吳 婷, 王振平, 張傳靜, 杜一平

(華東理工大學(xué)分析測(cè)試中心,上海 200237)

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陣列單液滴的捕獲及單細(xì)胞分析

吳 婷, 王振平, 張傳靜, 杜一平

(華東理工大學(xué)分析測(cè)試中心,上海 200237)

通過流動(dòng)聚焦型微液滴生成裝置進(jìn)行油包水液滴的制備,比較了3種不同的單液滴陣列捕獲芯片對(duì)單液滴的捕獲效率和操作性能,選取上下開口圓形結(jié)構(gòu)獲得滿意的單液滴捕獲。進(jìn)一步利用該液滴生成和捕獲一體式芯片進(jìn)行了液滴中單細(xì)胞的包覆、單細(xì)胞的實(shí)時(shí)染色和細(xì)胞存活狀態(tài)的檢測(cè)。在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下制備得到了粒徑為75 μm的單分散液滴,液滴捕獲芯片中的單液滴截留率為100%,單細(xì)胞包覆率約為33%。對(duì)捕獲液滴中的單細(xì)胞進(jìn)行實(shí)時(shí)染色結(jié)果表明,在5 min內(nèi)獲得了滿意的細(xì)胞核實(shí)時(shí)染色,并通過細(xì)胞死活實(shí)時(shí)染色對(duì)細(xì)胞存活狀態(tài)直接進(jìn)行了表征。

微液滴; 單液滴陣列; 單細(xì)胞

微流控芯片技術(shù)是近年來發(fā)展非常迅速的一個(gè)交叉學(xué)科的研究方向。它將通道尺寸在10～100 μm的通道網(wǎng)絡(luò)集成在一個(gè)芯片中,可以在芯片中進(jìn)行極小樣品體積的引入、混合和反應(yīng),并通過多種檢測(cè)方式獲取有用的信息。微液滴芯片技術(shù)作為微流控芯片技術(shù)的一個(gè)重要分支,在化學(xué)、生物、材料科學(xué)、藥學(xué)等領(lǐng)域已經(jīng)發(fā)揮了非常重要的作用[1-5]。在微液滴芯片中,單分散的液滴會(huì)以每秒數(shù)千計(jì)的速率源源不斷地產(chǎn)生,每個(gè)液滴即成為一個(gè)單獨(dú)的封閉反應(yīng)腔體,在這樣的微液滴中可以進(jìn)行如化學(xué)物檢測(cè)[5-6]、化學(xué)合成[7-8]、酶活檢測(cè)[9-10]、基因表達(dá)[11-12]、細(xì)胞相關(guān)實(shí)驗(yàn)[13-14]等諸多實(shí)驗(yàn)。同時(shí),在微液滴芯片中還可以進(jìn)行包括液滴融合、分裂、分選等多步操作,這些優(yōu)勢(shì)使其成為化學(xué)和生物學(xué)中非常有用的技術(shù)平臺(tái)。

陣列相關(guān)技術(shù)在藥物開發(fā)、微生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)中被廣泛采用[15]。在陣列中整齊排列的眾多單元允許進(jìn)行平行的過程,利用較少的液體就能同時(shí)監(jiān)測(cè)多個(gè)化學(xué)或生物反應(yīng)。這樣不僅能極大地減少樣品的體積,而且可以增加分析的通量,獲得統(tǒng)計(jì)學(xué)分析的信息。現(xiàn)有的獲取細(xì)胞統(tǒng)計(jì)學(xué)信息分析的方法主要是使用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)熒光染色的細(xì)胞得到統(tǒng)計(jì)學(xué)信息。然而由于流式細(xì)胞術(shù)為連續(xù)流中進(jìn)行的檢測(cè),細(xì)胞間并無擴(kuò)散界限,因而無法根據(jù)其分泌的特征物質(zhì)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)或分選,只能根據(jù)其胞內(nèi)物質(zhì)或細(xì)胞膜表面的物質(zhì)來進(jìn)行分析。將微液滴芯片與陣列技術(shù)結(jié)合,生成的液滴通過一個(gè)陣列結(jié)構(gòu)進(jìn)行捕獲,單個(gè)液滴即為一個(gè)獨(dú)立的反應(yīng)體系,利用單液滴陣列能進(jìn)行極小體積內(nèi)的各類平行實(shí)驗(yàn)。其中陣列微液滴芯片中的單細(xì)胞分析就是熱門方向之一[16-17]。單細(xì)胞分析是分析化學(xué)、生物學(xué)和醫(yī)學(xué)之間滲透發(fā)展形成的跨學(xué)科前沿領(lǐng)域。常規(guī)的細(xì)胞分析所獲得的是大量細(xì)胞的平均值,然而由于細(xì)胞間的差異性,這樣的結(jié)果常常會(huì)誤導(dǎo)大家。譬如一個(gè)細(xì)胞群體中50%的蛋白表達(dá)可能是一半細(xì)胞的100%表達(dá),亦可能是所有細(xì)胞均有50%的表達(dá)。單細(xì)胞分析可以獲得大量個(gè)體細(xì)胞的信息以及統(tǒng)計(jì)學(xué)有用的數(shù)據(jù)。在微液滴中包覆單細(xì)胞可以平行檢測(cè)細(xì)胞的組分,實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)胞釋放及高通量陣列檢測(cè)等。

