諸琴紅

[摘要] 目的 探討銅綠假單胞菌對(duì)喹諾酮類藥物耐藥性情況。 方法 采集2014年1月～2015年2月于德清縣第三人民醫(yī)院住院的3000例患者痰液、膿汁標(biāo)本，按常規(guī)方法分離銅綠假單胞菌，從中選擇30株銅綠假單胞菌喹諾酮耐藥菌株進(jìn)行試驗(yàn)。選擇銅綠假單胞菌野生型標(biāo)準(zhǔn)株作為對(duì)照。通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析（PCR-RFLP）進(jìn)行g(shù)yrA、gyrB、parC和parE基因QRDR氨基酸變化結(jié)果分析。 結(jié)果 30株銅綠假單胞菌喹諾酮耐藥菌株中有3株沒(méi)有發(fā)生Ⅱ類拓樸異構(gòu)酶基因突變，其余均發(fā)生基因突變，突變率達(dá)到90%?；蛲蛔冎饕性趃yrA編碼的83位密碼子、parC的80位密碼子。 結(jié)論 探討銅綠假單胞菌Ⅱ類拓?fù)洚悩?gòu)酶基因突變特點(diǎn)，對(duì)突變株進(jìn)行藥物敏感試驗(yàn)，可以為臨床合理用藥提供可靠的理論依據(jù)。

[關(guān)鍵詞] 銅綠假單胞菌；喹諾酮類藥物；耐藥性

[中圖分類號(hào)] R378.991 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2016）02（a）-0117-04

Discuss of tolerance of Pseudomonas aeruginosa to quinolone drugs

ZHU Qinhong

Department of Laboratory， the Third People's Hospital of Deqing County， Zhejiang Province， Deqing 313201， China

[Abstract] Objective To discuss the tolerance of Pseudomonas aeruginosa to quinolone drugs. Methods The specimens of sputum and pus from 3000 cases inpatients in the Third People's Hospital of Deqing County from January 2014 to February 2015 were collected， Pseudomonas aeruginosa was separated by conventional method. 30 plants of Pseudomonas aeruginosa quinolone resistant strains were selected for experiment. The wild type standard strains of Pseudomonas aeruginosa was selected as control. The QRDR amino acid changing result of gyrA， gyrB， parC and parE genes were analyzed by PCR-RFLP. Results 3 plants had no mutation of Ⅱ type topology isomerase gene among 30 plants of Pseudomonas aeruginosa quinolone resistant strains， the other plants had gene mutation， the mutation rate was 90%. The gene mutation mainly focused on 83 codon of gyrA coding， 80 codon of parC. Conclusion Discuss of characteristics of Ⅱ type topology isomerase gene mutation， test of drug sensitive for mutant strain， can provide reliable theory basis for clinical rational drug use.

[Key words] Pseudomonas aeruginosa； Quinolone drugs； Tolerance

銅綠假單胞菌是醫(yī)院感染常見(jiàn)的致病菌之一，在重癥肺炎或者下呼吸道感染患者中檢出率比較高，對(duì)于病情有不利影響[1-2]。一般情況下，銅綠假單胞菌感染治療無(wú)效的主要原因是銅綠假單胞菌產(chǎn)生耐藥性，如果患者出現(xiàn)多種耐藥情況，會(huì)造成治療難度增加。銅綠假單胞菌耐藥機(jī)制比較復(fù)雜，其中包括DNA拓樸異構(gòu)酶突變、主動(dòng)外排系統(tǒng)、產(chǎn)生β內(nèi)酰胺酶及氨基糖苷修飾酶等。一直以來(lái)喹諾酮類耐藥作用的靶點(diǎn)主要集中在DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ和Ⅳ，其中DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ包括GyrA和GyrB兩個(gè)亞基，其主要通過(guò)gyrA和gyrB基因進(jìn)行編碼，而DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ則是通過(guò)parC和parE基因進(jìn)行編碼。長(zhǎng)期以來(lái)對(duì)于銅綠假單胞菌耐藥性的研究比較多，但是關(guān)于銅綠假單胞菌對(duì)于喹諾酮類藥物耐藥性相關(guān)機(jī)制的研究卻相對(duì)較少[3-4]。本研究通過(guò)對(duì)銅綠假單胞菌耐藥情況進(jìn)行觀察，擬分析其對(duì)喹諾酮類藥物耐藥性的機(jī)制，尤其探討了DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶基因突變情況，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料

