錢俊青, 唐弋奧, 李尚謙

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無溶劑體系丙三醇改性硅烷凝膠及應用于固定化脂肪酶

錢俊青, 唐弋奧, 李尚謙

(浙江工業(yè)大學藥學院, 浙江杭州310014)

為了獲得適用于食品工業(yè)且固定化酶性能優(yōu)異的固定化材料，規(guī)避在固定化材料制備過程中使用影響食品安全性的試劑，在無溶劑體系中以丙三醇改性四乙氧基硅烷(TEOS)獲得改性硅烷凝膠。經過試驗研究，獲得的優(yōu)化改性工藝條件為原料摩爾比四乙氧基硅烷(TEOS):丙三醇= 1:0.25，固體酸催化劑3 g×(50 mL)-1TEOS，反應溫度50℃，反應時間72 h。優(yōu)化工藝獲得的改性四乙氧基硅烷親水性明顯增強，在水中的溶解量可達0.58 g×mL-1。使用改性四乙氧基硅烷固定化假絲酵母脂肪酶，酶的催化活性得到良好保留，酶分子的結構剛性得到增強，和游離酶在相同條件下催化-抗壞血酸棕櫚酸酯的合成，改性硅烷凝膠固定化酶表現(xiàn)出比游離酶更好的催化活性。經改性后的硅烷凝膠是食品安全性良好的酶固定化材料。

丙三醇改性；硅烷凝膠；無溶劑體系；固定化；脂肪酶

1 前 言

固定化酶在食品工業(yè)中的應用十分廣泛，常被用于油脂加工[1]、乳品制造[2]、食品添加劑合成[3]等多個領域。硅烷凝膠是固定化酶的良好材料[4]，在使用硅烷凝膠固定化酶時，具有材料可調控性好[5]、適用范圍廣[6]、能保持酶分子較佳空間構象[7]等優(yōu)點。但硅烷凝膠也具有水溶性差[8]、材料較脆[9]等缺點，因而常通過對硅烷凝膠進行改性來解決上述缺點，目前以丙三醇改性硅烷凝膠前體——四乙氧基硅烷(TEOS)為較理想的改性方法，但在獲得改性四乙氧基硅烷時，要采用乙腈為反應介質[10,11]，而乙腈具有較強的毒性，這嚴重限制了改性硅烷凝膠固定化酶在食品工業(yè)中的應用[12]，而其他的改性方法又存在各種不足[13,14]，因此，尋找一種安全性高，適合于食品工業(yè)的硅烷凝膠改性方法十分必要。

在無溶劑體系中使用丙三醇改性四乙氧基硅烷這一方法在國內外均少有報道，本研究采用這種方法對硅烷凝膠前體進行改性，獲得了與使用乙腈作為反應介質時性能相當?shù)母男运囊已趸柰?。并利用該改性四乙氧基硅烷固定化脂肪酶，以催化食品抗氧化劑L-抗壞血酸棕櫚酸酯合成為催化活性的考察依據(jù)，考察固定化脂肪酶的催化活力，以期獲得適用于食品工業(yè)的且具有優(yōu)秀固定化性能的酶固定化材料。

2 材料和方法

2.1 材料

2.1.1 藥品與試劑

四乙氧基硅烷(TEOS)，阿拉丁T110593；丙三醇，杭州化學試劑有限公司；固體酸催化劑(732型強酸性陽離子交換樹脂)，杭州爭光樹脂有限公司；假絲酵母脂肪酶(Candida rugose lipase, CRL)，10000 U，北京凱泰新世紀生物技術有限公司；其他有機試劑，國藥集團化學試劑有限公司。

2.1.2 儀器

恒溫水浴振蕩器，金壇市江南儀器廠；pH計，上海精科儀器公司；傅里葉變換紅外光譜儀，美國伯樂儀器公司；旋轉蒸發(fā)儀，東京理化；電熱恒溫鼓風干燥箱，上海新苗醫(yī)療器械有限公司。

2.2 方法

2.2.1 丙三醇改性四乙氧基硅烷的合成

于250 mL錐形瓶中，加入732型強酸性陽離子交換樹脂做固體酸催化劑，然后加入50 mL四乙氧基硅烷，在含有機溶劑和無溶劑體系中振蕩反應，振蕩轉速為180 r×min-1，滴加丙三醇，待反應結束后過濾除去固體酸催化劑，將濾液于25℃下減壓蒸餾8 h(真空度低于30 kPa)，得到透明狀固體凝膠。水溶性是衡量改性四乙氧基硅烷性能的重要指標，溶解性越好其性能越好[15]，因此使用水溶性作為改性四乙氧基硅烷性能好壞的評定依據(jù)。

