姚卓鳳 黃建 張俊梅 等

摘要：通過建立靶向于鯉皰疹病毒Ⅱ（Cyprinid herpesvirus 2， CyHV-2）胸苷激酶基因（TK基因）的熒光定量PCR法，分別檢測了自然感染CyHV-2的金魚、鯽樣品，并結(jié)合人工感染試驗，分析了脾和腎組織內(nèi)CyHV-2的載量及其引發(fā)的組織病理變化。結(jié)果表明，自然感染CyHV-2的金魚和鯽的病毒拷貝數(shù)范圍為102～105，人工感染CyHV-2的異育銀鯽在感染后第五天脾和腎組織內(nèi)病毒的拷貝數(shù)高達1010。人工感染條件下魚體呈現(xiàn)系統(tǒng)性病理損傷，自然感染狀態(tài)下魚體脾和腎的病理變化分別表現(xiàn)為細胞嗜性的轉(zhuǎn)變和炎癥。

關鍵詞：鯉皰疹病毒Ⅱ；自然感染；熒光定量PCR；組織病理學；金魚；鯽

中圖分類號：Q939.4 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）04-0980-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.04.041

Investigation of Viral Load in Healthy Fish Naturally Infected

with Cyprinind Herpesvirus Ⅱ（CyHV-2）

YAO Zhuo-feng1，2，HUANG Jian1，2，ZHANG Jun-mei1，2，NIE Hui-hui1，2，ZHENG Xiang-hai1，2，

LI Li-juan1，2，WU Zhi-xin1，2，YUAN Jun-fa1，2

（1.College of Fisheries， Huazhong Agricultural University， Wuhan 430070， China；

2. Freshwater Aquaculture Collaborative Innovation Center of Hubei Province，Wuhan 430070，China）

Abstract： In this study， a quantitative PCR assay， targeted to the TK gene of CyHV-2， was developed to identify the viral load in CyHV-2 positive samples， including cultured goldfish and wild crucian carp. The results of quantification indicated that the viral load of most of the CyHV-2 positive samples with naturally infection ranged from 102 to 105 copies. Compared with the moribund fish experimentally infected with CyHV-2， the viral load reached up to 1010 copies in spleen and kidney at 5 d post infection and showed systemic histopathology damage. The naturally infected fish showed transformation of cell tropism and inflammation in spleen and kidney respectively.

Key words：Cyprinid herpesvirus Ⅱ；natural infection；quantitative PCR；histopathology；goldfish；wild crucian carp

鯉皰疹病毒Ⅱ（Cyprinid herpesvirus 2，CyHV-2）是導致造血器官壞死癥（Herpesviral haematopoie tic necrosis disease，HVHND）的高致病性病毒，可感染金魚（Carassius auratus）、鯽（Carassius auratus）及其變種，但不感染錦鯉（Cryprinus carpiokoi）和鯉 （Cyprinus carpio），金魚與鯉的雜交種對其有抵抗能力[1]。CyHV-2隸屬于皰疹病毒目（Herpesvirales）皰疹病毒科（Alloherpesviridae）鯉皰疹病毒屬（Cyprinivirus）[2]，因其是第二個分離自鯉科魚類的皰疹病毒，按照國際病毒系統(tǒng)分類委員會的系統(tǒng)命名規(guī)則，命名為鯉皰疹病毒Ⅱ（Cyprinid herpesvirus 2）[3]。CyHV-2核衣殼呈六角形，直徑為115～117 nm，具完整囊膜的病毒粒子直徑為170～220 nm[4]。1992年秋季和1993年春季，日本暴發(fā)性金魚疾病首次分離到CyHV-2，造成了100%的死亡率[6]，然后相繼在中國臺灣[7]、美國[4，8，9]、英國[10]、澳大利亞[11]、中國內(nèi)地[12]、意大利[13]等地發(fā)生，成為了一種世界性分布的病毒，但目前CyHV-2還未被世界動物衛(wèi)生組織（OIE）納入檢疫目錄[2]。

2012年，江蘇鹽城等地養(yǎng)殖的異育銀鯽（Carassius aurattus gibelio）大面積發(fā)生暴發(fā)性出血病，隨后證實其病原為CyHV-2[12，14，15]，流行病學調(diào)查也證實了中國已有CyHV-2的分布[2]。2009年Goodwin等[5]證實健康金魚可攜帶CyHV-2，并成為潛在感染源，為水產(chǎn)品的世界貿(mào)易導致病毒廣泛散播提供了強有力的證據(jù)。流行病學調(diào)查顯示國內(nèi)的金魚流通市場存在該病毒的廣泛分布，但病毒的載量及其對宿主的影響尚未知，本研究通過建立CyHV-2的熒光定量PCR方法，監(jiān)測自然感染狀態(tài)下魚體攜帶病毒的載量，旨在了解CyHV-2自然感染情況，為該病毒病的預警和防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品 待檢測的金魚來自沈陽、北京、鄭州、武漢、昆明、福州、廣州、湛江和?？诘鹊鼗B魚市場，鯽來自洪湖、洱海、巢湖、滇池和梁子湖等湖區(qū)，共采集了金魚213尾，鯽196尾，每個采樣點均為隨機取樣。

