高小燕，何守志

曲安奈德對(duì)棕色挪威大鼠脈絡(luò)膜新生血管生長的影響①

高小燕，何守志

目的觀察光凝后即刻玻璃體腔內(nèi)注射曲安奈德對(duì)棕色挪威大鼠脈絡(luò)膜新生血管生長的影響。方法36只健康棕色挪威大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，每組18只，隨機(jī)抽取一眼作為實(shí)驗(yàn)眼。建立棕色挪威大鼠脈絡(luò)膜新生血管動(dòng)物模型。視網(wǎng)膜光凝后，實(shí)驗(yàn)組立即玻璃體腔內(nèi)注射曲安奈德8μl；對(duì)照組在實(shí)驗(yàn)眼玻璃體內(nèi)注射同等容積的等滲平衡鹽溶液。分別在光凝后2、4、6周取6只大鼠，采用免疫組化法檢測核因子-κB蛋白的表達(dá)，測量脈絡(luò)膜新生血管的最大面積。結(jié)果實(shí)驗(yàn)組的脈絡(luò)膜新生血管面積及核因子-κB蛋白的表達(dá)低于同期對(duì)照組（t＞7.450，P＜0.001）。結(jié)論曲安奈德可抑制棕色挪威大鼠脈絡(luò)膜新生血管的生長，降低核因子-κB蛋白的表達(dá)。

曲安奈德；核因子-κB；脈絡(luò)膜新生血管；棕色挪威大鼠

［本文著錄格式］高小燕，何守志.曲安奈德對(duì)棕色挪威大鼠脈絡(luò)膜新生血管生長的影響［J］.中國康復(fù)理論與實(shí)踐，2016，22 （10）：1154-1158.

CITED AS：Gao XY，He SZ.Effects of triamcinolone acetonide on choroidal neovascularization in brown Norway rats［J］.Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian，2016，22（10）：1154-1158.

脈絡(luò)膜新生血管（choroidal neovascularization，CNV）可以導(dǎo)致嚴(yán)重的和永久的視力喪失，是現(xiàn)在眼科主要致盲的疾病之一。CNV現(xiàn)被廣泛地認(rèn)為屬于創(chuàng)傷愈合和組織修復(fù)的幾個(gè)關(guān)鍵過程的一個(gè)組成成分［1］。CNV發(fā)展是一個(gè)復(fù)雜過程，包括各種細(xì)胞成分參與，以及細(xì)胞因子調(diào)節(jié)的失衡、轉(zhuǎn)錄因子的激活、趨化因子的表達(dá)等。在CNV的多種發(fā)病機(jī)制中，炎癥作用機(jī)制也日益引起人們的重視［2-3］。核因子-κB （nuclear factor-kappa B，NF-κB）是1986年從B細(xì)胞核中提取到的核轉(zhuǎn)錄因子，參與多種炎癥細(xì)胞因子及免疫基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄和調(diào)節(jié)。NF-κB在眼內(nèi)新生血管中的研究較少，但已有體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)陸續(xù)報(bào)道該因子參與誘導(dǎo)視網(wǎng)膜新生血管［4］。類固醇合成物是眾所周知的抗新生血管形成的藥物［5-7］。本實(shí)驗(yàn)主要研究玻璃體內(nèi)注射曲安奈德（triamcinolone acetonide，TA）對(duì)CNV的治療效果及機(jī)制，從而為指導(dǎo)臨床研究和治療CNV提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1主要儀器與試劑

TA注射液（40 g/L），批號(hào)H53021604：昆明積大制藥有限公司。小鼠抗大鼠的NF-κB（MAB 0.1m l）：北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。即用型抗生蛋白鏈菌素生物素復(fù)合體（streptavidin-biotincomplex，SABC）試劑盒、0.01mol/L枸櫞酸鹽緩沖液：武漢博士德生物工程有限公司。3-氨基-9-乙基卡巴唑（3-am ino-9-ethylcarbozole，AEC）顯色試劑盒：北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。Novua 2000氪激光機(jī)：美國COHERENT公司。25μl微量進(jìn)樣器：上海安亭微量進(jìn)樣器廠。Image-ProPlus5.1圖像分析系統(tǒng)：美國MEDIA CYBERNETICS公司。

