劉里

摘要：在優(yōu)化的試驗條件下，運用熒光光譜和紫外-可見光譜法研究了頭孢西丁鈉（CS）與牛血清白蛋白（BSA）之間的相互作用和共存金屬離子對CS與BSA的相互作用的影響。計算了不同溫度下的熱力學參數(shù)、結合常數(shù)和結合位點數(shù)。結果表明，CS對BSA的猝滅機制屬于形成復合物的靜態(tài)猝滅過程；兩者之間的作用主要是氫鍵或范德華力。CS在BSA中的結合位點主要位于ⅢA。Hill系數(shù)nH>1，表明CS有強的協(xié)同作用。根據(jù)同步熒光光譜法研究了CS對BSA構象的影響?？疾炝薋e3+、Mn2+、Cr2+、Ni2+、Mg2+金屬離子對兩者相互作用的影響，結果表明金屬離子對CS與BSA的結合常數(shù)和結合位點數(shù)均有影響，降低了其結合能力。

關鍵詞：頭孢西丁鈉；相互作用；金屬離子

中圖分類號：R96 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）04-0971-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.04.039

Study on Interaction between Cefoxitin Sodium and Bovine Serum Albumin and the Effect of Coexistent Metal Ion on the Reaction by Spectrometry

LIU Li

（College of Chemistry and Chemical Engineering， Qujing Normal University， Qujing 655011， Yunnan， China）

Abstract： Under the optimized conditions， the interaction of cefoxitin sodium （CS） with bovine serum albumin（BSA） and the effects of the coexisted metal ion on the reaction were investigated by fluorescence spectrometry and ultraviolet-visible light absorption spectrometry. The evaluation index was the binding constants， number of binding sites and thermodynamic parameters under different temperatures. The results showed that the quenching of BSA by CS was a static quenching procedure involving complex formation. The interaction between BSA and CS was dominated by Van Der Waals forces or hydrogen bond. The primary binding site for TI was located at sub-domain ⅢA of BSA. The values of Hill's coefficients were more than 1， which suggested that there was some strong positive cooperative effect. The effect of CS on the conformation of BSA was analyzed by synchronous fluorescence spectrometry. The metal ion such as Fe3+、Mn2+、Cr2+、Ni2+ and Mg2+， had effects on the binding constants and binding sites numbers of CS and BSA and declined its abilities of combination.

Key words：cefoxitin sodium；interaction； metal ions

頭孢西丁鈉（Cefoxitin sodium，CS），常用于呼吸道感染、心內膜炎、腹膜炎、腎盂腎炎、尿路感染、敗血癥以及關節(jié)、皮膚和軟組織等感染的治療[1]，是一種安全、有效的抗生素。藥物與血清白蛋白作用力的大小直接影響到藥物在體內的分布、清除以及藥效等重要生命過程。因此，研究藥物與血清白蛋白的結合作用對理清藥物的作用機制意義重大[2-4]。因為結構上和人血清白蛋白的相似性，牛血清白蛋白（BSA）廣泛運用于和藥物結合的研究[2-4]。至今還未見光譜法研究CS和BSA相互作用的報道，而且以往研究藥物與BSA結合作用主要集中在猝滅機理的判斷上。而本試驗從不同的方面研究了CS與BSA的結合反應，除了常規(guī)的作用機理及結合特征的研究，還深入探討了兩者的結合位置、藥物之間的協(xié)同性以及金屬離子對CS與BSA結合反應的影響。這些研究對于闡明CS在機體內的傳輸、代謝過程及藥理作用具有有益的參考意義。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

熒光光譜儀：F-4600，日本日立公司，狹縫寬度 10.0 nm，負高壓為 400 V；紫外-可見光譜儀：Cary 50型，美國瓦里安技術中國有限公司。牛血清白蛋白（上?？瑯由锛夹g有限公司）配成1.0×10-4 mol/L溶液，頭孢西丁鈉（百靈威科技有限公司） 配成1.54×10-4 mol/L溶液，三羥甲基氨基甲烷（Tris，成都化學試劑廠） 制成0.2 mol/L的溶液，試驗用水為超純水。

1.2 試驗方法

準確移取0.2 mol/L、pH 7.5的Tris-HCl緩沖溶液1.0 mL于10.0 mL比色管中，加入0.5 mol/L NaCl溶液2.0 mL以保持反應體系的離子強度。再加入1.0×10-6 mol/L的BSA 2.25 mL和0、2.0、2.2、2.4、2.6、2.8、3.0、3.2、3.4、3.6、3.8、4.0 mL的1.54×10-4 mol/L的CS溶液，用水釋至刻度并搖勻。熒光分光光度計記錄熒光光譜，其最大激發(fā)/發(fā)射波長（λex/λem）位于280 nm/344 nm 處，掃描熒光猝滅光譜和同步熒光光譜（Δλ分別為15 nm和60 nm）記錄F和F0（F和F0分別指CS存在與不存在時BSA的熒光強度）。以相應的CS溶液作為參比，記錄CS-BSA體系的吸收光譜。按照上述條件，在CS-BSA體系中加入濃度均為1×10-3 mol/L金屬離子（Mn2+、Ni2+、Cr3+、Fe3+、Mg2+）0.2 mL，測定其熒光光譜。

