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        瑪咖粉對腎陽虛證卵巢早衰模型大鼠卵巢的養(yǎng)護作用研究Δ

        2016-11-18 03:05:03劉帥帥郭起岳林基偉吳知凡孫曉生廣州中醫(yī)藥大學(xué)廣州50006劉敏如女科醫(yī)系研究院廣東深圳58000深圳三九門診部廣東深圳58000廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心廣東佛山52828
        中國藥房 2016年28期
        關(guān)鍵詞:動情周期陽虛證造模

        王 凱,劉帥帥,郭起岳,林基偉,吳知凡,孫曉生#(.廣州中醫(yī)藥大學(xué),廣州 50006;2.劉敏如女科醫(yī)系研究院,廣東深圳 58000;3.深圳三九門診部,廣東深圳 58000;.廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心,廣東佛山52828)

        瑪咖粉對腎陽虛證卵巢早衰模型大鼠卵巢的養(yǎng)護作用研究Δ

        王凱1,2,3*,劉帥帥1,郭起岳4,林基偉1,吳知凡1,孫曉生1#(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué),廣州510006;2.劉敏如女科醫(yī)系研究院,廣東深圳518000;3.深圳三九門診部,廣東深圳518000;4.廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心,廣東佛山528248)

        目的:考察瑪咖粉對腎陽虛證卵巢早衰(POF)模型大鼠卵巢的養(yǎng)護作用。方法:將40只成年性成熟大鼠(♀)隨機分為正常組、模型組、淫羊藿組[陽性藥物,1 g/(kg·d)]和瑪咖粉低、高劑量組[2.5、5 g/(kg·d)],每組8只。除正常組外,其余各組大鼠每天im氫化可的松[32 mg/(kg·d)],連續(xù)12 d,復(fù)制腎陽虛證POF模型。成模后,各給藥組大鼠ig相應(yīng)藥物,正常組和模型組大鼠ig純凈水,每天上、下午各給藥1次,連續(xù)14 d。觀察各組大鼠體質(zhì)量、攝食量、卵巢指數(shù)、子宮指數(shù)、動情周期以及血清生殖激素[雌二醇(E2)、卵泡刺激素(FSH)、促黃體生成素(LH)]水平的變化。結(jié)果:給藥結(jié)束后,與正常組比較,模型組大鼠體質(zhì)量、卵巢指數(shù)降低,動情周期紊亂,血清中E2含量減少,血清中FSH、LH水平以及FSH/LH比值升高(P<0.05或P<0.01)。與模型組比較,淫羊藿組和瑪卡粉高劑量組大鼠動情周期紊亂情況、卵巢指數(shù)以及血清生殖激素水平得到明顯改善(P<0.05);瑪卡粉低劑量組大鼠僅卵巢指數(shù)和血清中LH水平明顯改善(P<0.05),其余各指標差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論:高劑量瑪咖粉能較好地恢復(fù)腎陽虛證POF大鼠的卵巢功能,恢復(fù)紊亂的動情周期,改善卵巢指數(shù)和血清生殖激素水平,對卵巢有一定的養(yǎng)護作用。

        瑪咖粉;腎陽虛證;卵巢早衰;養(yǎng)護;大鼠

        卵巢早衰(Premature ovarian failure,POF)是指女性40歲以前出現(xiàn)絕經(jīng)或下丘腦性閉經(jīng),伴見圍絕期癥狀群,具有高促性腺激素和低雌激素特征的婦科疑難病[1-2],也是婦科內(nèi)分泌領(lǐng)域的常見疾病,約占婦女人群的1%~3%,且其發(fā)病呈逐年上升和年輕化趨勢[3-4]。POF與中醫(yī)婦產(chǎn)科的不孕、月經(jīng)過少、閉經(jīng)、血枯、未老經(jīng)水?dāng)?、絕經(jīng)前后諸癥特點類似。腎陽虛證是POF常見證型之一[2,5],治療腎陽虛證常用補腎陽藥物,腎陽虛證動物實驗中氫化可的松是最早使用的公認造模藥物[6-7]。

