王麗紅　劉曉麗

摘要：建立消炎止靈片的微生物限度方法。按《中國藥典》2010年版微生物限度檢查法進(jìn)行驗證和試驗。經(jīng)方法學(xué)驗證試驗得出的檢查方法可用于獨一味顆粒的微生物限度檢查。

關(guān)鍵詞：消炎止靈片；微生物限度檢查；方法學(xué)驗證

中藥口服制劑容易受到微生物的污染，因此微生物限度檢查是《中國藥典》2010年版一部中藥丸劑必檢項目，是微生物污染狀況控制的重要指標(biāo)。當(dāng)建立的微生物限度檢查法時，應(yīng)進(jìn)行方法學(xué)驗證，以確定所采用的方法是否適合該產(chǎn)品，使檢驗結(jié)果更具有有效性。因此本文通過對遼寧朝陽龍城制藥廠提供的消炎止靈片不同批次進(jìn)行了微生物限度檢查法的驗證，從而確定了該品種的微生物限度檢查法。

1儀器與材料

1.1儀器 生物安全柜（BHC-1300ⅡA2），生化培養(yǎng)箱（SHP-150），隔水培養(yǎng)箱（JC303-3B ）。

1.2培養(yǎng)基和稀釋液 營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、改良馬丁培養(yǎng)基、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基、膽鹽乳糖培養(yǎng)基、4-甲基傘形酮葡糖苷酸培養(yǎng)基（MUG）。稀釋液：pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，按要求配制，滅菌。

1.3菌種 大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌和黑曲霉均由中國藥品生物制品檢定所提供。

2方法

2.1菌液制備菌液制備 接種大腸埃希菌、金色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，30～35℃培養(yǎng)18～24h；接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基中，23～28℃培養(yǎng)24～48h。上述培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌數(shù)50～100cfu的菌懸液。接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基上，23～28℃培養(yǎng)5～7d，加入3～5ml含0.05%（ml/ml） 聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然后，用適宜方法吸出孢子懸液至無菌試管中，用含0.05%（ml/ml） 聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml含孢子數(shù)50～100cfu的孢子懸液。

菌懸液制備后，若在室溫下放置應(yīng)在2h內(nèi)使用，若保存在2～8℃的菌懸液可以在24h內(nèi)使用。黑曲霉菌的孢子懸液保存在2～8℃，可在存儲期內(nèi)替代對應(yīng)量的新鮮孢子懸液使用。

2.2供試液制備 取10g，加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液100ml，振搖，制成1：10的供試液。取1：10的供試液1ml，加入pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液9ml，即為1：100的供試夜；取1：100的供試液1ml，加入pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液9ml，即為1：1000的供試夜。

2.3細(xì)菌、霉菌和酵母菌計數(shù)的驗證實驗 驗證試驗分4組，進(jìn)行3次獨立的平行試驗，并分別計算試驗組的菌數(shù)回收率和稀釋劑對照組的菌數(shù)回收率。

2.3.1供試液制備 依據(jù)《中國藥典》2010年版一部附錄"微生物限度檢查法"中供試液制備法：取本品10g，加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml，作為1：10的供試液。①試驗組 分別取1：10供試液1ml采用薄膜過濾法，加至100mlpH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液中，混勻，全量通過濾膜后，以pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗濾膜（約100ml/次，沖洗3次），分別加入50～100cfu試驗菌懸液，待其通過濾膜，再加入50mlpH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗內(nèi)壁，取膜貼至營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平皿中，每株試驗菌平行制備2個平皿。②菌液組：取上述制備的菌液，照上述方法，測定所加的試驗菌數(shù)。③供試品對照組：取1：10供試液1ml，采用薄膜過濾法加至100mlpH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液中，混勻，全量通過濾膜后，以pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗濾膜（約100ml/次，沖洗3次），取膜貼至營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平皿中。④稀釋劑對照組：取稀釋液1ml和50～100cfu試驗菌，按薄膜過濾法測定其菌數(shù)。⑤常規(guī)法檢查白色念珠菌、黑曲霉。

測試結(jié)果見表1：

由表1數(shù)據(jù)可知， 在3次獨立的平行試驗中，稀釋劑對照組的菌數(shù)回收率均大于70%，試驗組的菌數(shù)回收率也均大于70%，證明照該供試液制備方法和計數(shù)法測定供試品的細(xì)菌、霉菌和酵母菌數(shù)方法可行。

所以，消炎止靈片的細(xì)菌計數(shù)可以采用薄膜過濾法，霉菌和酵母菌采用常規(guī)法檢查。

2.4 控制菌檢查方法驗證 陽性對照組檢出試驗菌，陰性對照組沒有菌生長，試驗組檢出試驗菌，所以消炎止靈片的控制菌檢測方法可以按此供試液制備法和控制菌檢查法進(jìn)行供試品的控制菌檢查。。

3結(jié)論

3.1細(xì)菌計數(shù)方法可采用薄膜過濾法測定，消除甲氧芐啶的抑菌性，霉菌和酵母菌計數(shù)方法采用常規(guī)平皿法測定。

3.2大腸埃希菌、大腸菌群按常規(guī)法進(jìn)行控制菌檢查。

3.3注意不同的培養(yǎng)時間對樣品細(xì)菌總數(shù)計數(shù)結(jié)果的影響 樣品經(jīng)24h培養(yǎng)后，有的菌落很小，容易漏掉，培養(yǎng)48h后，菌落不但變大，而且還有很多新生長出來的菌落，培養(yǎng)72h后，菌落數(shù)增加不多，但菌落明顯變大，而且混雜的霉菌生長旺盛，影響結(jié)果的觀察計數(shù)。同時這也是一些樣品經(jīng)72h培養(yǎng)后細(xì)菌總數(shù)技術(shù)有明顯增加的一個原因。培養(yǎng)24h和培養(yǎng)48h計數(shù)結(jié)果有明顯差異，所以在規(guī)定的培養(yǎng)環(huán)境下，應(yīng)嚴(yán)格遵守培養(yǎng)時間，以便真實的反映出樣品中細(xì)菌總數(shù)的水平。

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編輯/孫杰