陳科陳素萍

（1. 湖南環(huán)境生物職業(yè)技術學院，湖南衡陽 421005；2.南華大學附屬第一醫(yī)院，湖南衡陽 421001）

功能性納米材料在電化學免疫傳感器中的應用

陳科1陳素萍2

（1. 湖南環(huán)境生物職業(yè)技術學院，湖南衡陽 421005；2.南華大學附屬第一醫(yī)院，湖南衡陽 421001）

免疫傳感器是基于親合作用，將選擇性免疫反應與適合的信號轉(zhuǎn)換技術結(jié)合起來，用以監(jiān)測抗原-抗體反應的生物傳感器，逐漸在許多領域得到快速發(fā)展和廣泛應用。在近年來的電化學免疫傳感器主要研究方向，大致上是提升靈敏度、精確性、選擇性、加速反應時間，而本文將使用單壁納米碳管當作電極，利用其具備良好的導電性、超高表面積比，透過改質(zhì)后的納米碳管管壁與管端可與生物分子鍵結(jié)，且保持生物分子的活性，極具電化學免疫傳感器的象征意義。本文將具體結(jié)合相關理論和分析，對功能性納米材料在電化學免疫傳感器中的應用進行研究。

功能性 納米材料 電化學 免疫傳感器

免疫傳感器的一般工作原理為固定在換能器上的抗體（抗原）對樣品介質(zhì)中的抗原（抗體）進行選擇性免疫識別，并且產(chǎn)生隨分析物濃度的變化而變化的分析信號。在抗體的不同區(qū)域和抗原決定簇之間的高選擇性反應主要包括疏水力、靜電作用力、凡德瓦爾力和氫鍵作用力。近年來納米材料在電化學免疫傳感器上的應用也發(fā)展得相當迅速。由于納米材料具有表面積大、表面反應活性高、表面活性中心多、催化效率高和吸附能力強等優(yōu)異性質(zhì)，將納米微粒應用于電化學免疫傳感器中，可以提高傳感器測量的靈敏度、準確性、減少采血量和檢測時間［1］。作為免疫分析技術的一個重要分支，免疫傳感器除了具有傳統(tǒng)免疫分析方法所共有的性能特點外，還具有高選擇性、高靈敏度、可逆性和 詴劑利用的高效率等優(yōu)點。另外，免疫傳感器大都制備簡單，便于實現(xiàn)自動化、數(shù)字化和微型化，因此可以避免傳統(tǒng)免疫分析方法所附帶的一系列問題，故在臨床分析、環(huán)境分析和生物監(jiān)測過程中顯示了強大的應用潛力［2］。因為免疫傳感器常用來測量源于分析物和固定的抗體/抗原之間的反應而產(chǎn)生的信號，所以將抗體（抗原）固定在原始換能器表面的固定化過程在免疫傳感器制備中有著重要的作用。大量的固定法已用于各種免疫傳感器，如靜電吸附、包覆法、交聯(lián)法、共價鍵結(jié)合法等。

1 電化學免疫傳感器的工作原理

由于電化學免疫傳感器具有高靈敏度、低成本和便攜等優(yōu)點，成為免疫傳感器中研究最早、種類最多，也較為成熟的一個分支。電化學免疫傳感器的基本工作原理是：采用電化學檢測方法來檢測標記的免疫 詴劑或一些由酶、金屬離子和其它電活性物質(zhì)標記的標記物，從而對疾病診斷或病人狀態(tài)監(jiān)測中復雜系統(tǒng)的多組混合物進行分析提供有力數(shù)據(jù)［3］。用于電化學免疫傳感器檢測中的換能器主要分為電位型、電導型、電容型、阻抗型和安培型等裝置。電位型傳感器現(xiàn)在已經(jīng)被公認為是一種成熟的傳感器，已有大量的商品化產(chǎn)品。對于電位型傳感器，當電流流動為臨界點時，換能器界面處于平衡狀態(tài)，此時電極或者表面修飾膜的電位變化與溶液中特定金屬離子活性呈對數(shù)比例關系，這就是電位型換能器的基本工作原理。這類生物傳感器具備制備簡單、操作容易及選擇性良好的優(yōu)點［4］。