本實(shí)驗(yàn)中將微液滴生成和捕獲設(shè)計(jì)在同一芯片中,將生成的微液滴直接流入單液滴捕獲結(jié)構(gòu)中被捕獲,而單細(xì)胞被包覆在液滴中,從而可以直接觀察液滴中單細(xì)胞的實(shí)時(shí)染色情況,并獲得細(xì)胞存活率信息。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與試劑

聚二甲基硅氧烷(Polydimethylsiloxane,PDMS)Sylgard184 購于美國道康寧公司(DOW CORNING,USA);山梨醇酐單油酸酯(Sorbitan monooleate,Span-80)分析純,購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司;正十六烷(n-Hexadecane)，分析純,購于上海凌峰化學(xué)試劑有限公司;DAPI、鈣黃綠素-AM (Calcein-AM) 和碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)均購于東仁化學(xué)科技有限公司。

1.2 微流控芯片制作

芯片的制作均采用標(biāo)準(zhǔn)的軟刻蝕(Soft Lithography)法(SU-8模具和PDMS復(fù)制)。首先將設(shè)計(jì)好的芯片結(jié)構(gòu)制成透明的光刻掩膜,將負(fù)光刻膠SU-8 2050 旋涂于硅片上制成厚度為100 μm的一層,通過紫外燈曝光將掩膜上的圖形轉(zhuǎn)移至光刻膠上后顯影成所需的芯片模板。將PDMS與固化劑按體積比10∶1混合均勻,真空脫氣后澆筑于SU-8模板上,在干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)中65 ℃熱烘2 h。PDMS復(fù)制片從硅片上剝離后通過氧氣等離子體(PDS-001 等離子體清洗機(jī),Harrick,美國)的作用與載玻片鍵合,完成芯片的封裝。聚四氟乙烯管(內(nèi)徑為0.9 mm)用于連接注射泵和芯片通道。芯片中液體的流速通過注射泵(保定蘭格恒流泵有限公司)控制。

芯片的示意圖如圖1所示。其中液滴生成部分采用的是流動(dòng)聚焦型微液滴生成裝置,通道寬度為 100 μm,高度為100 μm,狹口處寬度為50 μm。液滴捕獲裝置含有127個(gè)捕獲單元。液滴生成部分A和液滴捕獲部分B通過連續(xù)相直接引入的方式進(jìn)行連接。

圖1 液滴形成與捕獲一體式芯片結(jié)構(gòu)圖Fig.1 A schematic of chip structure for droplet formation and encapsulation

1.3 液滴的生成和成像

本文中液體的驅(qū)動(dòng)全部通過注射泵完成,裝置如圖2所示,包含w=3%的Span 80穩(wěn)定劑的正十六烷充當(dāng)體系的連續(xù)油相。所有的液體均經(jīng)過0.22 μm濾膜過濾后進(jìn)入微流控芯片中。液滴的生成通過一個(gè)含有兩個(gè)入口的流動(dòng)聚焦型芯片來實(shí)現(xiàn)。

圖2 液滴生成、捕獲和觀測(cè)裝置圖Fig.2 Device for droplets formation, encapsulation and observation

