夏曉燕,吳 亞,吳 健

(江蘇省鹽城市第一人民醫(yī)院：1.血液科實(shí)驗(yàn)室;2.骨科;3.檢驗(yàn)科 224001)

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·臨床研究·

姜黃素對人骨肉瘤MG-63細(xì)胞生長抑制及對MAPK基因調(diào)控作用的探討*

夏曉燕1,吳 亞2△,吳 健3

(江蘇省鹽城市第一人民醫(yī)院：1.血液科實(shí)驗(yàn)室;2.骨科;3.檢驗(yàn)科 224001)

目的 研究姜黃素對人成骨肉瘤細(xì)胞MG-63的生長抑制作用，并檢測對骨肉瘤細(xì)胞中MAPK基因表達(dá)的調(diào)控作用，初步明確姜黃素對骨肉瘤細(xì)胞的作用機(jī)制。方法 以人骨肉瘤細(xì)胞株MG-63為研究對象，采用不同劑量姜黃素處理。MTT法檢測5、10、15、20、25、30、35、40、50 μmol/L姜黃素作用24、48、72 h對細(xì)胞的毒性作用；Transwell小室侵襲試驗(yàn)法檢測5、10、15 μmol/L姜黃素對細(xì)胞的侵襲能力，黏附試驗(yàn)法檢測對細(xì)胞的黏附能力；Western blot法檢測5、10、15 μmol/L姜黃素作用后MAPK蛋白表達(dá)水平的影響，RT-PCR法檢測對細(xì)胞中MAPK基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響。結(jié)果 姜黃素(濃度>15 μmol/L，作用時(shí)間>24 h)對骨肉瘤細(xì)胞的生長抑制呈時(shí)間和劑量依賴性，濃度≤15 μmol/L，作用時(shí)間為24 h時(shí)，對骨肉瘤細(xì)胞無明顯毒性作用；細(xì)胞侵襲能力和黏附能力隨著姜黃素濃度的增加而逐漸降低，以15 μmol/L姜黃素濃度處理效果最明顯(P<0.05)；姜黃素可明顯抑制MAPK基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平，其抑制作用與劑量呈高度依賴性(P<0.05)。結(jié)論 姜黃素可以通過調(diào)控MAPK基因表達(dá)降低人骨肉瘤細(xì)胞株MG-63的侵襲性。

姜黃素； 骨肉瘤； MAPK基因； 侵襲

骨肉瘤是骨組織最常見的原發(fā)性腫瘤，多發(fā)于青少年并且惡性程度高[1-2]。目前治療骨肉瘤的方法主要是新輔助化療和手術(shù)，其5年生存率仍然維持在60%～70%，無明顯提高。這主要是對骨肉瘤發(fā)病機(jī)制尚不清楚所致。近年來，隨著分子生物學(xué)與遺傳學(xué)的研究，為骨肉瘤發(fā)病機(jī)制的研究提供了幫助。

絲裂原激活的蛋白激酶是重要的信號(hào)級(jí)聯(lián)分子之一，也是多種信號(hào)通路的中心，在許多細(xì)胞增殖相關(guān)信號(hào)通路中起著關(guān)鍵的作用[3-4]。在未受到特異性細(xì)胞刺激時(shí)，MAPK處于靜止?fàn)顟B(tài)。當(dāng)受到生長因子等相關(guān)因素刺激后，MAPK接收MKK和MKKK的活化信號(hào)而被激活，表現(xiàn)為逐級(jí)磷酸化，進(jìn)而轉(zhuǎn)入細(xì)胞核內(nèi)活化一些原癌基因，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖，阻礙細(xì)胞凋亡[5-6]。所以目前定義為1種癌基因[7]。同時(shí)，MAPK也在腫瘤微環(huán)境中高表達(dá)，所以，抑制腫瘤細(xì)胞及其微環(huán)境細(xì)胞MAPK表達(dá)被認(rèn)為是腫瘤治療的1個(gè)靶點(diǎn)。