        瑪咖又稱瑪卡,原產(chǎn)于秘魯,屬一年生或兩年生草本植物,是歷史悠久的藥食同源植物,也是世界十大暢銷保健品之一[8]。其富含多種營養(yǎng)成分和天然植物活性成分,具有補腎陽、提高生育力、緩解更年期綜合征等作用,長期服用能預(yù)防和緩解多種慢性疾病[9]?,斂аa腎陽功效明顯[10],但研究一般針對男性或雄性動物為主,針對女性或雌性動物研究較少,針對POF的研究則更少?,斂恰懊佤攪鴮殹?,有“南美人參”美譽和“天然偉哥”稱號[11],且研究表明瑪咖屬于無毒級產(chǎn)品[12]。中國引入瑪咖十余年,于2011年被批為新資源食品。國家鼓勵對新資源食品進行研究,對瑪咖的保健功效、治療作用也在進一步的研究中。鑒于此,筆者擬通過使用氫化可的松復(fù)制腎陽虛證POF大鼠模型,選用瑪咖粉與傳統(tǒng)補腎陽中藥淫羊藿飲片進行治療,考察瑪咖粉對大鼠腎陽虛證POF的改善作用,評價瑪咖溫補腎陽、養(yǎng)護卵巢的功效,探索藥食同源基礎(chǔ)。

        1 材料

        1.1儀器

        BS-3000A電子天平(上海友聲衡器有限公司);BS224S電子天平(北京賽多利斯儀器有限公司);自動放射免疫分析儀(中國科大中佳公司)。

        1.2藥品與試劑

        氫化可的松注射液(國藥集團容生制藥有限公司,批號:1411403-A12,規(guī)格:20 ml∶100 mg);瑪咖粉(秘魯綠寶公司,批號:0803,規(guī)格:180 g/瓶);淫羊藿破壁飲片[簡稱淫羊藿,中山中智藥業(yè)集團,批號:20150304,規(guī)格:含淫羊藿苷1.1 g/100 g、總黃酮(以蘆丁計)2.0 g/100 g];雌二醇(E2,批號:20151220)、卵泡刺激素(FSH,批號:20160102)、促黃體生成素(LH)放射免疫試劑盒均購自北京北方生物技術(shù)研究所;其余試劑均為分析純。

        1.3動物

        性成熟SD大鼠40只(未孕未產(chǎn)),SPF級,♀,體質(zhì)量200~240 g,8~9周齡,購自廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心[實驗動物使用許可證號:SYXK(粵)2013-0002]。將大鼠檢疫3 d,期間每天檢查大鼠1次,如發(fā)現(xiàn)不健康的大鼠立即剔除,選用健康大鼠進行實驗。動物飼養(yǎng)于廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心SPF級動物房,每箱5~6只,飼養(yǎng)溫度為20~26℃,相對濕度為40%~70%,采用10 h∶14 h晝夜間斷照明。飼養(yǎng)期間自由進食、飲水。

        2 方法

        2.1分組、造模與給藥

        將納入實驗的大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后隨機分為正常組、模型組、淫羊藿組[1 g/(kg·d)]和瑪咖粉低、高劑量組[2.5、5 g/(kg·d)],每組8只。除正常組外,其余各組大鼠每天上午于后下肢im氫化可的松注射液32 mg/(kg·d)復(fù)制POF模型,每天1次,連續(xù)12 d。成模后,各給藥組大鼠ig相應(yīng)藥物,正常組和模型組大鼠ig純凈水,每天上午和下午各給藥1次,連續(xù)14 d。淫羊藿給藥劑量為成人用藥劑量的等效劑量,瑪咖粉低、高劑量為成人用量劑量的等效和2倍劑量。

        2.2一般情況觀察

        造模和給藥期間,每天觀察并記錄大鼠體形、被毛、皮膚、糞便、肌肉張力、步態(tài)、精神、呼吸、進食等情況,同時觀察是否出現(xiàn)外生殖器潮濕、陰道口變大、觸之興奮等反應(yīng),以及注射部位是否有潰瘍創(chuàng)面形成等情況。并且每5天稱量大鼠體質(zhì)量1次,每周測量大鼠攝食量1次。