2.2.2 改性四乙氧基硅烷溶解性測定

取3個4.5 mL的離心管，分別量取2.0 mL蒸餾水，向離心管中逐漸加入改性凝膠前體，振蕩混勻，直至加入的改性凝膠前體不能繼續(xù)溶解于蒸餾水中，移取1 mL飽和溶液上清液至已干燥并稱重的培養(yǎng)皿中，于恒溫烘箱中干燥至恒重，每組測定3次，得到改性前體飽和溶液中溶質的質量，溶解性以改性四乙氧基硅烷在水中溶解的質量濃度計算(g×mL-1)。

2.2.3 改性四乙氧基硅烷的結構表征

采用紅外光譜、13C-NMR和1H-NMR對丙三醇改性后的硅烷凝膠前體進行結構表征。

2.2.4 假絲酵母脂肪酶的固定化

取0.6 g改性四乙氧基硅烷，加入蒸餾水2.0 mL，加入致孔劑PEG600 80 mg，超聲得到透明均勻的溶液，后用NaOH溶液調節(jié)pH至7.0，然后加入含假絲酵母脂肪酶200 mg 的磷酸鹽緩沖液4 mL (0.1 mol×L-1，pH7.8)，最后加入硅烷偶聯(lián)劑3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)，之后放入4℃ 冰箱中，老化72 h，最后冷凍干燥12 h，即可制得改性硅烷凝膠固定化假絲酵母脂肪酶。

2.2.5-抗壞血酸棕櫚酸酯的合成

本研究選用-抗壞血酸和棕櫚酸甲酯合成-抗壞血酸棕櫚酸甲酯作為檢測改性硅烷凝膠固定化脂肪酶催化活力的反應。取50 mL具塞三角瓶，加入20 mL叔戊醇作為反應溶劑(使用前分子篩除水)，加入1.36 mmol (0.24 g)-抗壞血酸，1.11 g棕櫚酸甲酯，改性硅烷凝膠固定化脂肪酶0.4 g(含100 mg脂肪酶)或100 mg游離脂肪酶，于50℃，200 r×min-1反應24 h。

2.2.6-抗壞血酸棕櫚酸酯的測定

根據(jù)中國人民共和國國家標準(GB16314-1996)中-抗壞血酸棕櫚酸酯的檢測方法，采用碘量法對其進行含量的測定[16]。

3 結果與分析

3.1 無溶劑體系改性四乙氧基硅烷的制備和改性工藝優(yōu)化

在未選出優(yōu)化改性工藝條件之前，使用的改性工藝條件為原料摩爾比TEOS：丙三醇= 1:0.5，固體酸催化劑2 g，反應溫度40℃，反應時間72 h。

選用乙腈(ACN)、丙酮、二氯甲烷(DCM)作為反應介質以及在無溶劑體系中進行丙三醇改性四乙氧基硅烷的制備，結果見圖1。

圖1 反應介質(a) 和底物摩爾比(b) 對改性四乙氧基硅烷的影響

由圖1(a)可知，當使用無溶劑體系改性四乙氧基硅烷時，所得改性四乙氧基硅烷的水溶性已經與使用乙腈作為反應介質所得的改性四乙氧基硅烷相當，并且遠大于二氯甲烷以及丙酮作反應介質時的產物溶解性。說明使用無溶劑體系改性的四乙氧基硅烷其性能可以達到用于固定化酶的要求，因此，選用無溶劑體系作為改性四乙氧基硅烷的反應體系，來進行后續(xù)改性工藝條件的優(yōu)化。

原料摩爾比對反應進行的方向和程度有重要影響，本研究探討了不同原料摩爾比對改性四乙氧基硅烷反應的影響，由圖1(b)可知，原料中TEOS:丙三醇= 1:0.25時，改性凝膠前體溶解性最大，改性效果較好。當原料中丙三醇含量繼續(xù)增大時，其改性后產物溶解性下降，可能是由于空間位阻的原因，導致丙三醇難以較多取代硅原子上面的乙氧基基團。