姜黃素是1種天然植物多酚類色素，從姜科植物姜黃中提取，也存在其他姜科植物中，廣泛存在于我國傳統(tǒng)中藥姜黃的根莖中。已有研究證實(shí)，姜黃素是安全有效的MAPK的1種抑制劑，如在T細(xì)胞白血病中[8-9]。姜黃素通過抑制MAPK上游JAK激酶的活性，從而阻止了MAPK的組成性磷酸化，在骨肉瘤中，姜黃素是否能通過抑制MAPK信號(hào)通路從而阻止腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移，至今尚未見明確報(bào)道。本試驗(yàn)通過對不同濃度姜黃素對人成骨肉瘤細(xì)胞MG-63細(xì)胞MAPK表達(dá)的影響，進(jìn)一步探討影響骨肉瘤侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制,為姜黃素應(yīng)用于臨床治療骨肉瘤提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器及試劑 人成骨肉瘤細(xì)胞MG-63由中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所提供，姜黃素購自中國藥品生物制品檢定所，MTT購自美國Sigma公司，RPMI1640培養(yǎng)基購自美國GIBCO公司，Transwell小室購自Milliproe公司，PCR引物及BSA稀釋液由上海生工合成，ReverTraAce-α-RT-PCR kit購自TOYOBO公司，蛋白干粉購自中國博士德公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) MG-63細(xì)胞生長在10%胎牛血清(FBS)的RPMI1640培養(yǎng)基，37 ℃、5%CO2環(huán)境放置細(xì)胞培養(yǎng)箱，當(dāng)細(xì)胞生長至80%融合時(shí)，用0.25%胰消化酶傳代。

1.2.2 MTT法檢測姜黃素處理細(xì)胞殺傷力 將對數(shù)生長期細(xì)胞，分別加入4×103個(gè)細(xì)胞在96孔板每孔中，按照王曉飛等[10]試驗(yàn)方法分組及操作程序后，在490 nm波長處酶標(biāo)儀測定光密度A值，按以下公式計(jì)算細(xì)胞生存率(%)，并進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)2次。細(xì)胞生存率(%)=(試驗(yàn)組A490-空白對照組A490)/試驗(yàn)對照組A490×100%。

1.2.3 Transwell小室侵襲試驗(yàn)法檢測姜黃素對細(xì)胞侵襲能力 將對數(shù)生長期細(xì)胞按以下分組：陰性對照組(0.1%DMSO)；姜黃素5 μmol/L處理組；姜黃素10、15 μmol/L處理組；姜黃素15 μmol/L處理組。參考王曉飛等[10]方法進(jìn)行Transwell小室侵襲試驗(yàn)步驟進(jìn)行。

1.2.4 黏附試驗(yàn)法檢測姜黃素對細(xì)胞的黏附能力 按以上試驗(yàn)分組對細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理，配制纖維連接蛋白溶液終濃度為10 μg/mL，包被96孔細(xì)胞，每孔50 μL加入培養(yǎng)板，密封，4 ℃12 h；PBS連續(xù)洗滌5次，加入RPMI1640培養(yǎng)基，50 μL/孔，37 ℃封閉2 h；再用0.25%胰酶消化細(xì)胞，細(xì)胞濃度調(diào)至為2×104個(gè)/孔，再孵育1.5 h；PBS連續(xù)洗滌5次，加入2 mg/mL MTT，50 μL/孔，孵育3 h；棄去MTT，每孔加入DMSO 150 μL，振蕩15 min，酶標(biāo)儀490 nm測定A值，按以下公式計(jì)算黏附細(xì)胞量:黏附細(xì)胞量=試驗(yàn)組A490-陰性對照組A490。