液滴的生成和捕獲陣列中的液滴均通過激光共聚焦顯微鏡(Nikon,A1R)來成像顯示,所使用物鏡放大倍數(shù)為10,成像軟件為NIS Elements。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)和染色液的配制

卵巢癌細(xì)胞skov3細(xì)胞株(中科院細(xì)胞庫提供)在RPMI-1640培養(yǎng)液(滅活胎100 mL/L牛血清,100 ku/L青霉素,50 g/L鏈霉素)中培養(yǎng),并置于CO2培養(yǎng)箱中(37 ℃,φ=5%的CO2,飽和濕度條件)。細(xì)胞隔天換液,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。將貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞用胰蛋白酶消化,并用磷酸緩沖液(PBS)清洗至少一次,重新懸浮于新鮮的PBS溶液中用于單細(xì)胞包覆實(shí)驗(yàn)。在單細(xì)胞分析實(shí)驗(yàn)中,將清洗后的細(xì)胞和染色液直接混合進(jìn)入微液滴芯片中。

將由商業(yè)途徑獲得的DAPI標(biāo)準(zhǔn)液(5 mg/mL)用PBS稀釋1 000倍用于后續(xù)的細(xì)胞染色。

將鈣黃綠素AM和PI用二甲基亞砜(DMSO)溶解配成1 nmol /L的儲(chǔ)存液。染色前將儲(chǔ)存液用PBS稀釋500倍用于后續(xù)細(xì)胞死活的染色分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 微液滴的生成

微液滴的生成通過一個(gè)流動(dòng)聚焦型結(jié)構(gòu)所獲得,該結(jié)構(gòu)主要由連續(xù)相通道、分散相通道、夾口、主通道組成,微液滴生成后經(jīng)主通道進(jìn)入捕獲結(jié)構(gòu)(圖3(a))。利用該流動(dòng)聚焦型微液滴生成裝置能很好地調(diào)控微液滴的粒徑。在我們的前期工作[18]中,能通過兩相流速的調(diào)節(jié)來調(diào)控微液滴的粒徑,在本實(shí)驗(yàn)中所采用的是含有50 μm夾口的流動(dòng)聚焦型芯片,通過控制兩相的流速能穩(wěn)定獲得直徑為50～100 μm之間的微液滴?？紤]到后續(xù)的微液滴捕獲,控制水相流速為1 μL/min,油相流速為 1.2 μL/min,能穩(wěn)定獲得單分散的微液滴,并且所獲微液滴的分布如圖3(a)所示,從圖中可以看出液滴大小均勻。圖3(b)為液滴的直徑分布圖,該條件下獲得的微液滴直徑在70～80 μm之間,其中直徑在75 μm的液滴約85%左右。

圖3 流動(dòng)聚焦型裝置液滴生成的實(shí)時(shí)圖像(a)和微液滴的直徑分布圖(b)Fig.3 Real time image of microdroplet production (a) and sizes distribution of microdroplets from flow-focusing microfluidic chip (b)

2.2 微液滴的捕獲

芯片的另一個(gè)組成部分是單液滴捕獲裝置。其中的液滴捕獲結(jié)構(gòu)以能容納最大直徑100 μm液滴為標(biāo)準(zhǔn),分別考察了3種不同的液滴捕獲結(jié)構(gòu)(如圖4所示),其中圖4(a)和圖4(b)所示為兩種常用的微球或液滴捕獲結(jié)構(gòu),圖4(c)所示為改進(jìn)后的一種液滴捕獲結(jié)構(gòu)。圖4(a)所示為上下開口的敞開式三角結(jié)構(gòu)；圖4(b)所示為左右開口的圓形結(jié)構(gòu)；圖4(c)所示為上下開口的圓形結(jié)構(gòu),上開口用于液滴的引入,下開口用于液滴的反方向吹離。

圖4 3種液滴捕獲結(jié)構(gòu)示意圖Fig.4 Schematic of three encapsulation structures for microdroplets

