林祥輝，王曉敏，王艷紅，李學(xué)濤#（1.臨沂經(jīng)濟(jì)技術(shù)開發(fā)區(qū)人民醫(yī)院藥劑科，山東臨沂　7603；.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧大連　116600）

西妥昔單抗修飾異長(zhǎng)春花堿隱形陽(yáng)離子脂質(zhì)體的制備及其理化性質(zhì)、細(xì)胞抑制作用研究Δ

林祥輝1＊，王曉敏2，王艷紅2，李學(xué)濤2#（1.臨沂經(jīng)濟(jì)技術(shù)開發(fā)區(qū)人民醫(yī)院藥劑科，山東臨沂276023；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧大連116600）

目的：制備西妥昔單抗（IMC-C225）修飾異長(zhǎng)春花堿（VRB）隱形陽(yáng)離子脂質(zhì)體（以下簡(jiǎn)稱VRB陽(yáng)離子脂質(zhì)體），并對(duì)其理化性質(zhì)和細(xì)胞抑制作用進(jìn)行研究。方法：采用硫酸銨梯度法制備VRB陽(yáng)離子脂質(zhì)體，同時(shí)對(duì)VRB陽(yáng)離子脂質(zhì)體的形態(tài)學(xué)、粒徑、多分散系數(shù)（PDI）、Zeta電位、包封率、體外釋放度等理化性質(zhì)進(jìn)行研究，采用磺酰羅丹明B（SRB）法檢測(cè)VRB陽(yáng)離子脂質(zhì)體對(duì)肺癌Lewis細(xì)胞的抑制作用。結(jié)果：所制備的VRB陽(yáng)離子脂質(zhì)體外觀呈圓球形、大小均勻、表面光滑，平均粒徑為（89.06±3.56）nm，PDI為0.175±0.01，Zeta電位為（35.91±0.51）mV，包封率為（90.61±0.80）%，48 h的體外釋放度為（26.74±3.76）%（n＝3）；與異長(zhǎng)春花堿脂質(zhì)體和IMC-C225修飾空白隱形陽(yáng)離子脂質(zhì)體比較，VRB陽(yáng)離子脂質(zhì)體能降低Lewis細(xì)胞的存活率。結(jié)論：所制備的VRB陽(yáng)離子脂質(zhì)體粒徑均勻、包封率較高，對(duì)Lewis細(xì)胞有明顯的抑制作用。

異長(zhǎng)春花堿；西妥昔單抗；隱形陽(yáng)離子；脂質(zhì)體；理化性質(zhì)；細(xì)胞抑制

異長(zhǎng)春花堿（Vinorelbine，VRB）是從長(zhǎng)春花Catharathus roseus（L）G.Don中提取出來(lái)的半合成的生物堿。VRB是一種作用于腫瘤細(xì)胞微管蛋白的藥物，主要抑制微管蛋白的聚集，選擇性地作用于細(xì)胞有絲分裂期。臨床上VRB適用于治療非小細(xì)胞肺癌、轉(zhuǎn)移性乳腺癌，同時(shí)對(duì)于急性淋巴細(xì)胞白血病、霍奇金淋巴瘤及非霍奇金淋巴瘤等都有顯著治療功效[1]。然而VRB在臨床應(yīng)用過(guò)程中，有明顯的骨髓抑制、正常組織器官細(xì)胞毒性及靜脈炎等副作用。西妥昔單抗（Cetuximab，又名IMC-C225、Erbitux）是目前臨床上應(yīng)用的抗表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）人/鼠嵌合單克隆抗體，研究報(bào)道IMC-C225可以作為脂質(zhì)體的靶向配體以增加脂質(zhì)體的主動(dòng)靶向效果[2]。為了降低VRB的毒副作用，增加化療藥物的主動(dòng)靶向性，筆者將VRB制備成IMC-C225修飾的隱形陽(yáng)離子脂質(zhì)體，并考察了其理化性質(zhì)和對(duì)肺癌Lewis細(xì)胞的抑制作用。

1　材料

1.1儀器

LF-1脂質(zhì)體擠出儀（加拿大奧維斯丁公司）；LC-1100液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）；Zetasizer 3000HS激光散射粒徑測(cè)定儀（英國(guó)馬爾文公司）；Tecnai G220ST透射電子顯微鏡（美國(guó)FEI公司）；SPI3800N原子力掃描探針顯微鏡（日本精工株式會(huì)社）；XDS-1B倒置顯微鏡（重慶光學(xué)電學(xué)儀器公司）；MR-96酶標(biāo)儀（深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司）。