1.1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

36只健康雄性清潔級(jí)棕色挪威（brown Norway，BN）大鼠，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，體質(zhì)量200～220 g。動(dòng)物的使用和管理遵循國家科學(xué)技術(shù)部頒布的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》。

1.2方法

1.2.1CNV模型的建立及動(dòng)物分組

檢查所有大鼠雙眼前節(jié)和眼底，均正常，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為2、4、6周組，每小組6只。選取一眼作為激光光凝眼，另一眼為不光凝正常眼。參照本實(shí)驗(yàn)室CNV造模方法［8］，采用氪激光（647 nm）距視盤等距離圍繞視盤光凝大鼠視網(wǎng)膜。激光參數(shù)：功率360mW，光斑直徑100μm，曝光時(shí)間0.05 s。

1.2.2藥物的應(yīng)用

實(shí)驗(yàn)組全麻狀態(tài)下，1%丁卡因滴眼液表面麻醉后，手術(shù)顯微鏡下，30G針頭顳側(cè)角膜緣后0.5mm作一穿刺口，微量注射器從穿刺口進(jìn)針，約1.5mm深，針尖朝向視神經(jīng)方向，玻璃體中可見針尖，緩緩注入TA 8μl（320μg）。由散大的瞳孔可觀察到玻璃體中TA的白色混懸液體。輕輕拔針后，顯微鑷子輕夾穿刺口片刻，以利穿刺口閉合。

對(duì)照組玻璃體內(nèi)注射同樣容積的等滲平衡鹽溶液（balanced salt solution，BSS）。因注射造成晶體損傷的眼均被排除實(shí)驗(yàn)。

1.2.3組織病理學(xué)檢查

分別在2周、4周、6周時(shí)，深度麻醉下摘除6只大鼠的眼球，蒸餾水沖洗，置于40 g/L多聚甲醛液中固定2 h。按病理組織學(xué)方法梯度酒精脫水、透明、浸蠟、包埋，蠟塊4℃保存?zhèn)溆谩Ｑ矍蚪M織5μm厚度連續(xù)切片，置于50℃的蒸餾水中展片，撈片，置烤箱37℃烤片12 h后，4℃保存。常規(guī)脫蠟，行HE染色。光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。采用Image-Pro Plus 5.1圖像分析軟件計(jì)算400倍光學(xué)顯微鏡下CNV面積。選取每個(gè)眼球連續(xù)切片中含有最大CNV直徑的切片，每個(gè)標(biāo)本測量5張切片，取其平均值。

1.2.4免疫組織化學(xué)法

石蠟切片常規(guī)脫蠟至水；3%H2O2室溫孵育10 m in，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，蒸餾水沖洗，PBS浸泡5m in；切片置于盛有0.01mol/L枸櫞酸鹽緩沖液的抗原修復(fù)盒中，微波中火加熱15min進(jìn)行抗原微波爐熱修復(fù)；滴加封閉用正常山羊血清工作液，室溫孵育15m in；滴加小鼠抗大鼠的NF-κB單克隆抗體（1∶70），4℃過夜，0.01mol/L PBS洗滌；滴加生物素標(biāo)記山羊抗小鼠IgG，室溫孵育15m in，0.01mol/L PBS洗滌；滴加辣根酶標(biāo)記鏈酶卵白素工作液，37℃孵育40m in，0.01mol/L PBS洗滌；滴加AEC，室溫顯色，鏡下控制反應(yīng)時(shí)間3～10m in，蒸餾水充分洗滌；蘇木素輕度襯染10 s，自來水充分水洗，水溶性封片劑封片。用0.01mol/L的PBS取代一抗孵育，作為陰性對(duì)照，以試劑盒提供的大鼠肺腫瘤組織切片作為陽性對(duì)照。切片內(nèi)被染成紅色的點(diǎn)、團(tuán)簇為陽性反應(yīng)物。

