諸琴紅

[摘要] 目的 探討銅綠假單胞菌對喹諾酮類藥物耐藥性情況。 方法 采集2014年1月～2015年2月于德清縣第三人民醫(yī)院住院的3000例患者痰液、膿汁標本，按常規(guī)方法分離銅綠假單胞菌，從中選擇30株銅綠假單胞菌喹諾酮耐藥菌株進行試驗。選擇銅綠假單胞菌野生型標準株作為對照。通過聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態(tài)性分析（PCR-RFLP）進行gyrA、gyrB、parC和parE基因QRDR氨基酸變化結(jié)果分析。 結(jié)果 30株銅綠假單胞菌喹諾酮耐藥菌株中有3株沒有發(fā)生Ⅱ類拓樸異構(gòu)酶基因突變，其余均發(fā)生基因突變，突變率達到90%?；蛲蛔冎饕性趃yrA編碼的83位密碼子、parC的80位密碼子。 結(jié)論 探討銅綠假單胞菌Ⅱ類拓撲異構(gòu)酶基因突變特點，對突變株進行藥物敏感試驗，可以為臨床合理用藥提供可靠的理論依據(jù)。

[關鍵詞] 銅綠假單胞菌；喹諾酮類藥物；耐藥性

[中圖分類號] R378.991 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2016）02（a）-0117-04

Discuss of tolerance of Pseudomonas aeruginosa to quinolone drugs

ZHU Qinhong

Department of Laboratory， the Third People's Hospital of Deqing County， Zhejiang Province， Deqing 313201， China

[Abstract] Objective To discuss the tolerance of Pseudomonas aeruginosa to quinolone drugs. Methods The specimens of sputum and pus from 3000 cases inpatients in the Third People's Hospital of Deqing County from January 2014 to February 2015 were collected， Pseudomonas aeruginosa was separated by conventional method. 30 plants of Pseudomonas aeruginosa quinolone resistant strains were selected for experiment. The wild type standard strains of Pseudomonas aeruginosa was selected as control. The QRDR amino acid changing result of gyrA， gyrB， parC and parE genes were analyzed by PCR-RFLP. Results 3 plants had no mutation of Ⅱ type topology isomerase gene among 30 plants of Pseudomonas aeruginosa quinolone resistant strains， the other plants had gene mutation， the mutation rate was 90%. The gene mutation mainly focused on 83 codon of gyrA coding， 80 codon of parC. Conclusion Discuss of characteristics of Ⅱ type topology isomerase gene mutation， test of drug sensitive for mutant strain， can provide reliable theory basis for clinical rational drug use.

[Key words] Pseudomonas aeruginosa； Quinolone drugs； Tolerance

銅綠假單胞菌是醫(yī)院感染常見的致病菌之一，在重癥肺炎或者下呼吸道感染患者中檢出率比較高，對于病情有不利影響[1-2]。一般情況下，銅綠假單胞菌感染治療無效的主要原因是銅綠假單胞菌產(chǎn)生耐藥性，如果患者出現(xiàn)多種耐藥情況，會造成治療難度增加。銅綠假單胞菌耐藥機制比較復雜，其中包括DNA拓樸異構(gòu)酶突變、主動外排系統(tǒng)、產(chǎn)生β內(nèi)酰胺酶及氨基糖苷修飾酶等。一直以來喹諾酮類耐藥作用的靶點主要集中在DNA拓撲異構(gòu)酶Ⅱ和Ⅳ，其中DNA拓撲異構(gòu)酶Ⅱ包括GyrA和GyrB兩個亞基，其主要通過gyrA和gyrB基因進行編碼，而DNA拓撲異構(gòu)酶Ⅳ則是通過parC和parE基因進行編碼。長期以來對于銅綠假單胞菌耐藥性的研究比較多，但是關于銅綠假單胞菌對于喹諾酮類藥物耐藥性相關機制的研究卻相對較少[3-4]。本研究通過對銅綠假單胞菌耐藥情況進行觀察，擬分析其對喹諾酮類藥物耐藥性的機制，尤其探討了DNA拓撲異構(gòu)酶基因突變情況，現(xiàn)將結(jié)果報道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料