1.2藥品與試劑

卵磷脂（EPC，日本NOF公司，批號(hào)：120015）；膽固醇（Chol，上海普邁生物科技有限公司，批號(hào)：8280100）；聚乙二醇2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（PEG 2000-DSPE，日本精化株式會(huì)社，批號(hào)：B10206）；3β-[N-（N′，N′-二甲基胺乙基）胺基甲酰胺基]膽固醇（DC-Chol，上海艾韋特醫(yī)藥科技有限公司，批號(hào)：201923）；IMC-C225-PEG 2000-DSPE（遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥劑實(shí)驗(yàn)室合成）；VRB原料藥（海南國(guó)棟藥業(yè)有限公司，批號(hào)：20080512，純度：98.0%）；葡聚糖凝膠G-100（上海華藍(lán)化學(xué)科技有限公司）；RPMI-1640培養(yǎng)液和胎牛血清（北京邁晨科技有限公司）；磷酸鹽緩沖液（PBS，北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司）；磺基羅丹明B（SRB，美國(guó)Sigma公司）；三氯乙酸（TCA，北京市興津化工廠）；胰蛋白酶（美國(guó)Amresco公司）；其余所用試劑均為分析純。

1.3細(xì)胞

小鼠Lewis肺癌細(xì)胞（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院協(xié)和醫(yī)科大學(xué)藥物研究所）。

2　方法與結(jié)果

2.1IMC-C225修飾VRB隱形陽(yáng)離子脂質(zhì)體（以下簡(jiǎn)稱VRB陽(yáng)離子脂質(zhì)體）的制備[3]

精密稱取卵磷脂60μmol、DC-Chol 40μmol、PEG 2000-DSPE 3μmol和IMC-C225-PEG 2000-DSPE 1μmol，共同溶解于10 ml氯仿中，然后在40水浴中低速旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除氯仿，形成薄膜。隨后加入250 mmol/L（NH4）2SO4水溶液5 ml，水化，水化液超聲（功率200W）10 min，超聲后的混懸液采用脂質(zhì)體擠出儀反復(fù)通過(guò)聚碳酸脂膜（200 nm）。將過(guò)膜后的脂質(zhì)體混懸液密封于MD34透析袋（截留分子質(zhì)量12 000～14 000）中，透析袋置PBS中透析24 h，每8 h更換1次透析液，即得IMCC225修飾空白隱形陽(yáng)離子脂質(zhì)體（以下簡(jiǎn)稱空白陽(yáng)離子脂質(zhì)體）。將空白陽(yáng)離子脂質(zhì)體與適量的VRB混合（磷脂-藥為30∶1，m/m），置于40水浴中振搖30 min，即得VRB陽(yáng)離子脂質(zhì)體。

2.2VRB的含量測(cè)定方法

2.2.1色譜條件[4]色譜柱：C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.06 mol/L磷酸二氫鉀（35∶65，用磷酸調(diào)pH為3.0）；流速：1.0 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：215 nm；柱溫：30；進(jìn)樣量：20μl。在該色譜條件下，理論板數(shù)以VRB峰計(jì)不得低于3000。

2.2.2線性關(guān)系考察精密制備質(zhì)量濃度分別為0.03、0.06、0.12、0.18、0.24、0.30 mg/ml的VRB溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。以VRB的質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為y＝1 245.8x－13.32（r＝0.999 9，n＝6）。結(jié)果表明，VRB在0.03～0.30 mg/ml質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.3精密度試驗(yàn)取一定濃度的VRB溶液，分別連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算得峰面積的RSD＝1.33%（n＝6），表明精密度良好。

2.2.4穩(wěn)定性試驗(yàn)取一定濃度的VRB溶液，分別于0、2、4、8、24 h進(jìn)樣分析，計(jì)算得峰面積的RSD＝1.46%（n＝5），表明VRB溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.5回收率試驗(yàn)精密吸取VRB陽(yáng)離子脂質(zhì)體樣品溶液0.5 ml，分別加入適量的VRB對(duì)照品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果，平均加樣回收率為98.64%（RSD＝1.09%，n＝9），表明本方法滿足樣品測(cè)定的要求。

2.3VRB陽(yáng)離子脂質(zhì)體的理化性質(zhì)