2 結果與分析

2.1 對適宜反應條件的探究

分別考察了緩沖溶液種類、pH、緩沖溶液的用量、BSA的濃度以及試劑加入順序對體系熒光強度的影響，結果表明，選用0.02 mol/L、pH 7.5的Tris-HCl緩沖溶液1.0 mL調節(jié)酸度，2.25×10-6 mol/L BSA作為反應濃度，CS→BSA→NaCl→Tris-HCl的加入順序進行測量時效果最佳。

2.2 猝滅光譜

在試驗條件下，固定BSA的濃度，在激發(fā)波長為280 nm的條件下，掃描復合物CS-BSA的熒光光譜得圖1。由圖1可知，隨著CS濃度的增大，最大激發(fā)波長紅移，BSA的內源熒光有規(guī)律地降低，但是峰形未發(fā)生變化，表明CS可以猝滅蛋白質的內源熒光。

2.3 猝滅類型的確定

熒光猝滅機理類型分為動態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅[5-7]。常用溫度的變化來確定猝滅類型。在動態(tài)猝滅中分子擴散起主導，猝滅常數(shù)會隨著溫度的升高而增大；對于靜態(tài)猝滅，因有新物質生成，穩(wěn)定性起主導作用，溫度越高，猝滅常數(shù)反而越小[5-7]。猝滅過程遵循S-V方程：F0/F=1+KSV[C]=1+Kqτ0[C]，式中KSV為猝滅常數(shù)；Kq為速率常數(shù)[最大值約為2×1010 L/（mol·s）]；τ0為熒光體平均壽命，一般為10-8 s數(shù)量級；[C]為CS的濃度。由表1可知，3個溫度下Kq均大于2×1010 L/（mol·s），所以初步判斷猝滅過程為靜態(tài)猝滅；又由圖2可見，隨著反應溫度的升高，直線斜率即Ksv逐漸降低，進一步說明CS與BSA的猝滅作用屬于靜態(tài)猝滅。

若為靜態(tài)猝滅，則應符合L-B方程[8-10]：（F0-F）-1=F0-1+（KLBF0[C]）-1，式中KLB為靜態(tài)熒光猝滅解離常數(shù)，（F0-F）-1-[C]-1作不同溫度下的L-B曲線，結果見表2。由表2可見，KLB值都在104數(shù)量級，結合力很強，并且隨著溫度升高，KLB越來越小，表明CS與BSA的結合是符合靜態(tài)猝滅特征的。

考察熒光體的吸收光譜是區(qū)分反應體系為靜態(tài)猝滅還是動態(tài)猝滅的另一種方法，動態(tài)猝滅僅僅影響熒光體的激發(fā)態(tài)而不影響熒光體的吸收光譜，而基態(tài)配合物的形成會引起熒光體吸收光譜的變化[5-7]。由圖3可知，CS和BSA的疊加紫外吸收光譜和藥品作用下的BSA紫外吸收光譜不重疊，最大吸收波長由277 nm紅移至280 nm。由此可證明CS對BSA的猝滅作用為靜態(tài)猝滅。

2.4 CS與BSA結合常數(shù)及結合位點數(shù)的計算

如藥物小分子與BSA大分子存在n個等同且獨立的結合位點，它們之間相互作用關系符合公式lg[（F0-F）/F]=lgK+nlg[C][8-10]。分別在297、312、327 K溫度下，以lg（F0-F）/F對lg[C]作圖，通過線性擬合可得到直線的斜率和截距，由直線的斜率和截距可求出CS與BSA不同溫度下的結合常數(shù)K及結合位點數(shù)n，見表3。由表3可知，3個溫度下的n均大于1，K至少達到104，表明CS與BSA的相互作用較強。總體趨勢來看n和K隨溫度升高而增大，當溫度為327 K時，n接近2，溫度的提升有利于血清白蛋白攜帶著CS在體內進行運轉、貯存和分配。

2.5 CS與BSA作用力類型的確定

靜電引力、疏水作用力、氫鍵和范德華力等是藥物小分子與蛋白質大分子的主要結合作用力[8-10]。把結合反應的焓變ΔH看作是一個常數(shù)（溫度變化范圍不大時）[8-10]。根據(jù)熱力學公式[8-10]計算CS與BSA結合反應的ΔH，熵變ΔS及吉布斯自由能變ΔG，結果見表4。根據(jù)Ross等[11]、Sulkowska等[12]、劉保生等[13]總結出的規(guī)則進行判斷，由表4可得，ΔG<0，表明BSA與CS的反應能自發(fā)進行，ΔH<0，表明反應為放熱反應，ΔS<0，表明反應過程為熵減小過程，ΔH<0、ΔS<0，說明氫鍵和范德華力為CS與BSA的主要作用力。