2014年1月～2015年2月采集于德清縣第三人民醫(yī)院住院的3000例患者痰液、膿汁標本，按常規(guī)方法分離銅綠假單胞菌，從中選擇30株喹諾酮耐藥菌株進行試驗。選擇銅綠假單胞菌野生型標準株ATCC27853作為對照。

1.2 方法

1.2.1 銅綠假單胞菌DNA提取

將單一菌落在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，離心收集菌體，采用細菌DNA提取試劑盒提取銅綠假單胞菌DNA，采用0.5%瓊脂糖凝膠電泳，通過紫外燈光觀察結(jié)果[5-6]。

1.2.2 PCR引物設計及DNA擴增

1.2.2.1 Ⅱ類拓樸異構(gòu)酶基因片段的PCR引物設計 gyrA：gyrA1：5'-GGC CTG AAG CCG GTG CAC-3'，gyrA2：5'-CAC GGC GAT ACC GCT GGA-3'；gyrB：gyrB1：5'-GCG GTG GAA CAG GAG ATG GGC AAG TAC-3'，gyrB2：5'-CTG GGG GAA GAA GAA GGT CAA CAG CAC GGT-3'；parC：parC1：5'-CTG GAT GCC GAT TCC AAG CAC-3'，parC2： 5'-GAA GGA CTT GGG ATC GTC CGG-3'；parE：parE1：5'-CGG CGT TCG TCT CGG GCG TGG TGA AGG-3'，parE2：5'-TCG AGG GCG TAG TAG ATG TCC TTG CCG-3'。

1.2.2.2 PCR擴增條件建立 反應體系為50 μL，5 μL 10×Ex Taq buffer+27 μL ddH2O，一對引物各3 μL，5 μL 4×DNTP，4 μL MgCl2，1 μL Taq聚合酶，2 μL銅綠假單胞菌DNA模板。擴增條件為94℃進行預變性4 min；循環(huán)參數(shù)：94℃變性4 min，72℃延伸1 min，退火，gyrA和parC退火溫度為62℃，30 s，gyrB和parE退火溫度為67℃，30 s，循環(huán)35次；末次循環(huán)為72℃延伸7 min。

1.2.2.3 PCR產(chǎn)物鑒定 選取5 μL PCR擴增后產(chǎn)物+1 μL緩沖液，1.5%瓊脂糖凝膠電泳，90 V，電泳40 min，通過紫外成像系統(tǒng)進行觀察。其中，gyrA基因擴增產(chǎn)物為418 bp片段，483 bp片段為gyrB基因擴增產(chǎn)物，186 bp片段為parC基因擴增產(chǎn)物，324 bp片段為parE基因擴增產(chǎn)物。

1.2.2.4 PCR擴增產(chǎn)物多態(tài)性測定 通過PCR擴增產(chǎn)物限制性片段多態(tài)性分析（PCR-RFLP）反應混合物20 μL+10×T Buffer 2 μL+2 μL 0.1%BSA+3 μL PCR擴增產(chǎn)物+12 μL ddH2O，37℃保溫4 h，3%低熔點瓊脂糖電泳，采用紫外成像系統(tǒng)進行觀察和分析[7-8]。

1.2.3 MIC測定

將銅綠假單胞菌ATCC27853作為標準株，在M-H肉湯中接種菌株，38℃培養(yǎng)24 h，然后在含有不同藥物濃度的M-H肉湯中接種細菌，注意調(diào)整細菌濃度為（2～5）×105 cfu/mL，將細菌沒有生長的最低藥物濃度作為最小抑菌濃度（MIC）。參照CLSI推薦標準，銅綠假單胞菌對抗菌藥物藥敏臨界點設置：諾氟沙星（NOR）≤4 mg/L、環(huán)丙沙星（CIP）≤1 mg/L、左氧氟沙星（LVX）≤2 mg/L、頭孢唑啉（CAZ）≤8 mg/L、氟氯西林（PIP）≤64 mg/L、亞胺培南（IMP）≤4 mg/L。