2014年1月～2015年2月采集于德清縣第三人民醫(yī)院住院的3000例患者痰液、膿汁標(biāo)本，按常規(guī)方法分離銅綠假單胞菌，從中選擇30株喹諾酮耐藥菌株進(jìn)行試驗(yàn)。選擇銅綠假單胞菌野生型標(biāo)準(zhǔn)株ATCC27853作為對(duì)照。

1.2 方法

1.2.1 銅綠假單胞菌DNA提取

將單一菌落在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，離心收集菌體，采用細(xì)菌DNA提取試劑盒提取銅綠假單胞菌DNA，采用0.5%瓊脂糖凝膠電泳，通過(guò)紫外燈光觀察結(jié)果[5-6]。

1.2.2 PCR引物設(shè)計(jì)及DNA擴(kuò)增

1.2.2.1 Ⅱ類拓樸異構(gòu)酶基因片段的PCR引物設(shè)計(jì) gyrA：gyrA1：5'-GGC CTG AAG CCG GTG CAC-3'，gyrA2：5'-CAC GGC GAT ACC GCT GGA-3'；gyrB：gyrB1：5'-GCG GTG GAA CAG GAG ATG GGC AAG TAC-3'，gyrB2：5'-CTG GGG GAA GAA GAA GGT CAA CAG CAC GGT-3'；parC：parC1：5'-CTG GAT GCC GAT TCC AAG CAC-3'，parC2： 5'-GAA GGA CTT GGG ATC GTC CGG-3'；parE：parE1：5'-CGG CGT TCG TCT CGG GCG TGG TGA AGG-3'，parE2：5'-TCG AGG GCG TAG TAG ATG TCC TTG CCG-3'。

1.2.2.2 PCR擴(kuò)增條件建立 反應(yīng)體系為50 μL，5 μL 10×Ex Taq buffer+27 μL ddH2O，一對(duì)引物各3 μL，5 μL 4×DNTP，4 μL MgCl2，1 μL Taq聚合酶，2 μL銅綠假單胞菌DNA模板。擴(kuò)增條件為94℃進(jìn)行預(yù)變性4 min；循環(huán)參數(shù)：94℃變性4 min，72℃延伸1 min，退火，gyrA和parC退火溫度為62℃，30 s，gyrB和parE退火溫度為67℃，30 s，循環(huán)35次；末次循環(huán)為72℃延伸7 min。

1.2.2.3 PCR產(chǎn)物鑒定 選取5 μL PCR擴(kuò)增后產(chǎn)物+1 μL緩沖液，1.5%瓊脂糖凝膠電泳，90 V，電泳40 min，通過(guò)紫外成像系統(tǒng)進(jìn)行觀察。其中，gyrA基因擴(kuò)增產(chǎn)物為418 bp片段，483 bp片段為gyrB基因擴(kuò)增產(chǎn)物，186 bp片段為parC基因擴(kuò)增產(chǎn)物，324 bp片段為parE基因擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.2.2.4 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物多態(tài)性測(cè)定 通過(guò)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物限制性片段多態(tài)性分析（PCR-RFLP）反應(yīng)混合物20 μL+10×T Buffer 2 μL+2 μL 0.1%BSA+3 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物+12 μL ddH2O，37℃保溫4 h，3%低熔點(diǎn)瓊脂糖電泳，采用紫外成像系統(tǒng)進(jìn)行觀察和分析[7-8]。

