A0為樣液吸附前的吸光度值；V0為樣液吸附前的體積，mL；A1為吸附過(guò)濾后濾液的吸光度值；V1為吸附過(guò)濾后濾液的體積，mL；A2解吸后濾液的吸光度值；V2解吸后濾液的體積，mL。

1.2.4靜態(tài)吸附與解吸試驗(yàn)

1.2.4.1大孔樹脂的選擇

依據(jù)花青素的特征、大孔樹脂的特性及前人的研究成果［13-15］，選取DM301、ADS-17、HPD-417 3種不同型號(hào)的大孔樹脂進(jìn)行試驗(yàn)，記錄吸附率α和解吸率β，之后選擇其中兩種的組合進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2.4.2乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)的選擇

取5份吸附花青素飽和的樹脂2g，分別加入pH 3.0，體積分?jǐn)?shù)為45%、55%、65%、75%、85%的乙醇溶液25 mL，置水浴恒溫振蕩器上20℃、120 r/min振蕩24 h，分別過(guò)濾，530 nm處測(cè)濾液體積V2、吸光度值A(chǔ)2，計(jì)算解吸率。

1.2.4.3解吸液pH的選擇

條件步驟同1.2.4.2，其中pH分別為2.5、3.0、3.5、4.0、4.5，乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)為65%，濾液體積V2、吸光度值A(chǔ)2。

1.2.5動(dòng)態(tài)柱層析試驗(yàn)

1.2.5.1上樣流速的選擇

選擇預(yù)處理后的大孔樹脂，濕法裝柱。將已測(cè)吸光度，濃度為10 mg/mL，pH為3.5的花青素粗提液2 mL，控制流速分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL/min常溫下通過(guò)層析柱，待樣液全部通過(guò)層析柱后，測(cè)流出液體積V1、吸光度值A(chǔ)1，計(jì)算吸附率。

1.2.5.2洗脫流速的選擇

將pH 3.5，體積分?jǐn)?shù)65%的乙醇溶液以0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL/min 5個(gè)流速梯度通過(guò)吸附飽和的樹脂柱，待洗脫完成后，測(cè)洗脫液體積V2、吸光值A(chǔ)2，計(jì)算解吸率。

1.2.6驗(yàn)證性試驗(yàn)

預(yù)處理后的DM301∶HPD-417=4∶1（質(zhì)量比）的大孔樹脂組合濕法裝柱，10 mg/mL，pH為3.5的黑豆皮花青素粗提物以0.5 mL/min進(jìn)行上樣，吸附飽和后，pH3.5，體積分?jǐn)?shù)65%的乙醇溶液1.5 mL/min進(jìn)行洗脫。收集25 mL～35 mL的洗脫液，冷凍干燥，測(cè)花青素純度，平行試驗(yàn)5次。

1.2.7UPLC-MS的檢測(cè)

1.2.7.1色譜條件

流動(dòng)相A：0.5%甲酸水溶液；流動(dòng)相B：乙腈；洗脫參數(shù)見(jiàn)表2。

表2　梯度洗脫參數(shù)Table 2　Gradient elution parameters

1.2.7.2質(zhì)譜方法

掃描方式：正離子掃描；氣溫：325℃；氣流量：6 L/min。

2　結(jié)果與分析

2.1靜態(tài)吸附與解吸試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1大孔樹脂的選擇結(jié)果

3種型號(hào)大孔樹脂對(duì)黑豆皮花青素的吸附率及解吸率如表3所示。

表3　3種型號(hào)大孔樹脂對(duì)黑豆皮花青素的吸附率及解吸率Table 3　The adsorption and desorption rate of 3 types of macroporous resin on black soybean hull anthocyanin

由表3可知，3種型號(hào)的大孔樹脂中，DM301的吸附率最高，解吸率最低，但與另兩種相差不大，HPD-417的解吸率最高，吸附率居中，因此，綜合考慮，選取DM301和HPD-417兩種大孔樹脂以不同比例組合，進(jìn)行試驗(yàn)。

DM301和HPD-417大孔樹脂組合對(duì)黑豆皮花青素的吸附率及解吸率如表4所示。

表4　DM301和HPD-417大孔樹脂組合對(duì)黑豆皮花青素的吸附率及解吸率Table 4　The adsorption and desorption rate of combination of DM301 and HPD-417 macroporous resin on black soybean hull anthocyanin

由表4可知，DM301∶HPD-417為4∶1（質(zhì)量比）時(shí)吸附率最高，且解吸率與最高的解吸率相差不大，綜合考慮各大孔樹脂組合比例的吸附率與解吸率，選擇DM301∶HPD-417為4∶1（質(zhì)量比）進(jìn)行試驗(yàn)。

2.1.2乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)的選擇結(jié)果

乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)對(duì)解吸率的影響見(jiàn)圖1。

圖1　乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)對(duì)解吸率的影響Fig.1　Effect of ethanol solution volume fraction on the desorption rate