2.3.1透射電子顯微鏡下的粒子形態(tài)觀察[5]VRB陽(yáng)離子脂質(zhì)體外觀為乳白色半透明液體，色澤均勻，略帶乳光。取適量VRB陽(yáng)離子脂質(zhì)體，用蒸餾水稀釋到適宜濃度，滴至反應(yīng)瓷板的凹槽內(nèi)，并將噴碳銅網(wǎng)放于凹槽內(nèi)的試液上，1～2 min后取出噴碳銅網(wǎng)，用濾紙從銅網(wǎng)邊緣吸去多余液體，然后將該銅網(wǎng)放在1%醋酸雙氧鈾水溶液中浸泡1 min后取出，靜置，使粒子在銅網(wǎng)上沉積。用透射電子顯微鏡觀察粒徑大小、形態(tài)并拍照。結(jié)果顯示，VRB陽(yáng)離子脂質(zhì)體外觀呈圓球形、大小均勻。結(jié)構(gòu)示意圖見圖1，透射電子顯微鏡圖見圖2。

圖1　脂質(zhì)體的結(jié)構(gòu)示意圖Fig 1　The schematic representation of liposomes

圖2　脂質(zhì)體的透射電子顯微鏡圖（×10000）Fig 2　TEM images of liposomes（×10000）

2.3.2原子力掃描探針顯微鏡下的粒子形態(tài)觀察[6]取適量VRB陽(yáng)離子脂質(zhì)體，用蒸餾水稀釋到適當(dāng)濃度，量取10 μl脂質(zhì)體溶液涂于硅片上，置培養(yǎng)皿中室溫下陰干，然后使用原子力掃描探針顯微鏡進(jìn)行觀察并拍照。結(jié)果顯示，VRB陽(yáng)離子脂質(zhì)體表面光滑，粒徑主要分布于100 nm左右。原子力掃描探針顯微鏡圖見圖3。

圖3　脂質(zhì)體的原子力掃描探針顯微鏡圖Fig 3　Atomic force scanning probe microscope images of liposomes

2.3.3粒徑、多分散系數(shù)（PDI）[7]與Zeta電位[8]精密吸取VRB陽(yáng)離子脂質(zhì)體0.5 ml，加PBS稀釋至20 ml。用馬爾文激光粒度儀進(jìn)行測(cè)定，粒徑測(cè)定結(jié)束后分別以微粒的個(gè)數(shù)作為基準(zhǔn)繪制粒徑分布圖。結(jié)果可見，VRB陽(yáng)離子脂質(zhì)體的平均粒徑為（89.06±3.56）nm，呈正態(tài)單峰分布，PDI為0.175± 0.01，Zeta電位為（35.91±0.51）mV。脂質(zhì)體的粒徑分布見圖4，Zeta電位分布見圖5。

圖4　脂質(zhì)體的粒徑分布圖Fig 4　Particle size distribution map of liposomes

2.3.4包封率稱取葡聚糖凝膠G-100 2.0 g，置于PBS中浸泡24 h，然后采用濕法裝柱（10 cm×1.5 cm）備用。精密吸取VRB陽(yáng)離子脂質(zhì)體0.5 ml，加至凝膠柱上方，采用PBS溶液進(jìn)行洗脫，收集帶有乳光的脂質(zhì)體溶液，所收集的脂質(zhì)體溶液加入9倍體積的甲醇破壞后，分別按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算包封率（EE）[9-10]。EE（%）＝（m后/m總）×100%，式中，m后是過(guò)葡聚糖凝膠G-100柱后被甲醇破壞的VRB陽(yáng)離子脂質(zhì)體中VRB的質(zhì)量，m總是相同體積脂質(zhì)體中的VRB的質(zhì)量。結(jié)果顯示，VRB陽(yáng)離子脂質(zhì)體中VRB的包封率為（90.61±0.80）%。