1.2.5 Western blot法檢測姜黃素對骨肉瘤細(xì)胞MAPK和P-MAPK蛋白表達(dá) 將MG-63細(xì)胞按1×104個(gè)/cm2接種到培養(yǎng)瓶中，貼壁后按以下4組加入相應(yīng)的藥物：陰性對照組(0.1%DMSO)，姜黃素(5、10、15 μmol/L)處理組。培養(yǎng)24 h后再提取細(xì)胞蛋白，10%SDS-PAGE分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，封閉后用TBST洗5次，每次5 min，敷一抗4 ℃12 h后，TBST洗5次，每次10 min，敷二抗，室溫?fù)u床振蕩1 h，TBST洗5次，每次10 min。ECL成像系統(tǒng)成像，拍照。

1.2.6 RT-PCR法檢測姜黃素對細(xì)胞中MAPK基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響 將MG-63細(xì)胞按2×105個(gè)/cm2接種至6孔板中，貼壁后再按1.2.5項(xiàng)4組給藥。培養(yǎng)24 h后，提取細(xì)胞總RNA進(jìn)行測定，用ReverTraAce-α-RT-PCR kit將其逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，總體系為20 μL，99 ℃進(jìn)行5 min，4 ℃進(jìn)行5 min，將cDNA引物在-20 ℃保存。引物(序列見表1)購自上海生工生物工程股份有限公司。β-action基因作為內(nèi)參物。反應(yīng)條件如下：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃再變性30 s，退火30 s(MAPK 55 ℃)，72 ℃延伸2 min，循環(huán)進(jìn)行26次；72 ℃環(huán)境延伸10 min，瓊脂糖電泳鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物，成像系統(tǒng)進(jìn)行圖像數(shù)據(jù)分析。

表1 RT-PCR引物序列

2 結(jié) 果

2.1 姜黃素對細(xì)胞殺傷力 姜黃素濃度15 μmol/L，時(shí)間24 h為作用臨界點(diǎn)，當(dāng)姜黃素濃度>15 μmol/L，作用時(shí)間>24 h，細(xì)胞生長抑制和時(shí)間、劑量呈依賴性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；當(dāng)姜黃素濃度≤15 μmol/L，時(shí)間≤24 h時(shí)，姜黃素對細(xì)胞毒性作用差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，細(xì)胞存活率大于85%。見表2。以姜黃素濃度≤15 μmol/L，作用時(shí)間為≤24 h時(shí)為侵襲和黏附試驗(yàn)的條件。

表2 各組濃度梯度姜黃素對MG-63細(xì)胞作用后的抑制率

注：與5、10、15 μmol/L比較,*P<0.05；與5、10 μmol/L比較,△P<0.05；與5、10、20、25 μmol/L比較,◇P<0.05；與5、15、20、25 μmol/L相比,#P<0.05；與24 h相比,■P<0.05；與48 h相比,●P<0.05。

2.2 姜黃素對細(xì)胞侵襲能力結(jié)果 對照組及5、10、15 μmol/L姜黃素處理組細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)分別是(445.33±35.17)、(311.13±37.66)、(190.15±16.16)和(125.43±7.98)/視野。與對照組相比，穿膜細(xì)胞數(shù)隨著姜黃素藥物濃度的增加而逐漸減少，以15 μmol/L組試驗(yàn)效果最明顯，試驗(yàn)各組之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=84.76，P<0.05)，見圖1。

2.3 姜黃素對細(xì)胞黏附能力結(jié)果 對照組及5、10、15 μmol/L姜黃素處理組的細(xì)胞黏附量分別是(1.425±0.049)、(0.856±0.012)、(0.498±0.029)和(0.313±0.016)。與對照組相比，細(xì)胞黏附能力隨著姜黃素藥物濃度的增加而呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢，15 μmol/L處理組作用效果最明顯，各試驗(yàn)組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=368.72，P<0.01)。

注：A表示陰性對照組；B表示5 μmol/L姜黃素處理組；C表示10 μmol/L姜黃素處理組；D表示15 μmol/L姜黃素處理組。

圖1 姜黃素對MG-63細(xì)胞體外侵襲能力的影響(×100)

2.4 MAPK和P-MAPK蛋白表達(dá)水平 P-MAPK表達(dá)隨著姜黃素濃度的增加，抑制作用逐漸增強(qiáng)，且與劑量呈高度相關(guān)性，其中15 μmol/L組效果最明顯，各試驗(yàn)組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=109.52，P<0.05)。而總MAPK蛋白水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖2、3。