1.2.3 MIC測(cè)定

將銅綠假單胞菌ATCC27853作為標(biāo)準(zhǔn)株，在M-H肉湯中接種菌株，38℃培養(yǎng)24 h，然后在含有不同藥物濃度的M-H肉湯中接種細(xì)菌，注意調(diào)整細(xì)菌濃度為（2～5）×105 cfu/mL，將細(xì)菌沒(méi)有生長(zhǎng)的最低藥物濃度作為最小抑菌濃度（MIC）。參照CLSI推薦標(biāo)準(zhǔn)，銅綠假單胞菌對(duì)抗菌藥物藥敏臨界點(diǎn)設(shè)置：諾氟沙星（NOR）≤4 mg/L、環(huán)丙沙星（CIP）≤1 mg/L、左氧氟沙星（LVX）≤2 mg/L、頭孢唑啉（CAZ）≤8 mg/L、氟氯西林（PIP）≤64 mg/L、亞胺培南（IMP）≤4 mg/L。

1.3 觀察指標(biāo)

①30株銅綠假單胞菌耐藥株gyrA、gyrB、parC和parE基因喹諾酮耐藥決定區(qū)（QRDR）氨基酸變化情況；②喹諾酮和β-內(nèi)酰胺類抗生素對(duì)Ⅱ類拓樸異構(gòu)酶基因突變株體外抗菌活性情況。

2 結(jié)果

2.1 30株銅綠假單胞菌耐藥株gyrA、gyrB、parC和parE基因QRDR氨基酸變化情況

有3株銅綠假單胞菌耐藥株沒(méi)有發(fā)生Ⅱ類拓樸異構(gòu)酶基因突變，其余均發(fā)生基因突變，突變率達(dá)到90%；基因突變主要集中在gyrA編碼的83位密碼子、parC的80位密碼子。見(jiàn)表1。

表1 30株銅綠假單胞菌耐藥株gyrA、gyrB、parC和parE基因QRDR氨基酸變化情況

注：Thr：蘇氨酸；Asp：天冬氨酸；Ser：絲氨酸；Glu：谷氨酸；Ala：丙氨酸；Ile：異亮氨酸；Asn：天冬酰胺；Gly：甘氨酸；Phe：苯丙氨酸；Leu：亮氨酸；Lys：精氨酸；Val：纈氨酸；“-”表示沒(méi)有發(fā)生基因突變

2.2 喹諾酮和β-內(nèi)酰胺類抗生素對(duì)Ⅱ類拓樸異構(gòu)酶基因突變株體外抗菌活性情況

諾氟沙星、環(huán)丙沙星耐藥率最高，其次是左氧氟沙星，其他依次是哌拉西林、頭孢他啶、亞胺培南。見(jiàn)表2。

表2 喹諾酮和β-內(nèi)酰胺類抗生素對(duì)Ⅱ類拓樸異構(gòu)酶基因突變株

體外抗菌活性情況

注：MIC：最小抑菌濃度；“-”表示無(wú)數(shù)據(jù)

3 討論

喹諾酮類藥物抗菌機(jī)制主要是對(duì)細(xì)菌DNA復(fù)制進(jìn)行阻斷，具有很高的選擇性，安全性較好[9-10]。銅綠假單胞菌對(duì)喹諾酮類藥物的耐藥性與DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ、Ⅳ有密切關(guān)系。DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ分別由gyrA和gyrB基因進(jìn)行編碼，拓樸異構(gòu)酶Ⅳ通過(guò)parC和parE基因編碼[11-12]。銅綠假單胞菌gyrA基因QRDR的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物酶切之后可以獲得141 bp和277 bp兩個(gè)酶切片段[13-14]。如果銅綠假單胞菌喹諾酮類藥物突變株gyrA基因第83位氨基酸密碼子出現(xiàn)突變，酶切位點(diǎn)消失，不需要再被酶切，通過(guò)PCR-RFLP進(jìn)行分析，突變株只有1個(gè)沒(méi)有被酶切的片段。本研究結(jié)果中g(shù)yrA基因第83位氨基酸密碼子出現(xiàn)突變株，有1個(gè)沒(méi)有被酶切的片段產(chǎn)物，此結(jié)果和以往研究基本一致[15-16]。提示通過(guò)PCR擴(kuò)增gyrA基因的QRDR，進(jìn)行酶切后，可以對(duì)gyrA基因第83位氨基酸密碼子點(diǎn)突變情況進(jìn)行檢測(cè)，如果發(fā)生點(diǎn)突變則可以證明為銅綠假單胞菌喹諾酮類耐藥株。