由圖1可知，乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)為65%時(shí)，解吸效果最好。這是由于低濃度的乙醇溶液極性偏大，不能將大孔樹脂中黑豆皮花青素充分解吸，解吸效果較差，而高濃度的乙醇解吸率并無(wú)明顯提高，而解吸成本卻在增加，從節(jié)約成本及解吸效果角度講，65%的乙醇溶液是較好的選擇。

2.1.3解吸液pH的選擇結(jié)果

解吸液pH對(duì)解吸率的影響見(jiàn)圖2。

圖2　解吸液pH對(duì)解吸率的影響Fig.2　Effect of desorption agent pH on the desorption rate

由圖2可知，pH 3.5時(shí)，解吸液乙醇溶液對(duì)大孔樹脂中黑豆皮花青素的解吸效果最好，這是由于pH小于3.5時(shí)，被解吸出來(lái)的花青素結(jié)構(gòu)可能遭到破壞，而pH大于3.5時(shí)，黑豆皮花青素不能被充分解吸出來(lái)，這都使解吸率有所降低。

2.2動(dòng)態(tài)柱層析試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1上樣流速的選擇結(jié)果

上樣流速對(duì)吸附效果的影響見(jiàn)圖3。

圖3　上樣流速對(duì)吸附效果的影響Fig.3　Effect of flow rate on adsorption

由圖3可知，當(dāng)上樣流速在0.5 mL/min～1.5 mL/min時(shí)，流速越低吸附效果越好，但吸附率相差不大，當(dāng)流速大于1.5 mL/min時(shí)，吸附率有明顯下降，吸附效果不理想。因此，從節(jié)約成本角度出發(fā)，1.5 mL/min是較好的選擇，但如果比較重視吸附效果時(shí)，可采取較低的流速0.5 mL/min。

2.2.2洗脫流速的選擇結(jié)果

洗脫流速對(duì)洗脫效果的影響見(jiàn)圖4。

圖4　洗脫流速對(duì)洗脫效果的影響Fig.4　Effect of flow rate on elution

由圖4可知，0.5 mL/min～1.5 mL/min時(shí)，乙醇溶液對(duì)大孔樹脂中吸附的黑豆皮花青素的解吸率相差不大，解吸效果相當(dāng)，當(dāng)洗脫流速大于1.5 mL/min時(shí)，解吸率明顯下降，解吸效果較差。因此，從節(jié)約成本角度出發(fā)，可選擇1.5 mL/min的流速進(jìn)行洗脫。

2.3驗(yàn)證性試驗(yàn)結(jié)果

5次試驗(yàn)得到的花青素純度分別為82.14%、83.68%、82.75%、81.59%、84.02%。經(jīng)計(jì)算，其標(biāo)準(zhǔn)差為0.009 119，變異系數(shù)為0.011 009，二者數(shù)值都較小，說(shuō)明上述純化方法的重復(fù)性較好。

2.4UPLC-MS檢測(cè)結(jié)果

UPLC-MS檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖5。

由圖5可知，一級(jí)MS檢測(cè)到花青素主要成分分子量為449.1，以449.1為母離子進(jìn)行二級(jí)MS檢測(cè)，檢測(cè)到分子量為287.1的子離子，因此，純化后的黑豆皮花青素主要成分為矢車菊素-3-O-葡萄糖苷。

圖5　UPLC-MS檢測(cè)結(jié)果Fig.5　The result of UPLC-MS detection

3　結(jié)論

采用大孔樹脂組合對(duì)黑豆皮花青素粗提物進(jìn)行柱層析，適宜條件下，純化后的黑豆皮花青素純度較高，且主要成分為矢車菊素-3-O-葡萄糖苷。

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Study on the Process of Macroporous Resin Isolate and Purify Anthocyanin from Black Soybean Hull

WU Yan-li，DING Zhi-en*，YAN Han，DONG Min，CHANG Hui，KANG Jin-xiu
（Anhui Agricultural University，Hefei 230036，Anhui，China）

Different macroporous resins have different abilities of adsorption for anthocyanin.According to the characteristics of anthocyanin and the characteristics of macroporous resin，three different types of macroporous（DM301，ADS-17，HPD-417）resins were selected in this experiment.，the adsorption rate α and desorption rate β were act as evaluation index，two kinds of macroporous resins were selected for adsorption and desorption experiment of black soybean hull anthocyanin extracts.At last，use UPLC-MS to detect the purified anthocyanin.The results showed that The best resin ratio combination is 4∶1 for DM301：HPD-417，the ethanol volume fraction 65%，the desorption liquid pH3.5，the dynamic adsorption on the sample flow rate 0.5 mL/min，the desorption flow rate 1.5 mL/min，the main component of the purified anthocyanins is Cyanidin-3-O-glucoside.

black soybean hull；extraction；anthocyanin；macroporous resin；combination；purification；detection

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.21.012

吳艷立（1989—），女（漢），碩士，主要研究方向：食品資源開發(fā)與利用。

丁之恩（1956—），男（漢），教授，主要研究方向：經(jīng)濟(jì)林及產(chǎn)品加工的教學(xué)與研究。

2015-12-28