2 功能性納米材料技術

與塊狀物質(zhì)相比，金屬和金屬氧化物納米粒子由于其新穎的材料特性，近年來已被廣泛研究。少于50個金屬原子小團簇可以產(chǎn)生像大分子一樣的效果，但大于300個原子的大團簇表現(xiàn)出大體積樣品的性質(zhì)，介于這兩種極端之間的材料，通常為納米材料，有許多未知的化學和物理性質(zhì)，這也是許多研究一直集中于納米材料的一個原因。納米材料具有依賴于其尺度的光、電和化學性能［5］。納米材料可以應用到許多領域，如光學器件、電子器件、催化、感測技術、生物分子標記等。考慮納米粒子的優(yōu)點，如大面積、高催化性和良好的親和性，如今，多種納米材料已被用來包覆蛋白質(zhì)。常用的有納米碳管（CNTs）、金膠體（Au colloidal）、量子點以及納米二氧化鈦。CNTs自從1991年被發(fā)現(xiàn)以來，引起了一股研究熱潮。納米直徑的圓筒形石墨片狀的CNTs具備高電導率、良好的化學穩(wěn)定性、非常顯著的機械強度和成模性。納米碳管可以與DNA分子自組裝（self-assembly）。根據(jù)理論預測與實驗驗證，DNA/CNTs 層可作為新的電子材料［6］。由于DNA溶液可以膠化，混合的DNA/CNTs層能夠在金屬電極表面保持穩(wěn)定，可以用來研究一些電化學現(xiàn)象或檢測一些蛋白質(zhì)性質(zhì)。此外，帶正電荷的蛋白質(zhì)可被固定在帶大量負電荷的DNA修飾層上。多壁納米碳管與DNA混合后，可成功地固定在鉑電極表面，更進一步的研究表示，細胞色素C可被強吸附在修飾電極表面形成一種近似的單分子層。

納米技術的快速發(fā)展為納米粒子在生物傳感器和生物分析中的應用開拓了新的方向，由于其獨特的物理、化學性質(zhì)，納米粒子引起了納米科學家的極大興趣，這些性質(zhì)使其在化學和生物感測方面具有廣闊的應用潛力。近年來，組成和空間結(jié)構(gòu)不同的納米粒子被廣泛應用于不同生物分子識別的電學、光學和微量感測中。膠體金（Colloidal gold）和半導體量子點納米粒子在生物分析中應用得非常廣泛。通過與生物識別反應和納米生物電子的耦合作用，能極大地提高這兩種納米粒子的用途。納米粒子放大標記以及納米粒子-生物分子的自組裝產(chǎn)生極大的信號增強作用，為制造超靈敏的光學和電學檢測奠定了基礎，其靈敏度可與聚合物酶鏈反應（PCR）相比［7］。

納米材料獨特的性質(zhì)使其在設計具有高靈敏度和選擇性的核酸和蛋白質(zhì)檢測方法中具有廣闊的應用前景。由于可以制得不同尺寸、組成和形狀的納米材料，調(diào)節(jié)其物理化學性質(zhì)，使其在生物感測和生物分析中得到廣泛的應用。由于納米材料的小尺寸效應，其性質(zhì)很大程度上受到與其結(jié)合的生物分子影響。近幾年，不同組成的納米粒子作為多種用途、靈敏的標記物被廣泛地應用于識別不同生物分子的電子、光學和微天 帄傳感器中。納米粒子放大標記以及納米粒子-生物分子的自組裝產(chǎn)生極大的信號增強作用，這種技術結(jié)合了納米粒子-生物分子自組裝的放大特性和光學或電化學傳感器的高靈敏性，將多個基于納米材料的放大單元和過程結(jié)合，也能夠設計出多重放大器，滿足現(xiàn)代生物分析對更高靈敏度的需求［8］。金屬納米粒子獨特的催化性質(zhì)能在其本身或另一種金屬納米粒子的刺激下實現(xiàn)放大信號的功能。也可以通過將大量的能夠產(chǎn)生信號的分子封裝在納米粒子中以提高每個結(jié)合過程標記物的數(shù)量，達到放大信號的目的。這些基于納米材料的生物感測和生物分析方法還能夠與其它的放大技術結(jié)合。如圖1所示。

