朱華東 陳永雷 陳宏麗 陳興國(guó)

摘 要 建立了在線測(cè)定秦皮甲素和秦皮乙素水解反應(yīng)速率常數(shù)的掃集流動(dòng)注射膠束電動(dòng)色譜新方法。該方法進(jìn)樣頻率為12次/h，可在5 min內(nèi)完全分離反應(yīng)體系中的所有組分，30 min即可完成一個(gè)溫度下的反應(yīng)速率常數(shù)測(cè)定。由于該在線測(cè)定方法不需要終止水解反應(yīng)，通過(guò)一次連續(xù)進(jìn)樣分析得到水解反應(yīng)過(guò)程電泳譜圖，從而可以獲得水解反應(yīng)過(guò)程中的一些信息。在最佳條件時(shí)，用0.1 mol/L KOH為催化劑，測(cè)得25， 30， 35， 40和45℃時(shí)秦皮甲素的水解反應(yīng)速率常數(shù)分別為3.65×10

1 引 言

秦皮作為一種常用的中藥，已經(jīng)有2000多年的歷史，對(duì)治療腹瀉、痢疾、咳嗽和一些婦科疾病有很好的療效，并且有一定的防癌作用[1，2]。秦皮甲素（Aesculin）和秦皮乙素（Aesculetin）是秦皮的兩種主要有效成分，其結(jié)構(gòu)如圖1所示。藥理實(shí)驗(yàn)表明，秦皮甲素可以延長(zhǎng)環(huán)己烯巴比妥對(duì)小鼠的催眠作用，而秦皮乙素則沒(méi)有此作用；秦皮甲素也不具有秦皮乙素的抗組胺作用以及放松對(duì)豚鼠離體氣管平滑肌的作用。由于它們?cè)诔睗竦沫h(huán)境中性質(zhì)不穩(wěn)定，因此建立一種簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、可靠的研究秦皮甲素和秦皮乙素的水解方法對(duì)此類(lèi)藥物的質(zhì)量和穩(wěn)定性評(píng)價(jià)具有重要意義。

毛細(xì)管電泳（Capillary electrophoresis， CE）由于具有所需樣品量小、分析時(shí)間短和分離效率高的優(yōu)點(diǎn)而適用于化學(xué)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測(cè)定[3～10]。Zhang等[7]利用離線CE方法測(cè)定了秦皮甲素堿性水解反應(yīng)速率常數(shù)和活化能。該方法雖然可行，但存在檢測(cè)反應(yīng)液中目標(biāo)化合物需先用磷酸溶液終止反應(yīng)、每次實(shí)驗(yàn)只能得到所需要測(cè)定的動(dòng)力學(xué)參數(shù)中的一個(gè)點(diǎn)等缺點(diǎn)。在測(cè)定速率常數(shù)時(shí)，至少需要對(duì)反應(yīng)過(guò)程中5個(gè)不同反應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的反應(yīng)液進(jìn)行分析。若欲測(cè)定不同溫度、pH值、離子強(qiáng)度、溶劑等條件下的動(dòng)力學(xué)參數(shù)，可能需要幾十甚至上百次實(shí)

圖1 秦皮甲素和秦皮乙素的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

Fig.1 Chemical structure of aesculin and aesculetin

驗(yàn)，這給反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究帶來(lái)了極大不便。離線分析表明秦皮甲素水解生成秦皮乙素和葡萄糖。從這一結(jié)果看，秦皮甲素的內(nèi)酯鍵在堿性條件下似乎是穩(wěn)定的。然而，Chen等[11]的研究表明，烯醇式和內(nèi)酯結(jié)構(gòu)很容易在堿性條件下解離。此外，Dodge[12]指出，香豆素的堿性水解和其內(nèi)酯形成是一個(gè)可逆過(guò)程，當(dāng)堿過(guò)量時(shí)，水解完全。但是，過(guò)量的堿一旦被中和，則開(kāi)始進(jìn)行逆水解過(guò)程，即開(kāi)始形成香豆素，直到達(dá)到平衡點(diǎn)。很明顯離線分析只給出了水解反應(yīng)終止后的秦皮甲素水解反應(yīng)在平衡狀態(tài)的信息，而無(wú)法獲得亞穩(wěn)狀態(tài)的一些信息。而這些信息對(duì)研究秦皮甲素類(lèi)藥物的物理、化學(xué)、生物性質(zhì)的各個(gè)過(guò)程可能是非常重要的。迄今為止，測(cè)定秦皮乙素水解反應(yīng)速率常數(shù)的工作尚未見(jiàn)報(bào)道。由此可知，有必要建立在線研究秦皮甲素和秦皮乙素水解反應(yīng)的新方法。