圖4(a)中的捕獲單元類似凹形腔體,兩端開口,一端用于接收液滴,另一端作為疏流口。捕獲單元交叉排列,使液滴易于被捕獲。當(dāng)凹形結(jié)構(gòu)捕獲到液滴以后,后面的疏流口被堵住,流阻變大,其他液滴改道,很難再進(jìn)入。然而此種結(jié)構(gòu)捕獲的液滴容易受兩相流速的影響,停泵以后液滴易脫離捕獲結(jié)構(gòu),液滴不能長(zhǎng)時(shí)間被固定。圖4(b)中捕獲單元為圓形腔,腔體的兩個(gè)開口處分別在流體的左右兩側(cè)。此種結(jié)構(gòu)兩相液體流速不能太大,流速過大會(huì)使捕獲的液滴從圓形裝置小開口一端流走,產(chǎn)生大量小液滴,擾亂后面捕獲單元的捕獲?；谝陨蟽煞N結(jié)構(gòu)的特點(diǎn),經(jīng)過改進(jìn)獲得了第3種捕獲結(jié)構(gòu)(圖4(c)),其中捕獲單元的圓形腔結(jié)構(gòu)和圖4(b)相同,改進(jìn)腔體的開口端為上下開口,有效地改善了因左右開口流阻不均引起的液滴分裂。借鑒圖4(a)中的兩列捕獲單元錯(cuò)開排列,使液滴易于被捕獲。當(dāng)半圓形結(jié)構(gòu)捕獲到液滴以后,后面的疏流口被堵住,流阻變大,其他液滴改道,很難再進(jìn)入。在液滴進(jìn)入捕獲陣列結(jié)構(gòu)時(shí),開口變大,液體流速變慢,液滴被捕獲以后不容易從圓形裝置中沖出。當(dāng)實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí),可以通過反向通入油相的方法將液滴推離捕獲結(jié)構(gòu)而重新獲得空白結(jié)構(gòu)用于下一輪實(shí)驗(yàn)?；谝陨蟽?yōu)點(diǎn),選擇圖4(c)的結(jié)構(gòu)進(jìn)行后續(xù)的微液滴的捕獲和單細(xì)胞分析實(shí)驗(yàn)。

圖5所示為第3種結(jié)構(gòu)(圖4(c))捕獲液滴后的照片。從圖中可以看出,在水相流速1 μL/min,油相流速 1.2 μL/min時(shí),粒徑約75 μm的液滴在捕獲結(jié)構(gòu)中均能被捕獲,截留單液滴捕獲率達(dá)到100%。

2.3 液滴中單細(xì)胞的包覆

由于所捕獲液滴的均一性和穩(wěn)定性,我們將前述的液滴生成和捕獲一體式結(jié)構(gòu)應(yīng)用于單細(xì)胞分析中。每個(gè)微液滴中所含的液體體積基本一致,所處的環(huán)境一致,一個(gè)液滴即為一個(gè)單獨(dú)的反應(yīng)體系。監(jiān)測(cè)其中的每一個(gè)液滴中的單細(xì)胞反應(yīng),可以獲得每個(gè)有個(gè)體差異的細(xì)胞的不同狀態(tài),獲得單細(xì)胞分析的數(shù)據(jù),并通過對(duì)許多單細(xì)胞的分析獲得統(tǒng)計(jì)學(xué)的數(shù)據(jù),為后續(xù)研究細(xì)胞的行為、藥物的作用等提供依據(jù)。在微液滴生成時(shí)包覆單細(xì)胞和反應(yīng)液,可以在微液滴中進(jìn)行單細(xì)胞的一系列分析。采用細(xì)胞密度為1.47×106/mL 的卵巢癌細(xì)胞(skov3),在水相流速為1 μL/min,油相流速為 1.2 μL/min時(shí),獲得33%的單細(xì)胞包覆率(圖6)。該結(jié)果符合泊松分布(Poisson distribution),和文獻(xiàn)數(shù)據(jù)基本吻合[19]。

圖5 單液滴的捕獲Fig.5 Encapsulation of single droplet

2.4 液滴內(nèi)單細(xì)胞分析

通過該芯片可以獲得一定數(shù)量的包覆單細(xì)胞的液滴。通過在液滴生成過程中的水相入口中通入一定濃度的細(xì)胞核染色液DAPI,對(duì)細(xì)胞核的染色過程進(jìn)行實(shí)時(shí)觀測(cè)。選取其中一個(gè)含有單細(xì)胞的液滴在共聚焦顯微鏡下實(shí)時(shí)采集熒光圖像,結(jié)果如圖7所示。從圖中可以看出,2 min以后細(xì)胞核已經(jīng)染上熒光,5 min后熒光達(dá)到穩(wěn)定。