1.3 觀察指標

①30株銅綠假單胞菌耐藥株gyrA、gyrB、parC和parE基因喹諾酮耐藥決定區(qū)（QRDR）氨基酸變化情況；②喹諾酮和β-內(nèi)酰胺類抗生素對Ⅱ類拓樸異構(gòu)酶基因突變株體外抗菌活性情況。

2 結(jié)果

2.1 30株銅綠假單胞菌耐藥株gyrA、gyrB、parC和parE基因QRDR氨基酸變化情況

有3株銅綠假單胞菌耐藥株沒有發(fā)生Ⅱ類拓樸異構(gòu)酶基因突變，其余均發(fā)生基因突變，突變率達到90%；基因突變主要集中在gyrA編碼的83位密碼子、parC的80位密碼子。見表1。

表1 30株銅綠假單胞菌耐藥株gyrA、gyrB、parC和parE基因QRDR氨基酸變化情況

注：Thr：蘇氨酸；Asp：天冬氨酸；Ser：絲氨酸；Glu：谷氨酸；Ala：丙氨酸；Ile：異亮氨酸；Asn：天冬酰胺；Gly：甘氨酸；Phe：苯丙氨酸；Leu：亮氨酸；Lys：精氨酸；Val：纈氨酸；“-”表示沒有發(fā)生基因突變

2.2 喹諾酮和β-內(nèi)酰胺類抗生素對Ⅱ類拓樸異構(gòu)酶基因突變株體外抗菌活性情況

諾氟沙星、環(huán)丙沙星耐藥率最高，其次是左氧氟沙星，其他依次是哌拉西林、頭孢他啶、亞胺培南。見表2。

表2 喹諾酮和β-內(nèi)酰胺類抗生素對Ⅱ類拓樸異構(gòu)酶基因突變株

體外抗菌活性情況

注：MIC：最小抑菌濃度；“-”表示無數(shù)據(jù)

3 討論

喹諾酮類藥物抗菌機制主要是對細菌DNA復制進行阻斷，具有很高的選擇性，安全性較好[9-10]。銅綠假單胞菌對喹諾酮類藥物的耐藥性與DNA拓撲異構(gòu)酶Ⅱ、Ⅳ有密切關系。DNA拓撲異構(gòu)酶Ⅱ分別由gyrA和gyrB基因進行編碼，拓樸異構(gòu)酶Ⅳ通過parC和parE基因編碼[11-12]。銅綠假單胞菌gyrA基因QRDR的PCR擴增產(chǎn)物酶切之后可以獲得141 bp和277 bp兩個酶切片段[13-14]。如果銅綠假單胞菌喹諾酮類藥物突變株gyrA基因第83位氨基酸密碼子出現(xiàn)突變，酶切位點消失，不需要再被酶切，通過PCR-RFLP進行分析，突變株只有1個沒有被酶切的片段。本研究結(jié)果中gyrA基因第83位氨基酸密碼子出現(xiàn)突變株，有1個沒有被酶切的片段產(chǎn)物，此結(jié)果和以往研究基本一致[15-16]。提示通過PCR擴增gyrA基因的QRDR，進行酶切后，可以對gyrA基因第83位氨基酸密碼子點突變情況進行檢測，如果發(fā)生點突變則可以證明為銅綠假單胞菌喹諾酮類耐藥株。