自從1997年Kubán[ 13]和Fang[14]等分別建立了流動(dòng)注射毛細(xì)管電泳（FIchip CE）技術(shù)以來(lái)，F(xiàn)Ichip CE已經(jīng)廣泛應(yīng)用于各種分析領(lǐng)域[15～24]， 并在此基礎(chǔ)上形成了流動(dòng)注射芯片毛細(xì)管電泳（FIchip CE）。由于具有高樣品吞吐量和連續(xù)進(jìn)樣等優(yōu)點(diǎn)，F(xiàn)Ichip CE非常適用于化學(xué)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究。然而，迄今為止，該技術(shù)很少用于水解動(dòng)力學(xué)研究中。

鑒于此，本研究建立了一種簡(jiǎn)單快速的在線測(cè)定水解反應(yīng)速率常數(shù)的掃集流動(dòng)注射毛細(xì)管膠束電動(dòng)色譜（SweepingFIchip MEKC）方法， 并將其用于測(cè)定秦皮甲素和秦皮乙素的水解反應(yīng)速率常數(shù)。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 試劑

秦皮甲素和秦皮乙素均購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所。十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）、十二烷基硫酸鈉（SDS）、Na2B4O7、KH2PO4、HCl、KOH和乙腈（ACN）購(gòu)于天津第二試劑廠。所有試劑均為分析純。所用水均為蒸餾水。

2.2 FIchip CE系統(tǒng)

用于在線研究秦皮甲素和秦皮乙素水解反應(yīng)的裝置由K1000 FIA型流動(dòng)注射分析儀（HITACHI，日本）、H通道微芯片聯(lián)用接口和HPE100型電泳儀（BioRad 公司，美國(guó)）組成，整個(gè)裝置如圖2所示。用一根33 cm的PTFE （0.5 mm I.D.）泵管連接FI的進(jìn)樣閥和分流接口。通過(guò)FI的蠕動(dòng)泵流路將緩沖溶液或水輸送到位于試劑環(huán)兩邊的兩個(gè)20 μL的試劑環(huán)中，將樣品溶液輸送位于中間的樣品環(huán)中。采用手動(dòng)進(jìn)樣模式。用恒溫水浴控制水解反應(yīng)溫度，用磁力攪拌器混合反應(yīng)物，置于恒溫水浴中的10 mL燒瓶作為反應(yīng)器與輸送載流溶液（即運(yùn)行緩沖溶液）的柱塞泵相連接。用有效長(zhǎng)度為22.0 cm （總長(zhǎng)25.0 cm）、內(nèi)徑75 μm的熔融石英毛細(xì)管作為分離通道（河北永年光導(dǎo)纖維廠）。檢測(cè)波長(zhǎng)為334 nm。用Chroma 軟件（BioRad 公司，美國(guó)）采集處理電泳數(shù)據(jù)。

.

2.3 樣品和試劑制備

用10%甲醇配制秦皮甲素（1.00 mmol/L）和秦皮乙素（0.80 mmol/L）儲(chǔ)備溶液，保存于4℃冰箱內(nèi)備用。用10%甲醇稀釋上述儲(chǔ)備液， 得到濃度分別為0.10， 0.20， 0.30， 0.40， 0.50， 0.60， 0.70， 0.80， 0.90和1.00 mmol/L秦皮甲素標(biāo)準(zhǔn)溶液和0.10， 0.20， 0.30， 0.40， 0.50， 0.60， 0.70和0.80 mmol/L秦皮乙素標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別配制0.1 mol/L Na2B4O7、0.2 mol/L KH2PO4、0.04 mol/L CTAB和0.2 mol/L SDS儲(chǔ)備溶液。分離緩沖溶液為5 mmol/L Na2B4O710 mmol/L KH2PO42.0 mmol/L CTAB5% ACN （pH 6.0）和10 mmol/L Na2B4O720 mmol/L KH2PO45.0 mmol/L SDS （pH 6.0）。所有溶液均用0.45 μm濾膜（上海新亞凈化器件廠）過(guò)濾。