反應溫度影響反應進行的速率和平衡狀態(tài)，本研究探討了反應溫度對改性四乙氧基硅烷反應的影響，結果見圖2。

圖2 反應溫度(a) 、反應時間(b) 和固體酸催化劑用量(c) 對改性四乙氧基硅烷的影響

由圖2(a)可知，反應溫度對合成的前體的水溶性影響較大。隨反應溫度的升高，改性四乙氧基硅烷溶解性逐漸增加；但是當反應溫度大于50℃ 時，溶解效果變差，因此反應溫度選擇為50℃，另外從反應速度的角度出發(fā)，反應溫度為50℃也十分合適。

恰當?shù)姆磻獣r間可以保證反應得到充分進行并且獲得較好的實驗效率，本研究探討了反應時間對改性四乙氧基硅烷反應的影響，由圖2(b)可知，當反應時間超過72 h后，丙三醇取代硅烷乙氧基的反應速率變慢，并在80 h后，反應基本達到平衡狀態(tài)，綜合考慮實驗效率和改性效果，選擇最適反應時間為72 h。

催化劑用量會影響反應速率甚至影響反應結果，本研究探討了固體酸催化劑用量對對改性四乙氧基硅烷反應的影響，由圖2(c)可知，當固體酸催化劑的用量超過2.5 g時，丙三醇改性后硅烷凝膠前體溶解性提高緩慢，說明此時丙三醇與TEOS反應較為完全，效果較好。綜合選擇催化劑的用量為3.0 g。

3.2 改性四乙氧基硅烷的結構表征

3.2.1 紅外表征

采用紅外光譜對改性前后及具有不同溶解性的改性四乙氧基硅烷進行表征，結果見圖3，圖3(b)中A為溶解性稍差(0.12 g×mL-1)的改性四乙氧基硅烷，B溶解性能適中(0.36 g×mL-1)的硅烷凝膠前體，C溶解性能較好(0.58 g×mL-1)硅烷凝膠前體。

圖3 TEOS (a) 和不同溶解性的改性四乙氧基硅烷(b) 的紅外光譜圖

從圖3(a)與(b)的對比中，可發(fā)現(xiàn)圖3(b)中3600~3300 cm－1處有強吸收，這是由于產物中具有較多的羥基的原因，說明TEOS上的乙氧基被丙三醇所取代，因而具備有較多的羥基。圖3(b)中，不同溶解性的改性四乙氧基硅烷呈現(xiàn)不同的紅外光譜圖，溶解性能較好的改性四乙氧基硅烷在3600~3300 cm-1處有較強吸收，基本可以表明丙三醇與TEOS發(fā)生較為完全的反應，改性效果較好；溶解性能較差的硅烷凝膠前體在此處吸收較弱，表明丙三醇與TEOS反應并不完全，改性效果較差。

3.2.2 核磁表征

采用13C-NMR和1H-NMR對丙三醇改性后的硅烷凝膠前體進行表征，結果見圖4.

根據(jù)圖4(a)的1H-NMR中可以看出，譜圖中除了有TEOS的1.2 ppm和3.85 ppm左右的乙氧基峰、(3.5~3.6) ppm丙三醇吸收峰外，(3.6~3.8) ppm有很多新的峰出現(xiàn)，這些新增的峰是與氧相連的碳上的氫原子的特征峰，由此看出是丙三醇取代了TEOS上的乙氧基基團。

圖4 改性四乙氧基硅烷的1H-NMR (a)和C-NMR 譜(b) (CH3OD，400M)

根據(jù)圖4(b)的13C-NMR中可以看出，除了有TEOS的18.4 ppm和59 ppm的乙氧基碳峰、丙三醇的63 ppm和74 ppm位的碳峰外，在60 ppm和73 ppm處都有新的峰出現(xiàn)，是丙三醇取代乙氧基后所表現(xiàn)出來的峰值。

3.3 改性硅烷凝膠固定化酶

使用制得的改性四乙氧基硅烷按2.2.4節(jié)方法對假絲酵母脂肪酶進行固定化，得到改性硅烷凝膠固定化酶。在固定化酶的過程中，硅烷偶聯(lián)劑3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)的使用量會對凝膠形成有重要影響，改性四乙氧基硅烷與APTES的反應示意圖見圖5，本研究探討了APTES使用量對固定化酶活性的影響。

