魏曉愛 姚文靜 姜廷波 周博如

(林木遺傳育種國家重點實驗室(東北林業(yè)大學)，哈爾濱，150040)

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擬南芥WRKY基因家族應答非生物脅迫基因的鑒定1)

魏曉愛 姚文靜 姜廷波 周博如

(林木遺傳育種國家重點實驗室(東北林業(yè)大學)，哈爾濱，150040)

WRKY轉錄因子家族是植物特有的一類轉錄因子家族，在植物生長發(fā)育和應答各種脅迫反應過程中起重要作用。為篩選和鑒定植物抗逆關鍵基因，以擬南芥(Arabidopsisthaliana)WRKY家族基因為研究對象，從數(shù)據(jù)庫中搜索到72個擬南芥WRKY基因，通過生物信息學分析，根據(jù)其結構特點，可將其分為3大類：GroupI、GroupII和GroupIII。其中，GroupII又可分為5個亞類：IIa、IIb、IIc、IId和IIe。用實時定量RT-PCR篩選出30個應答鹽脅迫的基因，其中上調表達的23個，下調表達的7個。

擬南芥；WRKY轉錄因子；非生物脅迫

WRKY轉錄因子是植物所特有的一類轉錄因子[1]，1994年Ishiguro et al[2]從甘薯中克隆得到第一個WRKY轉錄因子SPF1，隨后相繼在野燕麥、擬南芥、煙草(NicotianatabacumL.)和水稻(OryzasativaL.)中克隆得到WRKY。最新研究表明:在原生生物、粘菌及綠藻中也有WRKY轉錄因子的存在,高等植物的WRKY基因源于早期的真核生物，并在進化過程中經(jīng)歷的多次加倍和擴張[3]。WRKY轉錄因子具有1～2個包含標志性WRKYGQK肽段的WRKY結構域，該結構域由大約60個高度保守的氨基酸殘基組成，能夠與DNA序列中W-box結合，在WRKY結構域C末端還具有一個鋅指結構(CX4-5CX22-23HX1H型或CX7CX23HX1C型)，是決定WRKY蛋白是否能夠和相關基因順式作用元件W-box(TTGACT/C)結合的關鍵因素[4-5]。數(shù)量龐大的WRKY基因家族在調控植物生長發(fā)育、物質代謝和響應各種逆境脅迫的應答中具有重要作用[6]，目前在擬南芥中發(fā)現(xiàn)72個，水稻中105個，玉米(ZeamaysL.)119個，楊樹(Populus)104個，油菜(BrassicacampestrisL.)46個，胡蘿卜(DaucuscarotaL.)中有95個WRKY基因[7-11]。目前,人們主要基于轉錄組分析、實時熒光定量PCR、Northern雜交等技術分析WRKY基因在非生物脅迫下的表達模式，并初步預測WRKY基因的相關功能，有的WRKY基因通過進一步的遺傳轉化驗證了其在調控植物免疫反應應答中的具體功能[12]，現(xiàn)在普遍認為植物耐鹽性是多種抗鹽生理性狀的綜合表現(xiàn)，由位于不同染色體上多個基因控制的數(shù)量性狀[13]。本研究以72個擬南芥WRKY基因為研究對象，分析其在NaCl脅迫24 h下的表達情況，為進一步研究WRKY轉錄因子的功能提供參考。

1 試驗材料

本研究所用擬南芥(Arabidopsisthaliana)為Col-0(Columbia-0)。首先4 ℃春化2～3 d，播種于人工混合土中(V(黑土)∶V(蛭石)∶V(珍珠巖)=5∶3∶2，并121 ℃高溫滅菌40 min)，補足水分并蓋上保鮮膜，置于正常植物光照培養(yǎng)室培養(yǎng)，設置光照16 h，黑暗8 h，光照強度2 500～5 000 lx，溫度22～24 ℃，濕度為70%，3～4 d后揭下保鮮膜，確保水分供應充足。將4周左右的擬南芥幼苗用150 mmol/L的NaCl處理24 h，用水處理作對照，采集葉片,用于RNA提取或于冰箱中-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2 試驗方法