2.4 實(shí)驗(yàn)操作步驟

2.4.1 FI和CE操作步驟 采用16通自動(dòng)進(jìn)樣閥完成FI充樣（Loading）和注樣（Injecting），具體操作參見(jiàn)文獻(xiàn)[17]。

為保證良好的重現(xiàn)性，每天運(yùn)行前分別用水、0.1 mol/L NaOH、水、緩沖溶液依次沖洗毛細(xì)管5 min。兩次運(yùn)行之間毛細(xì)管依次用水（2 min）、0.1 mol/L NaOH （3 min）、水（2 min）、緩沖溶液（3 min）沖洗。

2.4.2 水解反應(yīng)速率常數(shù)測(cè)定步驟 先將恒溫水浴調(diào)節(jié)到水解所需的溫度（分別為25， 30， 35， 40和45℃）。再將1.0 mL 1.00 mmol/L秦皮甲素溶液和1.0 mL 0.2 mol/L KOH溶液分別在恒溫水浴中預(yù)熱至相應(yīng)溫度并恒溫15 min。然后將這兩種溶液用磁力攪拌器快速混合，同時(shí)，取反應(yīng)混合溶液進(jìn)樣并計(jì)時(shí)，進(jìn)行分離、測(cè)定。此后每隔5 min進(jìn)樣一次并進(jìn)行分離測(cè)定。然后按同樣步驟分別在15， 20， 25， 30和35℃時(shí)測(cè)定秦皮乙素的水解反應(yīng)速率常數(shù)。

3 結(jié)果與討論

3.1 CE條件優(yōu)化

為了依據(jù)FIchip CE體系測(cè)得的數(shù)據(jù)研究秦皮甲素和秦皮乙素的水解速率常數(shù)，就必須要求CE能將二者的水解產(chǎn)物與共存物質(zhì)完全分離。為此，必須對(duì)CE條件進(jìn)行優(yōu)化。

本實(shí)驗(yàn)先用5 mmol/L Na2B4O710 mmol/L KH2PO4 （pH 6.0）作緩沖溶液[7]。結(jié)果表明，在此條件下只能得到兩個(gè)“矮胖”峰（電泳圖未給出）。其原因是樣品溶液中含有0.1 mol/L KOH，其電導(dǎo)率比緩沖溶液高得多，發(fā)生了去堆積效應(yīng)。該效應(yīng)可以通過(guò)在緩沖溶液中加入CTAB以形成膠束電動(dòng)色譜來(lái)消除[25]。實(shí)驗(yàn)考察了CTAB濃度在1.0～5.0 mmol/L范圍內(nèi)變化時(shí)對(duì)峰高和峰形的影響。結(jié)果表明，當(dāng)其濃度為2.0 mmol/L時(shí)，峰形和峰高最好。為了進(jìn)一步改善分離效率，實(shí)驗(yàn)還考察了乙腈作添加劑的可行性和其濃度的影響。結(jié)果表明，用乙腈作添加劑可有效提高分離效率，且當(dāng)乙腈濃度為5%時(shí)，峰形最好。

FIchip CE的最大采樣頻率取決于水解反應(yīng)時(shí)間和CE的分離速度，短的分離時(shí)間和高樣品吞吐量將有利于快速動(dòng)力學(xué)研究。為此，實(shí)驗(yàn)考察了電壓對(duì)分離時(shí)間和采樣頻率的影響。結(jié)果表明，雖然使用高電壓會(huì)提高分離速度、縮短分離時(shí)間，但同時(shí)會(huì)增加基線噪聲，使檢出限變高。當(dāng)電壓為