圖5 改性四乙氧基硅烷與APTES 的反應示意圖

3.3.1 APTES使用量對固定化酶活性的影響

APTES使用量對固定化酶活性的影響，結果見圖6。

由圖6(a)可知，固定化過程中添加硅烷偶聯(lián)劑APTES，能夠使前體迅速發(fā)生聚合反應生成凝膠，完成凝膠對酶的包埋，硅烷偶聯(lián)劑APTES的添加量對凝膠的形成及酶的活性有著重要的影響，適量增加硅烷偶聯(lián)劑APTES的使用能夠提高固定化酶的催化酯化活性，其中硅烷偶聯(lián)劑APTES的使用量選擇為250 uL時較為適宜。

3.3.2 固定化酶與游離酶催化活性的比較

3.3.2.1 不同pH緩沖液處理后固定化酶和游離酶催化活性的比較

使用不同pH緩沖液溶解游離酶并用于固定化，在相同條件下處理游離酶后冷干，之后做催化活性的比較，由圖6(b)可知，固定化酶始終比游離酶具有更好的催化活性，可能的原因是固定化材料增強了酶蛋白分子結構的剛性，在與外界環(huán)境接觸的過程中，其分子結構更加不易受到破壞。當pH為7.8時，固定化酶每mg酶能催化合成0.0012 g產物；pH為7.6時，游離酶每mg酶能催化合成0.0009 g產物。經固定化后，固定化脂肪酶的最適pH為7.8，而游離酶最適pH為7.6。

3.3.2.2 不同溫度下固定化酶和游離酶催化活性的比較

不同溫度下固定化酶和游離酶催化活性的比較，由圖6(c)可知，改性硅烷凝膠固定化酶較游離酶具有更好的熱穩(wěn)定性，在較高溫度下仍然具有很強的催化活性，且固定化酶的最適溫度為50℃，比游離酶的最適溫度要高。固定化酶相較游離酶展現(xiàn)出了更好的催化活性，在各自最適催化條件下催化-抗壞血酸棕櫚酸甲酯的合成，固定化酶每mg酶能催化合成0.0013 g產物，游離酶每mg酶能催化合成0.0009 g產物，得到的產物濃度是游離酶催化相同反應的1.42倍。

圖6 APTES用量對固定化酶活性的影響(a) 以及不同pH 緩沖液處理后(b) 和不同溫度下(c) 固定化酶和游離酶的酶活比較

4 結 論

使用無溶劑體系改性得到的硅烷凝膠前體，是良好的固定化材料，具有好的食品安全性和生物相容性。改性硅烷凝膠固定化脂肪酶，較好地保存了酶分子的結構，且酶蛋白分子獲得了更好的結構剛性，使其熱穩(wěn)定性等性能得到提高，相較游離酶，在催化-抗壞血酸棕櫚酸甲酯的合成時，固定化酶的催化活性更高。同時，在此研究基礎上，還應對固定化凝膠的結構、固定化酶的泄漏情況、固定化酶的重復使用次數(shù)等參數(shù)做進一步探討。綜上所述，無溶劑體系改性四乙氧基硅烷是良好的硅烷凝膠改性方法，改性過程規(guī)避了乙腈，保證了該固定化材料在食品工業(yè)中的應用。

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Solvent-Free Glycerin Modified TetraethoxysilaneSol-Gel and its Application in Lipase Immobilization

QIAN Jun-qing, TANG Yi-ao, LI Shang-qian

(College of Pharmacy, Zhejiang University of Technology Hangzhou 310014, China)

Solvent-free glycerin modified tetraethoxysilane (TEOS) sol-gel was prepared to obtain enzyme immobilization materials without toxic reagents and suitable for food industry. The material prepared has good food safety and high biocompatibility, and the optimum modification conditions is TEOS: glycerin molar ratio = 1:0.25, solid acid catalyst 3 g×(50 mL)-1TEOS, temperature 50℃ for 72 h. The hydrophilicity of the modified TEOS is significantly increased with water solubility of 0.58 g×mL-1. The lipase immobilized shows high catalytic activity and strong structural rigidity.-ascorbyl palmitate synthesis catalyzed by immobilized and free enzymes is studied under same conditions, and the immobilized enzyme shows better performance.

glycerin modifying; sol-gel; solvent-free system; immobilization; lipase

1003-9015(2016)05-1134-06

Q814.2

A

10.3969/j.issn.1003-9015.2016.05.021

2015-11-25；

2016-02-24。

錢俊青(1964-)，男，浙江紹興人，浙江工業(yè)大學教授，博士。通訊聯(lián)系人：錢俊青，E-mail: qjq@zjut.edu.cn