2.1 RNA的提取

用柱式植物RNAout(TIANDZ Corp,Beijing,China)試劑盒法提取擬南芥總RNA，具體步驟參照附帶的說明書，用瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop 2000c的分光光度計(NanoDrop Technologies,WilmingtonDE,USA)檢測總RNA的質量與濃度，用RNA反轉錄試劑盒(TaKaRa Corp.,Dalian,China)合成cDNA，稀釋5倍作為RT-qPCR的模板，用于檢測基因的表達水平。

2.2 應答鹽脅迫基因的篩選

從PlantTFDB數(shù)據(jù)庫中獲得72個擬南芥WRKY轉錄因子基因信息，用RT-qPCR分析其在150 mmol/L NaCl處理24 h的表達情況。實時定量PCR在7500 real-time PCR system(Applied Biosystems)上進行，以ACT作為內(nèi)參[14]。RT-qPCR的20 μL體系包含10 μL的SYBR Premix Ex Taq II(TaKaRa)，0.4 μL的ROX ReferenceDye II(TaKaRa)，正向引物(10 μmol/L)和反向引物(10 μmol/L)各0.8 μL(引物終濃度為0.4 μmol/L)，2 μL的cDNA模板(100 ng以下)和6 μL的無菌水。RT-qPCR的反應程序如下：預變性(95 ℃ 30 s)，變性(95 ℃ 5 s)，退火(60 ℃ 34 s)，25個循環(huán)，然后進行熔解曲線分析[15]。用-ΔΔCt值來計算基因相對表達水平[14]，用F值(2-ΔΔCt)來計算基因相對表達量。

2.3 生物信息學分析

利用NCBI在線搜索程序確定擬南芥轉錄因子家族基因的開放閱讀框(ORF)[16]，預測編碼的氨基酸序列及蛋白質的分子量和等電點；用MEGA6.0來繪制鄰接(Neighbor-joining，N-J)系統(tǒng)進化樹[17];用NCBI的Conserved Domains(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)程序預測蛋白質結構域。

3 結果與分析

3.1 擬南芥WRKY轉錄因子家族系統(tǒng)進化分析

利用MEGA6.0構建擬南芥72個WRKY轉錄因子家族蛋白的系統(tǒng)進化樹，可將其分成3大類：12個屬于GroupI，45個屬于GroupII，14個屬于GroupIII，還有一個獨立的基因AtWRKY59。其中，GroupII又可分為5個亞類：IIa、IIb、IIc、IId和IIe，分別包含8、8、14、7、8個基因(圖1，表1)。WRKY家族蛋白最重要的特征是具有高度保守的WRKY結構域。用Conserved Domains程序分析擬南芥WRKY轉錄因子蛋白的氨基酸序列，表明WRKY結構域在WRKY家族蛋白中高度保守，但其結構域數(shù)量在不同類型中有所不同，有些WRKY蛋白還有不同的鋅指結構，有的是C2H2(CX4-5CX22-23HXH)型，有的是C2HC(CX7CX23HXC)型。結構域的數(shù)量及類型和鋅指結構類型是WRKY家族蛋白分類的重要依據(jù)。GroupI中的轉錄因子含有兩個WRKY結構域和C2H2型鋅指結構，GroupII中的轉錄因子含有一個WRKY結構域和C2H2型鋅指結構，GroupIII中的轉錄因子含有一個WRKY結構域和C2HC型鋅指結構。

圖1 擬南芥WRKY轉錄因子家族蛋白的進化樹

3.2 擬南芥WRKY轉錄因子家族蛋白質理化性質

不同WRKY蛋白的氨基酸數(shù)目變化明顯，理化性質不同，分子質量范圍在12.95～200.00 ku，理論等電點的范圍在4.01～10.41，并且不同酸堿性蛋白在不同類別中的分布差異較大。在GroupI的12個蛋白中有7個屬于堿性，3個酸性，2個中性。在GroupIIa的8個蛋白中有5個屬于堿性，3個酸性。在GroupIIb的8個蛋白中有1個屬于堿性，3個酸性，4個中性。在GroupIIc的14個蛋白中有11個屬于堿性，2個酸性，1個中性。GroupIId的7個蛋白均屬堿性。在GroupIIe的8個蛋白中有1個屬于堿性，6個酸性，1個中性。在GroupIII的14個蛋白中有2個屬于堿性，12個酸性。不同類型WRKY蛋白間的差異可能與其具有不同的生物功能和參與的不同生理過程密切相關(表1)。