Symbolm@@ 6.0 kV時(shí)（CTAB使EOF逆轉(zhuǎn)，需要采用負(fù)高壓），秦皮甲素和其水解產(chǎn)物在5 min內(nèi)可得到完全分離，但是當(dāng)電壓大于

Symbolm@@ 6.5 kV時(shí)，秦皮甲素和其水解產(chǎn)物的峰發(fā)生部分重疊。所以用

Symbolm@@ 6.0 kV作為最佳電壓。

在研究秦皮乙素的水解反應(yīng)時(shí)，仍先用5 mmol/L Na2B4O710 mmol/L KH2PO4 （pH 6.0）作緩沖溶液，結(jié)果表明在此條件無(wú)法將目標(biāo)分析物分離。隨后采用10 mmol/L Na2B4O720 mmol/L KH2PO4 （pH 6.0）為緩沖溶液，此時(shí)，采用文獻(xiàn)[7]中使用的0.4 mmol/L的初始反應(yīng)物濃度時(shí)，秦皮乙素的峰高為2.1 mAU，水解10 min后幾乎檢測(cè)不到秦皮乙素的峰。這是由于使用紫外檢測(cè)器的FIchip CE低靈敏度導(dǎo)致的。為解決這一問(wèn)題，實(shí)驗(yàn)采用在線“掃集”技術(shù)[25～29]，即建立了在線掃集流動(dòng)注射芯片膠束電動(dòng)色譜（SweepingFIchip MEKC）體系。具體步驟如下，用100 μL的樣品環(huán)和1.0 mL/min的流速增加進(jìn)樣體積，在緩沖溶液中加入SDS形成膠束并實(shí)現(xiàn)MEKC分離。由于樣品溶液中不含SDS，施加電壓后SDS膠束將樣品區(qū)帶掃集到一個(gè)狹窄的區(qū)帶，從而達(dá)到富集效果。實(shí)驗(yàn)考查了SDS濃度在5～30 mmol/L范圍內(nèi)變化時(shí)對(duì)靈敏度的影響，結(jié)果表明，SDS的濃度為10 mmol/L時(shí)靈敏度最高。在此條件下，0.4 mmol/L秦皮乙素的峰高為22.5 mAU，靈敏度提高了10.7倍。因此，選擇10 mmol/L Na2B4O720 mmol/L KH2PO410 mmol/L SDS （pH 6.0）作為運(yùn)行緩沖溶液。當(dāng)電壓為6.5 kV時(shí)，秦皮乙素和其水解產(chǎn)物在5 min內(nèi)可很好地分離。當(dāng)電壓大于6.5 kV時(shí)，基線噪聲變差，分離度明顯下降。因此選擇6.5 kV作為最佳分離電壓。

3.2 在線SweepingFIchip MEKC方法的性能

為了準(zhǔn)確測(cè)定秦皮甲素和秦皮乙素水解反應(yīng)速率常數(shù)，要求用于定量分析二者濃度的方法必須具有高準(zhǔn)確度和精密度。為此，我們通過(guò)實(shí)驗(yàn)對(duì)本文所建立的在線SweepingFIchip MEKC方法的性能進(jìn)行了考察。在最優(yōu)條件下，以每5 min進(jìn)一次樣（12次/h）的頻率連續(xù)進(jìn)樣、分離和測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1和表2。由表可見(jiàn)，各個(gè)水解反應(yīng)條件下的反應(yīng)物的峰面積或峰高與其濃度的回歸方程的線性相關(guān)系數(shù)均大于0.997，而且秦皮甲素和秦皮乙素兩者的峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.4%和1.1%， 峰高相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.2%和0.9%， 遷移時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.4%和0.6%。結(jié)果表明，本方法可以準(zhǔn)確測(cè)定秦皮甲素和秦皮乙素的濃度。