圖5　脂質(zhì)體的Zeta電位分布圖Fig 5　Zeta potential distribution map of liposomes

2.3.5體外釋放度精密吸取VRB脂質(zhì)體和VRB陽(yáng)離子脂質(zhì)體各2 ml，分別加入2 ml的釋放介質(zhì)（含10%胎牛血清的PBS）中，密封于MD34透析袋中。將透析袋置于40.0 ml PBS中，37下100 r/min均勻振蕩。分別于0、4、8、12、24、48 h時(shí)取出0.5 ml PBS溶液，并立即補(bǔ)入0.5 ml新鮮的釋放介質(zhì)。待測(cè)樣品分別加入同體積的甲醇溶液超聲處理進(jìn)行破壞，然后10 000r/min（離心半徑為16cm）離心10min，取上清液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定VRB的含量[11-12]，計(jì)算累積釋放度（RR）。RR（%）＝（mi/m總）×100%，式中，mi為第i個(gè)時(shí)間點(diǎn)的釋放介質(zhì)中測(cè)得VRB的量，m總為透析前相同體積脂質(zhì)體混懸液中VRB的量。不同脂質(zhì)體的體外釋放度結(jié)果見圖6。

圖6　不同脂質(zhì)體的體外釋放度結(jié)果Fig 6　The release rate of different liposomes in vitro

由圖6可知，VRB陽(yáng)離子脂質(zhì)體經(jīng)過(guò)48 h后，體外累積釋放度為（26.74±3.76）%，而VRB脂質(zhì)體在相同條件下的累積釋放度為（49.32±2.65）%。

2.4VRB陽(yáng)離子脂質(zhì)體的細(xì)胞抑制作用評(píng)價(jià)

2.4.1細(xì)胞的培養(yǎng)[13]Lewis細(xì)胞在RPMI-1640培養(yǎng)液（含10%胎牛血清、100 u/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素）中生長(zhǎng)，于培養(yǎng)條件為37、5%CO2的孵箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。

2.4.2抑制作用評(píng)價(jià)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Lewis細(xì)胞，接種至96孔培養(yǎng)板，37、5%CO2下培養(yǎng)24 h后，將VRB脂質(zhì)體、VRB陽(yáng)離子脂質(zhì)體及空白陽(yáng)離子脂質(zhì)體分別加入96孔培養(yǎng)板中，使VRB的最終濃度為0.005、0.01、0.02、0.04、0.05、0.08、0.1μmol/ L。給藥后繼續(xù)孵育48 h，孵育完畢吸棄孔中的培養(yǎng)液，每孔加入200μl 10%預(yù)冷的三氯乙酸，在4中放置1 h以固定細(xì)胞。棄去孔內(nèi)液體后用蒸餾水洗滌5次以去除三氯乙酸，在空氣中干燥，向每孔加入100μl 0.4%SRB（以1%醋酸配制）染色，室溫下放置15 min。棄去孔內(nèi)液體后用1%醋酸洗滌5次以去除未結(jié)合染料，空氣中干燥后用pH 10.5的10 mmol/L的Tris堿200μl溶解，振蕩20 min。于酶標(biāo)儀上540 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度（A）[14-15]，計(jì)算細(xì)胞存活率（細(xì)胞存活率＝藥物處理后的A540nm/空白對(duì)照孔A540nm×100%），繪制存活率曲線。不同脂質(zhì)體對(duì)Lewis細(xì)胞存活率的影響見圖7。

圖7　不同脂質(zhì)體對(duì)Lewis細(xì)胞存活率的影響Fig 7　Effects of different liposomes on survival rate of Lewis cells

由圖7可知，對(duì)Lewis細(xì)胞存活率抑制作用的大小順序依次為VRB陽(yáng)離子脂質(zhì)體＞VRB脂質(zhì)體＞空白陽(yáng)離子脂質(zhì)體。與VRB脂質(zhì)體比較，VRB陽(yáng)離子脂質(zhì)體在不同VRB給藥濃度下均顯示出最強(qiáng)的抑制Lewis細(xì)胞增殖的作用?？瞻钻?yáng)離子脂質(zhì)體對(duì)Lewis細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用很小，可以忽略不計(jì)。

3　討論

本試驗(yàn)采用硫酸銨梯度法制備VRB陽(yáng)離子脂質(zhì)體，該方法具有操作簡(jiǎn)便、制備的脂質(zhì)體的包封率高的特點(diǎn)。相對(duì)于傳統(tǒng)的被動(dòng)載藥方法，采用硫酸銨梯度法所制備的脂質(zhì)體藥物不易滲漏。硫酸銨梯度法依靠脂質(zhì)體內(nèi)外水相的硫酸銨濃度梯度來(lái)載水溶性藥物。本試驗(yàn)所制備VRB陽(yáng)離子脂質(zhì)體的平均包封率大于90%，平均粒徑均小于100 nm，PDI小于0.20，Zeta電位大于30 mV；通過(guò)透射電子顯微鏡和原子力掃描探針顯微鏡觀察該脂質(zhì)體外觀呈圓球形，表面光滑，大小均勻，所觀察的粒徑和激光粒度分析儀測(cè)定的結(jié)果一致。