1.1.2 試驗試劑 Taq DNA 聚合酶、dNTPs購自Biostar公司，T4 DNA連接酶購自NEB公司，pGEMT-Easy載體購自Promega公司，膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒購自OMEGA公司，SYBR Premix Ex TaqⅡ購自TaKaRa公司，化學感受態(tài)細胞及抗生素購自北京全式金生物技術有限公司，其他試劑及耗材為國產(chǎn)或進口分裝。

1.2 試驗方法

1.2.1 TK基因克隆及標準質(zhì)粒構(gòu)建 試驗魚經(jīng)MS222麻醉后，取脾和中腎組織經(jīng)液氮速凍后保存于-80 ℃?zhèn)溆谩⒖嘉墨I[2]的方法和條件進行DNA的提取和病毒篩查，陽性樣品進一步測序驗證，用于定量分析。設計引物（TK-F1/R2）擴增CyHV-2的胸苷激酶（Thymidine kinase，TK）基因的編碼序列，引物序列為5′-ATGGCTTTTCTGGAGTTGGT-3′/5′-CTCTGAGGGTTCGGGAGTGA-3′。PCR擴增程序為：95 ℃預變性4 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火35 s，72 ℃延伸30 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。目的片段大小為563 bp，并將擴增產(chǎn)物連接到pGEMT-Easy載體上，具體操作按照試劑盒說明書進行。

1.2.2 熒光定量PCR建立 靶向于TK基因，設計擴增引物TK-F2/R2，序列為5′-GCAGAATCCTACAGGGCAGTGT-3′/5′-CTCTGAGGGTTCGGGAG

TGA-3′，擴增目的片段大小為90 bp。PCR反應體系包含10 μL SYBR Premix，TK-F2/R2各 0.5 μL，1 μg組織DNA，加無菌三蒸水至20 μL。PCR反應程序為：94 ℃預變性5 min；95 ℃變性5 s，50 ℃退火25 s，72 ℃延伸20 s，40個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。熔解曲線分析采用儀器默認程序：95 ℃變性5 s，65 ℃退火1 min，溫度由65 ℃上升到97 ℃。

1.2.3 人工感染試驗 取適量患造血器官壞死癥的異育銀鯽中腎組織，加入0.01 mol/L PBS溶液（pH 7.4）后充分勻漿， 4℃、5 000 r/min 離心10 min后收集上清，并用0.45 μm的濾器過濾，以構(gòu)建的熒光定量PCR檢測濾出液中病毒的拷貝數(shù)。健康異育銀鯽購自武漢市某無CyHV-2發(fā)病史的養(yǎng)殖基地，體重（100±20） g，試驗魚暫養(yǎng)兩周后用于人工感染試驗，設置試驗組和對照組，各50尾，試驗周期7 d。試驗組每尾魚腹腔注射含有108拷貝數(shù)的組織勻漿上清100 μL，取發(fā)病魚的脾和中腎組織用于熒光定量PCR分析和組織切片制作，定量擴增在Rotor-Gene Q Series定量儀上完成，組織切片成像在ZEISS Imager.A2顯微鏡上完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 TK基因序列分析

收集公共數(shù)據(jù)庫GenBank中關于CyHV-2的TK基因序列并進行比對，結(jié)果（圖1）表明，SY-C1編碼的TK基因與ST-J1分離株除了3存在9個堿基的缺失外，其他序列均一致。為使得建立的熒光定量PCR可分析不同來源的CyHV-2，本研究中熒光定量PCR引物的位置設計在缺失區(qū)域之前。

2.2 熒光定量PCR的建立

選取102～1011拷貝數(shù)梯度的TK基因進行熒光定量PCR擴增，以重組質(zhì)?？截悢?shù)的對數(shù)為x軸、CT值為y軸，構(gòu)建標準曲線（y=-2.554 1x+34.487），相關系數(shù)為0.999 8，擴增效率為1.47。其中1011和102濃度梯度對應的CT值分別為6.59和30.02。結(jié)果表明，建立的熒光定量PCR在102～1011范圍內(nèi)呈較好的線性關系（圖2）。

2.3 自然感染CyHV-2的金魚和鯽的病毒載量分析

通過熒光定量PCR擴增，32個陽性金魚樣品中絕大多數(shù)的CyHV-2病毒載量為102～105拷貝數(shù)/μg DNA（圖3）。僅檢測到3例高病毒拷貝的金魚樣品，其中福州檢測到2例，分別是2.85×108拷貝數(shù)/μg DNA和8.32×107拷貝數(shù)/μg DNA；廣州檢測到1例拷貝數(shù)為5.25×106的金魚樣品。