表1 擬南芥WRKY家族蛋白理化性質和相對表達量

3.3 擬南芥應答鹽脅迫WRKY基因的篩選

用實時定量RT-qPCR檢測NaCl脅迫24 h擬南芥WRKY轉錄因子基因的表達模式，將基因相對表達量大于2倍定義為上調表達，小于0.5倍定義為下調表達，介于上述兩者之間的定義為沒發(fā)生明顯變化。結果表明：在72個基因中有30個(40.5%)鹽脅迫應答基因，23個為上調表達基因，7個為基因下調表達。結合系統(tǒng)進化樹分析發(fā)現(xiàn)，上調表達基因有4個分布在GroupI，14個分布在GroupII(GroupIIa中2個，GroupIIb中3個，GroupIIc中8個，GroupIIe中1個)，4個分布在GroupIII，1個單獨存在。而7個下調表達的基因中有1個分布在GroupIIb，1個分布GroupIId，2個分布在GroupIIe，3個分布在GroupIII(表1)?？梢姡险{表達的基因在GroupIIc中比例最高，占57.1%；其次是GroupIIb，占37.5%。下調表達的基因在GroupIIe和GroupIII中比例較高，分別占25%和21.4%(表2)。

表2 應答鹽脅迫WRKY基因在不同組中的分布

3.4 應答鹽脅迫基因與其編碼蛋白酸堿性的關系

擬南芥72個WRKY轉錄因子等電點范圍在4.01～10.41，而30個應答鹽脅迫的轉錄因子等電點范圍在4.68～10.30(表3)。在23上調表達的轉錄因子中有19個等電點的范圍在5.89～8.47，占總數(shù)的82.6%。在7個下調表達的轉錄因子中有3個等電點在5.12～5.47，有2個等電點分別為6.36和7.03。可見，在鹽脅迫條件下，上調表達的WRKY轉錄因子基因編碼蛋白的pH值多在5.89～8.47，多數(shù)屬中性蛋白；上調表達基因編碼蛋白的pH值多在5.12～7.03，多數(shù)屬酸性蛋白。

表3 應答鹽脅迫WRKY蛋白的酸堿性及分布

4 結論與討論

植物在逆境條件下，其體內(nèi)會發(fā)生一系列的生理生化變化以適應逆境，一些抗逆相關基因也會大量表達，以感應傳導逆境脅迫的信號和適應脅迫環(huán)境，如蛋白激酶、轉錄因子蛋白和抗逆相關蛋白等[18-20]，WRKY轉錄因子基因在植物響應逆境脅迫和信號轉導過程中起著非常重要的調控作用[21]。本研究為了解擬南芥WRKY轉錄因子的結構及其與應答鹽脅迫的關系，對72個WRKY轉錄因子蛋白進行生物信息學分析，根據(jù)其WRKY結構域數(shù)量和鋅指結構特點分為3大類GroupI、GroupII和GroupIII，其中GroupII又可分為IIa、IIb、IIc、IId和IIe 5個亞類；WRKY轉錄因子在植物中廣泛參與抗病反應、信號轉導、生長發(fā)育、形態(tài)建成等過程[22-26]。不同擬南芥WRKY轉錄因子蛋白的理化性質差異很大，其氨基酸數(shù)目在109～1 798，分子質量在12.95～200.00 ku，理論等電點介于4.01～10.41。這是不同擬南芥WRKY轉錄因子具有不同生物功能的分子基礎，預示著WRKY基因可能參與不同的生理過程。在72個擬南芥WRKY轉錄因子基因中，有42個基因對鹽脅迫反應不明顯，在30個應答鹽脅迫的基因中有23個上調表達基因，7個基因下調表達。