本研究還對(duì)銅綠假單胞菌喹諾酮類藥物耐藥株Ⅱ類拓樸異構(gòu)酶gyrA、gyrB、parC和parE基因QRDR基因片段進(jìn)行分析，在耐藥株中，絕大部分的Ⅱ類拓?fù)洚悩?gòu)基因QRDR發(fā)生突變，其突變主要集中在gyrA基因和parC基因中，其中，gyrA基因編碼第83位氨基酸密碼子，出現(xiàn)高頻率的基因突變，Thr-83變?yōu)镮le，即ACC變?yōu)锳TC，但是第87位氨基酸密碼子和第83位氨基酸密碼子發(fā)生雙突變的頻率較低[17-18]。說(shuō)明銅綠假單胞菌喹諾酮類藥物耐藥主要與gyrA中的第83位氨基酸密碼子發(fā)生變異有關(guān)。本研究采集3000例住院患者的痰液、膿汁標(biāo)本，按常規(guī)方法分離銅綠假單胞菌，從中選擇30株喹諾酮耐藥菌株進(jìn)行試驗(yàn)。選擇銅綠假單胞菌野生型標(biāo)準(zhǔn)株ATCC27853作為對(duì)照。通過(guò)PCR-RFLP進(jìn)行分析，結(jié)果表明，有3株銅綠假單胞菌耐藥株沒(méi)有發(fā)生Ⅱ類拓樸異構(gòu)酶基因突變，其余均發(fā)生率基因突變，突變率達(dá)到90%，此結(jié)果和以往研究基本一致[17-18]；基因突變主要集中在gyrA編碼的83位密碼子、parC的80位密碼子，提示gyrA和parC基因突變是銅綠假單胞菌對(duì)于喹諾酮類藥物耐藥的主要機(jī)制。有資料顯示，銅綠假單胞菌Ⅱ類拓樸異構(gòu)酶二級(jí)結(jié)構(gòu)和疏水性發(fā)生變化可能是引起耐藥的物質(zhì)基礎(chǔ)。銅綠假單胞菌Ⅱ類拓樸異構(gòu)酶基因發(fā)生兩個(gè)或者兩個(gè)以上突變株對(duì)于絕大多數(shù)喹諾酮類藥物呈現(xiàn)較高水平的耐藥性[19-20]。本研究中耐藥變異株對(duì)諾氟沙星、環(huán)丙沙星100%耐藥，耐藥率均高于左氧氟沙星、哌拉西林、頭孢他啶、亞胺培南，提示諾氟沙星、環(huán)丙沙星的大量應(yīng)用可能是臨床上引起喹諾酮類藥物耐藥的因素之一。通過(guò)上述研究進(jìn)一步表明，銅綠假單胞菌變異株對(duì)于喹諾酮類耐藥是由于DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶的作用靶點(diǎn)發(fā)生不同程度的變化，其中主要為編碼DNA拓樸異構(gòu)酶Ⅱ的gyrA基因和編碼DNA拓樸異構(gòu)酶Ⅳ中的parC基因的耐藥決定區(qū)發(fā)生基因突變，促使喹諾酮類藥物和銅綠假單胞菌無(wú)法正常結(jié)合，從而影響了藥物的作用效果，造成耐藥性的形成。另外，臨床上大量應(yīng)用敏感度不高的藥物也增加了銅綠假單胞菌耐藥性的發(fā)生率。

綜上所述，探討銅綠假單胞菌Ⅱ類拓?fù)洚悩?gòu)酶基因突變特點(diǎn)，對(duì)突變株進(jìn)行藥物敏感試驗(yàn)，可以為臨床合理用藥提供可靠的理論依據(jù)。

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（收稿日期：2015-11-05 本文編輯：程 銘）