為了解脂質(zhì)體在體內(nèi)的釋藥情況，本試驗(yàn)考察了脂質(zhì)體的體外釋放度。由于脂質(zhì)體在機(jī)體內(nèi)與血漿蛋白之間存在脂交換作用，所以在考察脂質(zhì)體的體外釋放度的過(guò)程中加入了10%的胎牛血清。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，VRB脂質(zhì)體和釋放介質(zhì)混合后在所有的測(cè)定時(shí)間點(diǎn)的體外釋放度均顯著高于VRB陽(yáng)離子脂質(zhì)體，該結(jié)果可能與VRB陽(yáng)離子脂質(zhì)體中的PEG 2000-DSPE的加入阻止了血清對(duì)脂質(zhì)體的破壞有關(guān)。

空白陽(yáng)離子脂質(zhì)體對(duì)Lewis細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用很小，可以忽略不計(jì)，說(shuō)明VRB陽(yáng)離子脂質(zhì)體對(duì)Lewis細(xì)胞的細(xì)胞抑制作用可能是由于增加了細(xì)胞對(duì)藥物的主動(dòng)攝取而引起的。VRB陽(yáng)離子脂質(zhì)體的主動(dòng)攝取一方面來(lái)自于IMC-C225與腫瘤細(xì)胞膜表面的抗原所發(fā)生的特異性結(jié)合，另一方面來(lái)自于脂質(zhì)體表面所帶的正電荷，其可以與腫瘤細(xì)胞表面的負(fù)電荷結(jié)合，進(jìn)而增大其對(duì)腫瘤細(xì)胞的攝取強(qiáng)度。

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（編輯：鄒麗娟）

Study on Preparation，Physicochemical Properties and Cell Inhibition of IMC-C225 Modified Vinorelbine Stealth Cationic Liposomes

LIN Xianghui1，WANG Xiaomin2，WANG Yanhong2，LI Xuetao2（1.Dept.of Pharmacy，the People’s Hospital of Linyi Economic and Technological Development Zone，Shandong Linyi 276023，China；2.School of Pharmacy，Liaoning University of TCM，Liaoning Dalian 116600，China）

OBJECTIVE：To prepare IMC-C225 modified vinorelbine（VRB）stealth cationic liposomes（called VRB cationic liposomes for short），and to study the physicochemical properties and cell inhibition.METHODS：The VRB cationic liposomes were prepared by ammonium sulfate gradient method.The physicochemical properties，including morphology，particle size，polydispersity index（PDI），Zeta potential，encapsulation efficiency and in vitro release rate，were studied.The inhibitory effects of the liposomes on lung caner Lewis cell were evaluated by SRB methods.RESULTS：The prepared VRB cationic liposomes were spheroidal in shape，even in size and smooth in surface.The average particle size of liposomes was（89.06±3.56）nm，PDI value was 0.175±0.01 and Zeta potential was（35.91±0.51）mV.The encapsulation efficiency was（90.61±0.80）%，and in vitro release rate was（26.74±3.76）%within 48 h（n＝3）.Compared with vinorelbine liposomes and IMC-C225 modified blank stealth cationic liposomes，VRB cationic liposomes could reduce the survival rate of Lewis cells.CONCLUSIONS：Prepared VRB cationic liposomes have even particle size and high encapsulation efficiency，and show significant inhibitory effect on Lewis cells.

Vinorelbine；IMC-C225；Stealth cationic；Liposomes；Physicochemical properties；Cell inhibition

R943

A

1001-0408（2016）28-3964-04

10.6039/j.issn.1001-0408.2016.28.23

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No.81541081）；遼寧省科學(xué)技術(shù)計(jì)劃項(xiàng)目（No.2014020046）；遼寧省教育廳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)研究項(xiàng)目（No.LZ2015053）

＊副主任藥師。研究方向：藥事管理、新藥開發(fā)。電話：0539-8769177。E-mail：yylinxh@163.com

副教授，博士。研究方向：靶向給藥系統(tǒng)。電話：0411-85890170。E-mail：lixuetao1979@163.com

（2016-01-06

2016-03-15）