目前，有關WRKY轉錄因子基因提高植物抗逆能力的研究較多，但主要集中在抗病反應上。Dong et al[27]研究72個擬南芥的WRKY轉錄因子與抗病的關系，發(fā)現(xiàn)有49個受病原菌Pseudomonas syringae pvtomato(Pst)和SA誘導，進而調節(jié)相關抗病基因的表達。如擬南芥過量表AtWRKY70基因會增加其對Pst的抗性，反之，如果抑制AtWRKY70的表達，就會增加擬南芥對E.c.carotovora的敏感性[28]。擬南芥中的AtWRKY38、AtWRKY62、AtWRKY11、AtWRKY17對病原菌抗性具有負調控作用，插入突變沉默這些基因的擬南芥對病原菌的抗性增強，而過量表達AtWRKY38、AtWRKY62擬南芥對病原菌的抗性減弱[29]。歐美雜交楊Pnd-WRKY3基因在銹菌侵染后表現(xiàn)出抗病反應[30]。

植物WRKY基因廣泛參與植物的鹽脅迫。用150 mM NaCl處理擬南芥根系，有18個AtWRKY基因被誘導表達[31]。干旱和NaCl處理使擬南芥AtWRKY25和AtWRKY33的表達量提高，并且AtWRKY33缺失突變體和AtWRKY25、AtWRKY33雙缺失突變體會增加植株對NaCl脅迫的敏感性，而超表達其中任何一個基因則會提高對NaCl脅迫的抗性[32]。NaCl脅迫可強烈誘導TcWRKY53的表達[33]。小麥TaWRKY10通過調節(jié)滲透平衡，活性氧清除和逆境相關基因的轉錄在鹽脅迫的過程中起作用[34]。過表達GmWRKY5的轉基因擬南芥可通過轉錄因子STZ/Zat10的調控增強耐鹽性，但過表達GmWRKY13的轉基因擬南芥對鹽脅迫的敏感性提高[21]。在煙草中過表達棉花GhWRKY39-1可提高轉基因植物對鹽脅迫的耐性[35]。胡蘿卜DcWRKY27和DcWRKY30基因可響應鹽脅迫[11]。本研究對擬南芥WRKY轉錄因子進行生物信息學分析，并利用RT-qPCR篩選出30個應答鹽脅迫的基因，可為進一步分析這些基因的功能提供參考依據(jù)。

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Identification ofWRKYGene in Response to Abiotic Stress from WRKY Transcription Factor Gene Family ofArabidopsisthaliana//

Wei Xiaoai, Yao Wenjing, Jiang Tingbo, Zhou Boru

(Northeast Forestry University, Harbin 150040, P. R. China)//Journal of Northeast Forestry University，2016,44(10)：45-48,55.

For screening and identifying stress-related genes inArabidopsisthaliana, theWRKYgene families were as study object, and 72WRKYgenes were explored from the database ofA.thaliana, and the structure characteristics were analyzed by bioinformatics. WRKY family was further divided into three groups: GroupI， GroupII and GroupIII. The gene members in GroupII were further divided into five sub-groups: IIa, IIb, IIc, IId, IIe. The differential expression of WRKY genes were determined by real-time RT-PCR. There were 30 genes response to salt stress, of which 23 were up-regulated genes, and 7 were down-regulated genes.

Arabidopsisthaliana; WRKY transcription factor; Abiotic stress

魏曉愛，女，1990年2月生，林木遺傳育種國家重點實驗室(東北林業(yè)大學)，碩士研究生。E-mail：15244689083@163.com。

周博如，林木遺傳育種國家重點實驗室(東北林業(yè)大學)，副教授。E-mail:boruzhou@yahoo.com。

2016年2月19日。

Q78;S332.1

1)卓越農(nóng)林人才教育培養(yǎng)計劃改革試點項目。

責任編輯：潘 華。