上述結(jié)果表明，所建立的方法靈敏度高、重現(xiàn)性好，完全滿足在線研究秦皮甲素和秦皮乙素水解動(dòng)力學(xué)的要求。

3.3 秦皮甲素水解速率常數(shù)的在線測(cè)定

秦皮甲素在30℃時(shí)水解反應(yīng)后所得溶液的電泳譜圖如圖3所示。在秦皮甲素峰的前面有3個(gè)未知化合物峰。隨水解時(shí)間的增加，其中一個(gè)峰的峰高變化不規(guī)則，另外兩峰的峰高增加，同時(shí)秦皮甲素的峰降低。這些現(xiàn)象表明，3個(gè)未知化合物是秦皮甲素的水解產(chǎn)物或水解中間體。有趣的是，這個(gè)結(jié)果與以往離線用磷酸溶液終止秦皮甲素水解反應(yīng)后測(cè)定其動(dòng)力學(xué)參數(shù)的結(jié)果不同[11]。這是因?yàn)殡x線測(cè)定給出的是秦皮甲素水解平衡狀態(tài)的信息，而用SweepingFIchip MEKC在線測(cè)定時(shí)，秦皮甲素在堿過(guò)量條件下進(jìn)行水解，如前所述，當(dāng)堿過(guò)量時(shí)，香豆素結(jié)構(gòu)中的內(nèi)酯結(jié)構(gòu)很容易解離，水解進(jìn)行完全，過(guò)量的堿一旦被中和（用磷酸溶液終止水解反應(yīng)），則將重新形成內(nèi)酯結(jié)構(gòu)，直到達(dá)到平衡點(diǎn)，這說(shuō)明在線測(cè)定給出的是秦皮甲素水解過(guò)程中的信息。

1， 秦皮甲素； 2～4， 秦皮甲素的水解產(chǎn)物。

Conditions are the same as in Table 1. 1， aesculin； 2-4， the aesculin hydrolyzates

在上述條件下也測(cè)定了秦皮甲素在25℃， 35℃， 40℃及45℃的水解速率常數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，水解速率隨溫度的升高迅速增大。25℃時(shí)，秦皮甲素在2 h內(nèi)水解完全，當(dāng)溫度升高到45℃時(shí)，水解時(shí)間縮短為0.5 h。

秦皮甲素在一定的反應(yīng)時(shí)間（t）的瞬時(shí)濃度（c）通過(guò)如下方法獲得：準(zhǔn)確地記錄從反應(yīng)開(kāi)始到每次注射時(shí)間t，而使用校準(zhǔn)曲線計(jì)算得到c。以logc對(duì)t作圖在各個(gè)溫度下均得到一條直線，說(shuō)明秦皮甲素水解類(lèi)似一級(jí)反應(yīng)。由于水在水解過(guò)程中是大量的，其濃度可認(rèn)為是常數(shù)。因此，水解速率常數(shù)k可以用一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程（1）計(jì)算：

3.4 秦皮乙素水解速率常數(shù)的在線測(cè)定

當(dāng)用同樣的方法測(cè)定秦皮乙素水解速率常數(shù)時(shí)的電泳譜圖見(jiàn)圖4。由圖可見(jiàn)，由于KOH濃度很大（0.1 mol/L），導(dǎo)致秦皮乙素劇烈水解，25℃時(shí)水解30 min即反應(yīng)完全。要測(cè)定秦皮乙素水解速率常數(shù)，至少需要5次精確進(jìn)樣分析，實(shí)驗(yàn)中FIchip CE的采樣頻率為12次/h，25℃時(shí)勉強(qiáng)可以通過(guò)5次進(jìn)樣測(cè)定秦皮乙素水解反應(yīng)速率常數(shù)，而在30℃， 35℃， 40℃和45℃時(shí)則無(wú)法測(cè)定。考慮到秦皮乙素類(lèi)藥物一般在室溫和酸堿性溫和的條件下生產(chǎn)或存放，因此測(cè)定了1535℃、10 mmol/L KOH條件下秦皮乙素水解反應(yīng)速率常數(shù)。結(jié)果見(jiàn)表4。由Arrhenius方程計(jì)算的活化能為31.55 kJ/mol。

4 結(jié) 論

建立了在線測(cè)定秦皮甲素和秦皮乙素水解速率常數(shù)的sweeptingFIchip MEKC的方法。本方法不需要終止反應(yīng)，30 min內(nèi)可以測(cè)定至少5個(gè)點(diǎn)的數(shù)據(jù)，滿足了測(cè)定水解反應(yīng)速率常數(shù)對(duì)分析速度的要求。與傳統(tǒng)的離線測(cè)定化學(xué)反應(yīng)常數(shù)的方法相比，本方法簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確。