本研究還對銅綠假單胞菌喹諾酮類藥物耐藥株Ⅱ類拓樸異構(gòu)酶gyrA、gyrB、parC和parE基因QRDR基因片段進行分析，在耐藥株中，絕大部分的Ⅱ類拓撲異構(gòu)基因QRDR發(fā)生突變，其突變主要集中在gyrA基因和parC基因中，其中，gyrA基因編碼第83位氨基酸密碼子，出現(xiàn)高頻率的基因突變，Thr-83變?yōu)镮le，即ACC變?yōu)锳TC，但是第87位氨基酸密碼子和第83位氨基酸密碼子發(fā)生雙突變的頻率較低[17-18]。說明銅綠假單胞菌喹諾酮類藥物耐藥主要與gyrA中的第83位氨基酸密碼子發(fā)生變異有關。本研究采集3000例住院患者的痰液、膿汁標本，按常規(guī)方法分離銅綠假單胞菌，從中選擇30株喹諾酮耐藥菌株進行試驗。選擇銅綠假單胞菌野生型標準株ATCC27853作為對照。通過PCR-RFLP進行分析，結(jié)果表明，有3株銅綠假單胞菌耐藥株沒有發(fā)生Ⅱ類拓樸異構(gòu)酶基因突變，其余均發(fā)生率基因突變，突變率達到90%，此結(jié)果和以往研究基本一致[17-18]；基因突變主要集中在gyrA編碼的83位密碼子、parC的80位密碼子，提示gyrA和parC基因突變是銅綠假單胞菌對于喹諾酮類藥物耐藥的主要機制。有資料顯示，銅綠假單胞菌Ⅱ類拓樸異構(gòu)酶二級結(jié)構(gòu)和疏水性發(fā)生變化可能是引起耐藥的物質(zhì)基礎。銅綠假單胞菌Ⅱ類拓樸異構(gòu)酶基因發(fā)生兩個或者兩個以上突變株對于絕大多數(shù)喹諾酮類藥物呈現(xiàn)較高水平的耐藥性[19-20]。本研究中耐藥變異株對諾氟沙星、環(huán)丙沙星100%耐藥，耐藥率均高于左氧氟沙星、哌拉西林、頭孢他啶、亞胺培南，提示諾氟沙星、環(huán)丙沙星的大量應用可能是臨床上引起喹諾酮類藥物耐藥的因素之一。通過上述研究進一步表明，銅綠假單胞菌變異株對于喹諾酮類耐藥是由于DNA拓撲異構(gòu)酶的作用靶點發(fā)生不同程度的變化，其中主要為編碼DNA拓樸異構(gòu)酶Ⅱ的gyrA基因和編碼DNA拓樸異構(gòu)酶Ⅳ中的parC基因的耐藥決定區(qū)發(fā)生基因突變，促使喹諾酮類藥物和銅綠假單胞菌無法正常結(jié)合，從而影響了藥物的作用效果，造成耐藥性的形成。另外，臨床上大量應用敏感度不高的藥物也增加了銅綠假單胞菌耐藥性的發(fā)生率。

綜上所述，探討銅綠假單胞菌Ⅱ類拓撲異構(gòu)酶基因突變特點，對突變株進行藥物敏感試驗，可以為臨床合理用藥提供可靠的理論依據(jù)。

[參考文獻]

[1] 明德松，鄧勇.國內(nèi)銅綠假單胞菌對喹諾酮類藥物耐藥機制的Meta分析[J].中國循證醫(yī)學雜志，2013，13（10）：1215-1218.

[2] Lee JK，Lee YS，Park YK，et al. Alterations in the GyrA and GyrB subunits of topoisomerase and the ParC and ParE subunits of topoisomerase in cipro oxacinresistant clinical isolates of pseudomonas aeruginosa [J]. Int J Antimicrob Agents，2005，25（4）：290-295.

[3] 張國棟，曾章銳，王瑩，等.gyrA、gyrB和外排系統(tǒng)共同介導銅綠假單胞菌對喹諾酮類耐藥機制研究[J].中國感染與化療雜志，2014，14（3）：224-227.

[4] Murugan K，Selvanayaki K，Al-Sohaibani S. Antibiofilm activity of Andrographis paniculata against cystic fibrosis clinical isolate Pseudomonas aeruginosa [J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology，2011，27（7）：1661-1668.