11個陽性鯽樣品的CyHV-2病毒載量為102～105拷貝數(shù)/μg DNA，僅有1例來自滇池的樣品病毒含量在105拷貝數(shù)/μg DNA以上。自然感染的魚體攜帶CyHV-2的載量多低于105拷貝數(shù)/μg DNA。

2.4 人工感染CyHV-2的病毒載量分析

由圖3可以看出，人工感染CyHV-2的異育銀鯽從感染后第三天開始死亡，第四天和第五天達到死亡高峰，熒光定量PCR檢測到鰓、脾臟和中腎組織的病毒含量在72 h內(nèi)迅速增殖到108拷貝數(shù)/μg DNA，第五天瀕死魚的脾臟和中腎的病毒拷貝數(shù)高達1010拷貝數(shù)/μg DNA，對照組沒有檢測到病毒。

2.5 組織病理學分析

人工感染CyHV-2后第五天，發(fā)病魚體表皮下有點狀出血癥狀，胸鰭和腹鰭基部充血。解剖發(fā)現(xiàn)病魚鰓蒼白，有腹水，肝蒼白，中腎點狀出血現(xiàn)象嚴重。與健康魚相比，發(fā)病魚的組織質(zhì)地脆弱、易碎。自然感染的金魚和鯽均無明顯的臨床病狀，解剖也未發(fā)現(xiàn)明顯的病變。組織病理學分析結(jié)果表明，人工感染CyHV-2的魚體脾臟內(nèi)有大量的點狀壞死灶（圖4a、圖4b）；中腎組織的腎間質(zhì)細胞和腎小管上皮細胞病變極為嚴重，間質(zhì)細胞的核變大，染色質(zhì)邊集的現(xiàn)象普遍，腎小管上皮細胞代謝性質(zhì)轉(zhuǎn)變甚至急性壞死，腎小球水腫（圖4c、圖4d）。自然感染CyHV-2的金魚脾臟網(wǎng)狀細胞的細胞嗜性轉(zhuǎn)變，中腎主要表現(xiàn)為炎癥。

3 小結(jié)與討論

病毒編碼的胸苷激酶（Thymidine kinase，TK）基因同核酸代謝相關，與病毒的毒力相關[16]，常作為分子檢測的靶標。2009年Kurita等[17]和2013年Dong等[18]先后用CyHV-3的TK基因與其他基因作為CyHV-3分型的依據(jù)。序列分析表明，不同來源的CyHV-2編碼的TK基因存在差異，也可用作分型的依據(jù)。本研究首次運用TK基因作為CyHV-2全基因組的等價物檢測感染CyHV-2的魚體組織的病毒拷貝數(shù)，其準確定量的范圍為102～1011拷貝數(shù)，設計的引物避開變異區(qū)域，可檢測不同來源的CyHV-2。

利用建立的熒光定量PCR分析了43份CyHV-2陽性樣品，其中32份為城市的金魚樣品，11份為湖區(qū)的鯽樣品。熒光定量PCR分析表明，陽性樣品的病毒載量為102～105拷貝數(shù)/μg DNA。福州地區(qū)自然感染CyHV-2的陽性金魚樣品的病毒拷貝數(shù)達到了人工感染條件下可致死的病毒拷貝數(shù)的范圍，其他地區(qū)也有個別樣品的病毒含量接近這個范圍。Goodwin等[20]對自然感染條件下不同來源且無臨床病狀的金魚研究表明，病毒的拷貝數(shù)的波動范圍在102～107，與中國流行病學調(diào)查結(jié)果具有相似性，證明了無臨床病狀的金魚或鯽攜帶CyHV-2病毒能力和攜帶高拷貝數(shù)的魚體病毒無臨床病狀存活，造成該現(xiàn)象的原因可能與金魚頻繁市場流通有關。

錦鯉國際貿(mào)易和國際錦鯉觀賞展示活動是導致CyHV-2在國際范圍內(nèi)廣泛傳播的重要原因，造成了嚴重的經(jīng)濟損失，德國、英國和世界動物健康組織均將其列為必報疾病。中國CyHV-2的流行病學調(diào)查證實了CyHV-2在中國內(nèi)地廣泛分布，多個國家或地區(qū)有CyHV-2病例的報道，共同證明了CyHV-2在世界范圍內(nèi)廣泛分布。金魚國際貿(mào)易的繁榮，且OIE還未將CyHV-2納入檢疫名錄，給CyHV-2在世界范圍內(nèi)快速散播提供了便利。CyHV-2在國內(nèi)從南到北廣泛分布的局面，對國內(nèi)乃至全球的金魚流通市場和國內(nèi)野生鯽的種質(zhì)資源舉起了警示牌，需要盡快采取措施，重視CyHV-2的檢疫。

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