2.6 CS與BSA相互作用的同步熒光光譜

血清白蛋白的構象變化通常用同步熒光光譜來分析，根據(jù)最大發(fā)射波長Δλ的變化來確定[8-10]其熒光主要來自于何種氨基酸殘基，而且氨基酸殘基的λmax與其所處的疏水性也緊密相關[8-10]。酪氨酸殘基的特征熒光由Δλ=15 nm時測得的同步熒光光譜顯示；色氨酸殘基的特征熒光由Δλ=60 nm測得的同步熒光光譜顯示[8-10]。Δλ=15 nm和Δλ=60 nm測BSA的同步熒光光譜（圖4）。由圖4可見，隨CS濃度的增大，Δλ=15 nm和Δλ=60 nm的λmax均有紅移，Δλ=15 nm酪氨酸從281 nm紅移至285 nm，紅移了4 nm；Δλ=60 nm色氨酸殘基從280 nm紅移至285 nm，紅移了5 nm。表明CS與BSA作用改變了色氨酸、酪氨酸殘基所處的微環(huán)境，氨基酸微環(huán)境的改變使得BSA腔內疏水環(huán)境的極性增強，疏水性減弱，從而導致BSA的構象發(fā)生了變化。

2.7 結合位置的確定

與人血清白蛋白相似，BSA含有3個ɑ-螺旋域（Ⅰ-Ⅲ），每個ɑ-螺旋域包含兩個亞螺旋域A和 B。為確定藥物小分子與BSA結合的具體位置并反映出在兩者的作用過程中色氨酸殘基和酪氨酸殘基的實際參與情況，用文獻[12-14]提出的方法，即比較280 nm和295 nm激發(fā)時的體系熒光猝滅曲線。由圖5可知，兩種激發(fā)波長下，CS與BSA的猝滅曲線是獨立的，而且猝滅程度是在280 nm時比295 nm時要小，這一現(xiàn)象說明在CS與BSA的猝滅反應中，色氨酸和酪氨酸殘基都參與其中，結合位點主要位于亞螺旋域的ⅢA中。

2.8 藥物協(xié)同性

Sulkowska等[12]、劉保生等[13]、梁宏等[14]認為藥物協(xié)同性是指藥物與具有多重結合部位的BSA結合過程中各結合部位之間可能存在相互影響作用，可用Hill方程[12-14]進行分析：lgH/（1-H）=lgK+nHlg[C]，式中，H為結合飽和分數(shù)，K為結合常數(shù)，nH為Hill系數(shù)。在熒光試驗中：H/（1-H）=B/（Bm-B），其中，B=（F0-F）/F0；1/Bm是1/B對1/[C]作圖的截距。CS-BSA的nH值的計算結果見表5。表5中3個溫度下的nH都大于1，表現(xiàn)為正協(xié)同作用。隨溫度的升高，nH逐漸增大而且變化較大，表明藥物協(xié)同性對溫度變化很敏感。當溫度為327 K時，nH大于2，表現(xiàn)為較強的正協(xié)同作用。即前一個藥物分子結合到BSA位點上后，有利于后一個藥物分子與BSA的結合。

2.9 金屬離子對體系的影響

金屬離子與蛋白質有一定的結合力[2]，金屬離子的存在會直接影響藥物與蛋白質結合[8，9]。為此，測定了幾種常見金屬離子Mn2+、Ni2+、Cr3+、Fe3+、Mg2+對CS-BSA體系相互作用的影響，結果見表6。從表6中可明顯看出，金屬離子不同，K′和n也不同，其原因可能是由于金屬元素本身的原子結構不同，才導致與BSA的結合力和結合位點的差異。這五種常見金屬離子的K′都比原體系的K小，其中Cr3+對體系的影響最大，可能是金屬離子與BSA先結合，占據(jù)了BSA的結合位點，從而使CS與BSA結合作用減弱。但CS與血清白蛋白結合力減弱，可能會縮短藥物的存儲時間，增大藥物的最大作用強度[8-10]。

3 結論

用熒光和紫外光譜法推斷出CS對BSA熒光產生靜態(tài)猝滅，兩者靠氫鍵和范德華力作用力結合；通過計算求得了K和n值的大小，表明CS可以被BSA運輸；兩者結合位置位于BSA的亞螺旋域ⅢA中；在CS與BSA結合過程中，藥物分子之間有較強的正協(xié)同性；CS對BSA的構象產生一定的影響；詳細研究了Fe3+、Mn2+、Cr2+、Ni2+、Mg2+對CS與BSA相互作用的影響。

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