References

1 Kaneko T， Tahara S， Takabayashi F， Harada N. Free Radical Res.， 2004， 38（8）： 839-846

2 Wang C J， Hsieh Y J， Chu C Y， Lin Y L， Tseng T H. Cancer Lett.， 2002， 183（2）： 163-168

3 Biyani M， Nishigaki K. Electrophoresis， 2001， 22（1）： 23-28

4 Wang J， Chatrathi M P， Tian B M， Polsky R. Anal. Chem.， 2000， 72（11）： 2514-2518

5 Kunkel A， Günter S， Wtzig H. Electrophoresis， 1997， 18（10）： 1882-1889

6 Kunkel A， Günter S， Wtzig H. J. Chromatogr. A， 1997， 768（1）： 125-133

7 Zhang L， Tong P， Chen G N. J. Chromatogr. A， 2005， 1098（1-2）： 194-198

8 ZHANG LingYi， REN Jun， PENG Li， LIU Fan， ZHANG WeiBing. Chinese J. Anal. Chem.， 2015， 43（10）： 1545-1550

張凌怡， 任 俊， 彭 麗， 劉 翻， 張維冰. 分析化學(xué)， 2015， 43（10）： 1545-1550

9 Chen Y F， Xu L L， Zhao W W， Guo L P， Yang L. Anal. Chem.， 2012， 84（6）： 2961-2967

10 Kanoatov M， Galievsky V A， Krylova S M， Cherney L T， Jankowski H K， Krylov S N. Anal. Chem.， 2015， 87（5）： 3099-3106

11 Chen Q H， Hou S X， Zheng J， Bi Y Q， Li Y B， Yang X J， Cai Z， Song X R. J. Chromatogr. B， 2007， 858（12）： 199-204

12 Dodge F D. In the Meeting at New Orleans， 1915： 446-448

13 Kuban P， Engstrm A， Olsson J C， Thorsén G， Tryzell R， Karlberg B. Anal. Chim. Acta， 1997， 337（2）： 117-124

14 Fang Z L， Liu Z S， Shen Q. Anal. Chim. Acta， 1997， 346（2）： 135-143

15 Chen H L， Wang K T， Pu Q S， Chen X G， Hu Z D. Electrophoresis， 2002， 23（17）： 2865-2871

16 Cheng Y Q， Fan L Y， Chen H L， Chen X G， Hu Z D. J. Chromatogr. A， 2005， 1072（2）： 259-265

17 Fan L Y， Cheng Y Q， Li Y Q， Chen H L， Chen X G， Hu Z D. Electrophoresis， 2005， 26（22）： 4345-4354

18 Liu X M， Zhang J S， Chen X G. J. Chromatogr. B， 2007， 852（12）： 325-332

19 Liu X M， Liu L H， Chen H L， Chen X G. J. Pharm. Biomed. Anal.， 2007， 43（5）： 1700-1705

20 Liu L H， Fan L Y， Chen H L， Chen X G， Hu Z D. Electrophoresis， 2005， 26（15）： 2999-3006

21 Pan Z W， Chen X G， Hu Z D. Biomed. Chromatogr.， 2004， 18（8）： 581-588

22 Zhu H D， Lü W J， Li H H， Ma Y H， Hu S Q， Chen H L， Chen X G. Analyst， 2011， 136： 1322-1328

23 Hartwell S K， Kehling A， Lapanantnoppakhun S， Grudpan K. Anal. Lett.， 2013， 46（11）： 1640-1671

24 Clavijo S， Avivar J， Suárez R， Cerd V. TrAC， Trends Anal. Chem.， 2015， 67： 26-33

25 Palmer J， Munro N J， Landers J P. Anal. Chem.， 1999， 71（9）： 1679-1687

26 Quirino J P， Terabe S. Science， 1998， 282（5388）： 465-468

27 Quirino J P， Terabe S. Anal. Chem.， 1999， 71（8）： 1638-1644

28 Quirino J P， Terabe S， Bocek P. Anal. Chem.， 2000， 72（8）： 1934-1940