1.3圖像分析與數(shù)據(jù)處理

采用Image-Pro Plus 5.1圖像分析軟件計(jì)算400倍光學(xué)顯微鏡下陽性染色區(qū)域積分光密度值（integrated optical density，IOD），選取每個(gè)眼球連續(xù)切片中含有最大CNV直徑的切片，每個(gè)標(biāo)本測量5張切片，取其平均值。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。本研究測量指標(biāo)的數(shù)據(jù)資料經(jīng)Shapiro-Wilk檢驗(yàn)證實(shí)呈正態(tài)分布，以（xˉ±s）表示。組間均數(shù)經(jīng)Levene檢驗(yàn)方差齊。采用完全隨機(jī)分組單因素干預(yù)多水平實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)；組內(nèi)光凝后不同時(shí)間組大鼠CNV面積、NF-κB蛋白表達(dá)差異用單因素方差分析；兩兩比較用SNK檢驗(yàn)；同一時(shí)間內(nèi)的組間比較用Student t檢驗(yàn)。顯著性水平α=0.05。

2　結(jié)果

光凝后6周內(nèi)，對(duì)照組病理組織切片有清晰的新生血管形成，CNV隨時(shí)間增厚，CNV中包含膠原組織和管腔中含有紅細(xì)胞的增殖的血管，炎性細(xì)胞主要是巨噬細(xì)胞的浸潤。實(shí)驗(yàn)組CNV隨時(shí)間呈逐漸增加的趨勢，但纖維血管膜增殖形成不明顯（圖1）?？梢姽饽幰暰W(wǎng)膜外層斷裂，視網(wǎng)膜色素上皮（retinal pigmentepithelium，RPE）和Bruch膜的缺失，少量的紅細(xì)胞、炎性細(xì)胞浸潤在激光斑處，在RPE和Bruch膜的缺失處可見到明顯的鞏膜。

兩組CNV面積均隨著時(shí)間顯著增加（P＜0.001），實(shí)驗(yàn)組顯著小于對(duì)照組（P＜0.001）。兩組NF-κB蛋白表達(dá)均隨時(shí)間顯著升高（P＜0.001），實(shí)驗(yàn)組顯著低于對(duì)照組（P＜0.001）。見表1、表2、圖1、圖2。

表1　兩組CNV面積比較（μm2）

表2　兩組NF-κB表達(dá)（IOD）

圖1　兩組CNV面積的變化（HE染色，400×）

圖2　兩組NF-κB蛋白表達(dá)（免疫組織化學(xué)染色，400×）

3　討論

CNV是許多脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜疾病的最終結(jié)局，可導(dǎo)致不可逆性的中心視力損害。治療CNV的關(guān)鍵在于阻斷其發(fā)展過程，而藥物治療是最有希望阻斷病變發(fā)展進(jìn)程的方法之一［9-12］。早期使用抗血管生成藥物來控制CNV的發(fā)生、發(fā)展逐漸受到重視，皮質(zhì)類固醇就是其中之一。近期，人們開始關(guān)注采用TA玻璃體腔注射治療眼內(nèi)新生血管［13-15］。已有大量臨床或?qū)嶒?yàn)研究發(fā)現(xiàn)TA可抑制視網(wǎng)膜CNV形成［16-18］，但其可能機(jī)制還未知。

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，光凝后即刻玻璃體腔內(nèi)注射TA 8μl可以顯著抑制新生血管形成和發(fā)展。