        2.3動情周期檢查

        從造模第1天起,每天上午取大鼠進行連續(xù)陰道涂片,性周期消失或紊亂可確定造模成功。涂片后在光鏡下觀察,根據(jù)陰道細胞形態(tài)判斷大鼠動情周期。動情前期:光鏡下以橢圓形有核上皮細胞占多數(shù),白細胞和角質(zhì)化上皮細胞很少;動情期:以片狀角化上皮細胞為主,白細胞和有核上皮細胞很少;動情后期:片狀角質(zhì)化上皮細胞、有核上皮細胞和白細胞3種細胞均有,且比例無明顯異常;動情間期:白細胞占絕大多數(shù),有核上皮細胞和角質(zhì)化上皮細胞很少。

        2.4血清中生殖相關(guān)激素水平及臟器指數(shù)檢測

        末次給藥后24 h,大鼠腹主動脈采血,離心。取血清,采用放射免疫法按照相應(yīng)試劑盒說明書操作測定血清中E2、FSH、LH水平,并計算FSH與LH百分比(FSH/LH×100%)。采血后處死大鼠,取子宮及雙側(cè)卵巢,洗凈后分別稱定臟器濕質(zhì)量,計算臟器指數(shù):臟器指數(shù)=臟器濕質(zhì)量(mg)/體質(zhì)量(100g)。

        2.5統(tǒng)計學(xué)方法

        3 結(jié)果

        3.1一般情況

        造模大鼠在首次注射氫化可的松約1 h后均出現(xiàn)精神萎靡、蜷縮、活動減少、嗜睡等癥狀。持續(xù)注射氫化可的松至12 d后,大鼠精神萎靡、蜷縮、怕冷等癥狀明顯加重,出現(xiàn)豎毛、毛無光澤、飲食減少、體質(zhì)量降低、拱背少動、反應(yīng)遲鈍、呼吸深遲的癥狀,并伴有外生殖器潮濕、陰道口變大、觸之興奮等動情期反應(yīng)。

        3.2體質(zhì)量和攝食量

        造模前,各組大鼠體質(zhì)量差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。模型組大鼠在造模6 d后體質(zhì)量較正常組顯著降低,在造模期間以及給藥1周后攝食量較正常組顯著減少(P<0.05);給藥2周后攝食量較正常組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。各給藥組大鼠在造模和給藥期間體質(zhì)量和攝食量較模型組差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。各組大鼠不同時期體質(zhì)量測定結(jié)果見表1、攝食量測定結(jié)果見表2。

        3.3動情周期

        造模結(jié)束后,造模組大鼠均發(fā)生動情周期紊亂現(xiàn)象,全部造模成功。給藥1周后,各給藥組大鼠動情周期紊亂現(xiàn)象有所改善,但較模型組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。給藥2周后,淫羊藿組和瑪咖粉高劑量組大鼠較模型組動情周期紊亂情況明顯好轉(zhuǎn)(P<0.05),高劑量瑪咖粉與淫羊藿作用效果相當(dāng)。各組大鼠不同時期動情周期測定結(jié)果見表3。

        表1 各組大鼠不同時期體質(zhì)量測定結(jié)果(±s,n=8,g)Tab 1 Body weight of rats in different groups at different stages(±s,n=8,g)

        表1 各組大鼠不同時期體質(zhì)量測定結(jié)果(±s,n=8,g)Tab 1 Body weight of rats in different groups at different stages(±s,n=8,g)