3 基于功能性納米粒子的電化學免疫傳感器與應用

基于抗體和抗原的特異性反應，免疫傳感器為免疫劑的分析提供了一種靈敏的選擇性的方法。在此方法中，免疫材料被固定在傳感器上，通 過標記物與其中一種免疫 詴劑的復合物對分析液進行測量［9］。一般是通過測量標記物的特異活性，例如放射性、酶活性、熒光、化學發(fā)光或生物發(fā)光對分析物進行定量。但是每一種標記物都有自己的優(yōu)缺點，含有金屬標記物免疫檢測的金屬免疫檢測，以克服一般的放射性標記，熒光標記和酶標記的缺點。電化學檢測的金屬免疫分析具有以下幾種優(yōu)點：如，檢測液用量少、樣品不用純化、靈敏度好、儀器設備相對便宜。盡管電化學技術能夠檢測到nanomole有機金屬化合物或金屬離子，與能檢測到pico-mole級的熒光檢測方法相比，靈敏度還不夠高。使每個結(jié)合物上含有最大量的金屬標記物的理想方法是使用包含上千個金屬原子的金屬納米粒子。由于其優(yōu)越的氧化還原活性，膠體金是電化學免疫感測和免疫標測標記物的最佳選擇?，F(xiàn)已建立了一種基于金納米粒子循環(huán)累積的新方法，通過陽極溶出技術檢測人的免疫球蛋白（IgG）［10］。在生物素存在下，脫巰基生物素和親合素的解離反應為能夠分析最終定量的金納米粒子的循環(huán)累積提供了有效的路線。陽極峰電流隨著循環(huán)次數(shù)的增加而增大。五個循環(huán)的累積即可滿足該分析方法的需要。這種方法的優(yōu)點就是背景值很低，從而使人IgG的檢測極限可達0.1ng/ ml。如圖2、圖3所示。

4 結(jié)語

納米技術為設計超靈敏的生物傳感器和生物分析方法提供了很大的機會。納米粒子在生物傳感器放大和生物分子識別具有巨大的潛力及應用價值。新的納米粒子感測技術的超強靈敏度，為常規(guī)方法檢測不到的疾病標記物提供了可行性。這種高靈敏的檢測方法還能夠?qū)崿F(xiàn)疾病的早期診斷或預警。納米粒子標記物在蛋白質(zhì)檢測中的應用還處于起步階段。但超靈敏的DNA檢測中的應用會為蛋白質(zhì)的檢測提供好的起步。

［1］張潔，吳珺 ，王傳現(xiàn)，等.采用石墨烯修飾的電化學免疫傳感器檢測豬肉中的己二烯雌酚含量［J］.中國藥科大學學報，2015，06∶683-685.

［2］逯嶺松，劉蓓，馬霄，等.電化學免疫傳感器超靈敏檢測髓過氧化物酶的研究［J］.重慶醫(yī)學，2015，36∶109-111.

［3］任鵬飛，邵科峰，張潔，等.基于寬譜特異性抗體的β_2-激動劑多殘留電化學免疫傳感器的研制［J］.食品科學，2016，08∶236-238.

［4］馮德香，尉艷，黃勤安.電化學免疫傳感器在腫瘤標志物檢測中的應用［J］.分析試驗室，2016，03∶363-364.

［5］張瑤，蒙麗君，官菊芳，等.基于生物條形碼信號放大的電化學方法檢測hIgG［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學，2016，02∶308-311.

［6］李艷霞，陳國南.基于HRP直接標記的流感病毒H1N1電化學免疫傳感器［J］.分析測試學報，2015，06∶701-702.

［7］董秀秀，王宇，沈玉棟，等.基于新型納米材料的電化學免疫傳感器及其在食品安全檢測中的應用進展［J］.中國食品學報，2015，04∶136-138.

［8］劉源，吳海云，于亞平，等.快速檢測水中多氯聯(lián)苯含量的電化學免疫傳感器設計［J］.湖北農(nóng)業(yè)科學，2015，18∶93-95.

［9］Singhal P，Kuhr W G.Direct electrochemical detection of purine-and pyrimidine-based nucleotides with sinusoidal voltammetry. Analytical Biochemistry. 2013（10）∶920-921.

［10］Tsugunori Notomi，Hiroto Okayama，Harumi Masubuchi，Toshihiro Yonekawa，Keiko Watanabe，Nobuyuki Amino，Tetsu Ha.Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Research . 2014（09）∶287-288.

The immune sensor is based on the close cooperation with the selective immune response and is suitable for the signal conversion technology，to monitor antigen - antibody response of biological sensors， gradually get rapid development and extensive application in many fields. In recent years the electrochemical immunosensor main research direction， in general is to improve the sensitivity， accuracy， selectivity， response time， and this article will use the single-walled carbon nanotubes as electrode， using its good conductivity， high surface area ratio， through the modification of carbon nanotubes wall and pipe end and biological molecular bonding， and keep the activity of biological molecules， the electrochemical immunosensor extremely symbolic significance. This paper combines the specific relevant theories and analysis， the application of functional nano materials in electrochemical immunosensor for research.

Functional； Nano materials； Electrochemical； Immunosensor