圖2 姜黃素對MG-63細(xì)胞中MAPK蛋白表達(dá)的影響

圖3 Western blot檢測姜黃素處理后MG-63

圖4 姜黃素對MG-63細(xì)胞中MAPK基因

2.5 MAPK基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平 姜黃素對MAPK基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平的抑制作用隨著藥物濃度的增加而增強(qiáng)，與姜黃素劑量呈高度相關(guān)性，5、10、15 μmol/L姜黃素處理組細(xì)胞中MAPK基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平分別為0.525±0.157、0.289±0.062、0.055±0.002。與對照組0.820±0.145比較，轉(zhuǎn)錄水平明顯降低，以15 μmol/L試驗(yàn)組效果最明顯(t=9.766，P<0.01)，各試驗(yàn)組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=25.166，P<0.05)，見圖4。

3 討 論

目前已被證實(shí)，MAPK在多種腫瘤細(xì)胞和腫瘤微環(huán)境中各種細(xì)胞高表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞及其微環(huán)境各種基質(zhì)細(xì)胞MAPK已被公認(rèn)為腫瘤治療的靶點(diǎn)[11-12]。本研究為了探討姜黃素通過抑制MAPK信號(hào)通路以及MAPK基因表達(dá)對人成骨肉瘤細(xì)胞MG-63細(xì)胞侵襲的抑制作用，以MG-63為研究對象，采用不同劑量姜黃素處理，利用MTT法檢測不同濃度姜黃素作用細(xì)胞株后對細(xì)胞的毒性作用，采用Transwell小室侵襲試驗(yàn)法檢測了不同濃度姜黃素作用后細(xì)胞侵襲能力的影響，進(jìn)行黏附試驗(yàn)檢測細(xì)胞黏附能力的改變。試驗(yàn)顯示，姜黃素濃度15 μmol/L，作用時(shí)間24 h為作用臨界點(diǎn)，姜黃素濃度>15 μmol/L，作用時(shí)間>24 h細(xì)胞的生長抑制與時(shí)間和劑量呈依賴性，當(dāng)濃度≤15 μmol/L，作用時(shí)間為24 h時(shí)，對細(xì)胞無明顯毒性作用，細(xì)胞侵襲能力、黏附能力隨著姜黃素濃度增加而逐漸降低，其中15 μmol/L姜黃素處理效果最好。

本次研究采用Western blot法檢測不同濃度作用細(xì)胞株后MAPK及P-MAPK蛋白水平的變化，還采用RT-PCR檢測了不同濃度姜黃素作用細(xì)胞株后MAPK基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響，顯示姜黃素可明顯抑制MAPK基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平，其抑制作用呈劑量依賴性。

Cyclin D1為MAPK為表達(dá)的下游基因，受到MAPK的活化的調(diào)節(jié)來影響人成骨肉瘤細(xì)胞的侵襲過程，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移[13-16]。本研究通過姜黃素抑制MAPK信號(hào)通路的活性及此信號(hào)通路靶基因MAPK的表達(dá)明顯減弱，嘗試可以從源頭上防止P-MAPK信號(hào)傳導(dǎo)途徑誘導(dǎo)Cyclin D1過度表達(dá)，從而導(dǎo)致成骨肉瘤產(chǎn)生的影響提供理論依據(jù)，這將為臨床藥物抗腫瘤治療及基因干擾治療提供了1種可能，開辟1條新的重要途徑[17-18]。但是本次研究僅限于體外試驗(yàn)，而姜黃素能否在體內(nèi)安全濃度范圍內(nèi)發(fā)揮其抗癌作用還需要進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，這也是下一步的研究方向。

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江蘇省鹽城市科技立項(xiàng)支持項(xiàng)目(2015003)。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.20.033

A

1673-4130(2016)20-2884-04

2016-05-07

2016-07-15)

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