圖6 液滴中的單細(xì)胞包覆(其中箭頭所指為單細(xì)胞)Fig.6 Encapsulation of single cell in microdroplets (Arrows for single cells)

通過對(duì)液滴中的單細(xì)胞進(jìn)行實(shí)時(shí)死活的染色,對(duì)液滴中的單細(xì)胞進(jìn)行了存活率和存活時(shí)間的分析。鈣黃綠素和PI兩種染料配成一定濃度的溶液可以分別染活細(xì)胞和死細(xì)胞,在共聚焦熒光顯微鏡下活細(xì)胞呈現(xiàn)綠色,死細(xì)胞呈紅色。圖8(a)所示為芯片外skov3細(xì)胞的染色情況,絕大多數(shù)細(xì)胞都是綠色,說明細(xì)胞存活狀態(tài)良好,只有個(gè)別細(xì)胞死亡,呈現(xiàn)紅色。細(xì)胞在懸浮液中分布,拍照時(shí)不在同一焦面,顏色亮暗會(huì)有差異,與細(xì)胞存活狀態(tài)無關(guān)。將鈣黃綠素和PI兩種染料配成的溶液在液滴生成部分的一個(gè)水相入口通入芯片中和單細(xì)胞包覆在同一個(gè)液滴中,實(shí)時(shí)觀察細(xì)胞的狀態(tài)。如圖8(b)所示,5 min后細(xì)胞已有明顯的熒光,且鏡頭下拍到的5個(gè)細(xì)胞均呈綠色,說明被捕獲液滴中的細(xì)胞為活細(xì)胞。經(jīng)過約60 min的孵育后,細(xì)胞存活率未有明顯的下降,可見該裝置可以實(shí)現(xiàn)短時(shí)間內(nèi)對(duì)細(xì)胞的實(shí)時(shí)培養(yǎng)和監(jiān)測(cè)。

圖7 液滴內(nèi)對(duì)細(xì)胞核實(shí)時(shí)染色Fig.7 DAPI staining in situ in microdroplet

圖8 細(xì)胞死活染色圖像Fig.8 Live-dead staining

3 結(jié) 論

本文利用微液滴生成和捕獲一體式芯片,能將生成的單分散的微液滴捕獲在設(shè)計(jì)好的截留結(jié)構(gòu)中,很好地實(shí)現(xiàn)單液滴的捕獲。同時(shí),利用該芯片進(jìn)行了液滴中單細(xì)胞的包覆和分析,在穩(wěn)定獲得包覆單細(xì)胞的液滴后,在液滴中可以實(shí)時(shí)地進(jìn)行細(xì)胞的染色和存活率的分析。該芯片在藥物篩選、DNA、蛋白、細(xì)胞包覆等方面具有重要的意義和潛在的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)。

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Encapsulation of Monodisperse Microdroplet Arrays and Single-Cell Analysis

WU Ting, WANG Zhen-ping, ZHANG Chuan-jing, DU Yi-ping

(Research Centre of Analysis and Test,East China University of Science and Technology,Shanghai 200237,China)

The monodisperse water-in-oil microdroplets were prepared by a flow-focusing microfluidic chip.The capture effciency and operating performame of three different encapsulation structures were compared.A circular structure with opening up and down was selected for better encapsulation of microdroplet.Further,single cell encapsulation in microdroplet,cell staining and cell viability were carried out using this chip.Under the optimum conditions,monodisperse microdroplets with radius of 75 μm were prepared,the encapsulation of microdroplet in chip and single cell in each droplet were 100% and 33%,respectively.Also,staining results of single cell in capture droplets showed that the cell nucleus staining in microdroplets was accomplished within 5 min cell.The viability of cells in droplets was evaluated directly via live-dead staining in real time.

microdroplets; monodroplet arrays; single cell

1006-3080(2016)05-0670-06

10.14135/j.cnki.1006-3080.2016.05.013

2015-12-25

國家自然科學(xué)基金青年基金(21205041)

吳 婷(1980-),女,湖南益陽人,博士,研究方向?yàn)槲⒘骺匦酒?。E-mail:wu_ting@ecust.edu.cn

杜一平,E-mail:yipingdu@ecust.edu.cn

TQ223.16+2

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