[5] 白羽，劉金輝，李清祥，等.銅綠假單胞菌對喹諾酮類藥物耐藥機制的研究[J].中國病原生物學雜志，2014，9（11）：1036-1040.

[6] Krishnan T，Yin WF，Chan KG. Inhibition of Quorum Sensing-Controlled Virulence Factor Production in Pseudomonas aeruginosa PAOl by Ayurveda Spice Clove（Syzygium Aromaticum）Bud Extract [J]. Sensors，2012，12（4）：4016-4030.

[7] 陳樹林，陳利達，陳茶，等.銅綠假單胞菌對喹諾酮類藥物耐藥的分子機制研究[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志，2012，22（4）：899-903.

[8] Yang L，Rybtke MT，Jakobsen TH，et al. Computer-aided identification of recognized drugs as Pseudomonas aeruginosa quorum-sensing inhibitors [J]. Antimicrobial Agents and Chemotherapy，2009，53（6）：2432-2443.

[9] 劉文廣，戴路明.銅綠假單胞菌對喹諾酮類抗菌藥物的耐藥機制[J].醫(yī)學綜述，2012，18（11）：1650-1652.

[10] Femandez-Pifiar R，Camara M，Dubern JF，et al. The Pseudomonas aeruginosa quinolone quorum sensing signal alters the multicellular behaviour of Pseudomonas putida KT2440 [J]. Research in Microbiology，2011，162（8）：773-781.

[11] 揣國帥，劉新，王嵐，等.銅綠假單胞菌生物膜對喹諾酮類抗生素耐藥作用研究[J].中國病原生物學雜志，2012， 7（9）：672-674.

[12] Petrova OE，Sauer K，Sag S. Contributes to the motile-sessile switch and acts in concert with BfiSR to enable Pseudomonas aeruginosa biofilm formation [J]. Journal of Bacteriology，2011，193（23）：6614-6628.

[13] 蔣月婷，黃松音，吳愛武，等.耐喹諾酮類銅綠假單胞菌的耐藥機制研究[J].熱帶醫(yī)學雜志，2010，10（7）：781-783.

[14] Baer M，Sawa T，F(xiàn)lynn P，et al. An engineered human antibody fab fragment specific for Pseudomonas aeruginosa PcrV antigen has potent antibacterial activity [J]. Infection and Immunity，2009，77（3）：1083-1090.

[15] 李梅，潘發(fā)憤，周鐵麗，等.多藥耐藥銅綠假單胞菌感染的危險因素分析[J].中華醫(yī)院感染學雜志，2011，21（8）：1593-1595.

[16] Tashiro Y，Ichikawa S，Nakajima-Kambe T，et al. Pseudomonas quinolone signal affects membrane vesicle production in not only Gram-negative but also Gram-positive bacteria [J]. Microbes and Environments，2008，25（2）：120-125.

[17] 史天陸，蘇丹，王法財，等.臨床藥師參與膽道術后伴發(fā)多藥耐藥銅綠假單胞菌感染的藥學監(jiān)護[J].中華醫(yī)院感染學雜志，2012，22（10）：2177-2179.

[18] Yu S，Jensen V，Seeliger J，et al. Structure elucidation and preliminary assessment of hydrolase activity of PqsE，the Pseudomonas quinolone signal（PQS）response protein [J]. Biochemistry，2009，48（43）：10298-10307.

[19] 孫茜，王鵬華，褚月頡，等.銅綠假單胞菌感染的糖尿病足患者臨床及耐藥特點分析[J].中華內(nèi)分泌代謝雜志，2012，28（10）：817-820.

[20] D'Argenio DA，Wu M，Hoffman LR，et al. Growth phenotypes of Pseudomonas aeruginosa lasR mutants adapted to the airways of cystic fibrosis patients [J]. Molecular Microbiology，2007，64（2）：512-533.

（收稿日期：2015-11-05 本文編輯：程 銘）