最近，有臨床資料證實(shí)玻璃體腔內(nèi)注射TA 25mg可以抑制年齡相關(guān)性黃斑變性（age-relatedmacular degeneration，ARMD）患者的新生血管［19-20］，但TA治療CNV的機(jī)制還未知。我們通過免疫組化方法發(fā)現(xiàn)，在CNV生長的6周內(nèi)，NF-κB的表達(dá)也逐漸增強(qiáng)。NF-κB作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控細(xì)胞因子，可能通過多種不同的機(jī)制參與CNV的生長發(fā)展，通過上調(diào)其他細(xì)胞因子的表達(dá)，起始和促進(jìn)CNV的生長。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)NF-κB的活化在激光誘導(dǎo)的CNV模型中起到致炎與致新生血管形成的作用［21］。亦有學(xué)者在激光誘導(dǎo)的CNV模型中，發(fā)現(xiàn)NF-κB的活化可以通過上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶-2（matrixmetallopeptidase-2，MMP-2）表達(dá)而促進(jìn)新生血管形成［22］。已知很多細(xì)胞因子的啟動(dòng)子區(qū)含有NF-κB的結(jié)合位點(diǎn)或識(shí)別位點(diǎn)［23］，而糖皮質(zhì)激素是NF-κB的抑制劑［24-25］。本研究顯示，TA可以降低棕色挪威大鼠激光斑損傷區(qū)中NF-κB的活性，從而影響CNV的生長。

有臨床研究表明，TA除抑制新生血管的生長外，還能夠改善視力。盡管TA玻璃體內(nèi)注射在某些方面還存在一些爭議，但是對(duì)于許多難治性的眼底疾病，如黃斑下CNV、復(fù)發(fā)性CNV，已顯示出一定的優(yōu)越性［26］。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)N-乙酰半胱氨酸（N-acetyl-cysteine，NAC）可以抑制激光誘導(dǎo)的CNV中NF-κB的活化，從而抑制CNV形成［27］。我們發(fā)現(xiàn)，在棕色挪威大鼠CNV模型中激光光凝后即刻玻璃體腔內(nèi)注射TA，可降低NF-κB的蛋白表達(dá)，抑制CNV生長。TA是阻斷CNV病程發(fā)展的理想藥物，并且可能是通過降低NF-κB活性而發(fā)揮作用。

本實(shí)驗(yàn)僅在光凝后即刻玻璃體內(nèi)注射TA來干預(yù)CNV形成，對(duì)于CNV形成之后，TA對(duì)CNV的作用尚需要進(jìn)一步研究。

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Effectsof Triam cinoloneAcetonide on ChoroidalNeovascularization in Brown Norway Rats

GAO Xiɑo-yɑn，HEShou-zhi
1.Department of Ophthalmology，North China University of Technology Community Health Service Center，Beijing 100144，China；2.Departmentof Ophthalmology，General Hospital of PLA，PLA Eye Center，Beijing 100853，China
Correspondence to GAO Xiɑo-yɑn.E-mail：gaoxy76@sina.com

Objective To observe the effect of intravitreal triamcinolone acetonide injection on choroidal neovascularization in brown Norway rats. Methods Thirty-six healthy brown Norway ratswere divided random ly into controlgroup（n=18）and experimental group（n= 18），while one eyewas chosen random ly asexperimentaleye.The choroidalneovascularizationmodelwasestablishied，while 8μl triamcinolone acetonidewas injected in vitreous body immediately after photocoagulation in the experimental group，and the same volume isotonic balanced salt solution was injected in the controlgroup.The eyes of six ratswere enucleated for histological slices in the second，forth，and sixth week，respectively.The expression of nuclear factor-kappa B was detected with immunohistochem icalmethod，and themax area of choroidalneovascularization was alsomeasured.Results The area of choroidalneovascularization was smaller，and the expression of nuclear factor-kappa B was lower in the experimental group than in the control group（t＞7.450，P＜0.001）.Conclusion Triamcinolone acetonide could effectively inhibit the development of choroidal neovascularization，and decrease the expression of nuclear factor-kappa B in brown Norway rats.

triamcinolone acetonide；nuclear factor-kappa B；choroidalneovascularization；brown Norway rats

10.3969/j.issn.1006-9771.2016.10.009

R773.4

A

1006-9771（2016）10-1154-05

1.北方工業(yè)大學(xué)社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心眼科，北京市100144；2.中國人民解放軍總醫(yī)院眼科，全軍眼科中心，北京市100853。作者簡介：高小燕（1976-），女，山東青島市人，漢族，博士，副主任醫(yī)師，主要研究方向：眼底病。E-mail：gaoxy76@sina.com。

（2016-04-22

2016-06-03）