        注:與正常組比較,*P<0.05,**P<0.01Note:vs.normal group,*P<0.05,**P<0.01

        組別正常組模型組淫羊藿組瑪咖粉低劑量組瑪咖粉高劑量組劑量,g/(kg·d)1 2.5 5造模前243.9±11.0 244.3±13.9 247.0±9.1 249.9±10.2 242.3±7.5造模第6天270.2±13.9 239.9±11.1**239.6±15.6 239.2±13.0 238.0±8.0造模第11天288.6±18.0 240.4±13.0**249.1±13.5 249.6±11.3 242.3±15.2給藥第1天296.5±17.7 240.4±12.9**248.6±13.2 253.5±12.5 244.4±14.2給藥第6天296.1±14.8 254.5±12.8**248.6±13.2 271.0±9.3 253.6±13.7給藥第11天296.1±20.1 260.8±15.0**260.0±14.1 283.6±19.0 268.1±16.1給藥結(jié)束310.8±20.0 273.4±21.4*271.4±19.1 293.4±24.0 271.4±25.8

        表2 各組大鼠不同時期攝食量測定結(jié)果(±s,n=8,g)Tab 2 Food intake of rats in different groups at different stages(±s,n=8,g)

        表2 各組大鼠不同時期攝食量測定結(jié)果(±s,n=8,g)Tab 2 Food intake of rats in different groups at different stages(±s,n=8,g)

        注:與正常組比較,*P<0.01Note:vs.normal group,*P<0.01

        組別正常組模型組淫羊藿組瑪咖粉低劑量組瑪咖粉高劑量組劑量,g/(kg·d)1造模第1周29.0±1.2 21.0±1.8*20.6±2.7 19.0±2.4 20.3±2.4給藥第2周26.0±2.0 25.5±1.2 25.9±1.9 23.7±3.0 23.8±0.9造模第2周28.1±1.8 19.1±4.2*19.9±3.0 18.7±3.1 15.9±3.1給藥第1周25.5±1.5 22.9±1.3*22.2±3.3 23.0±0.9 22.5±0.9 2.5 5

        表3 各組大鼠不同時期動情周期測定結(jié)果[只(%%)]Tab 3 Estrous cycle disturbance of rats in different groups at different stages[rat(%%)]

        3.4血清生殖激素水平

        與正常組比較,模型組大鼠血清中E2水平降低,F(xiàn)SH、LH水平及FSH/LH比值升高(P<0.05)。與模型組比較,淫羊藿組大鼠血清中E2、FSH水平升高,LH水平及FSH/LH比值降低(P<0.05或P<0.01);瑪咖粉低劑量組大鼠血清中LH水平降低(P<0.05),其余指標雖有一定改善,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);瑪咖粉高劑量組大鼠血清中E2水平升高,F(xiàn)SH、LH水平以及FSH/LH比值降低(P<0.05或P<0.01),且高劑量瑪咖粉與淫羊藿作用效果相當(dāng)。各組大鼠血清生殖激素水平測定結(jié)果見表4。

        表4 各組大鼠血清生殖激素水平測定結(jié)果(±s,n=8)Tab 4 Serum hormone levels of rats in different groups(±s,n=8)

        表4 各組大鼠血清生殖激素水平測定結(jié)果(±s,n=8)Tab 4 Serum hormone levels of rats in different groups(±s,n=8)

        注:與正常組比較,*P<0.05,**P<0.01;與模型組比較,#P<0.05,##P<0.01Note:vs.normal group,*P<0.05,**P<0.01;vs.model group,#P<0.05,##P<0.01

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        3.5臟器指數(shù)

        模型組大鼠卵巢指數(shù)、子宮指數(shù)均低于正常組,其中卵巢指數(shù)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。各給藥組大鼠卵巢指數(shù)均高于模型組(P<0.01);子宮指數(shù)均低于模型組,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。各組大鼠卵巢、子宮指數(shù)測定結(jié)果見表5。

        表5 各組大鼠卵巢、子宮指數(shù)測定結(jié)果(±s,n=8,mg/100g)Tab 5 Ovary and uterus index of rats in different groups(±s,n=8,mg/100g)

        表5 各組大鼠卵巢、子宮指數(shù)測定結(jié)果(±s,n=8,mg/100g)Tab 5 Ovary and uterus index of rats in different groups(±s,n=8,mg/100g)

        注:與正常組比較,*P<0.01;與模型組比較,#P<0.01Note:vs.normal group,*P<0.01;vs.model group,#P<0.01

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        4 討論

        淫羊藿是公認的經(jīng)典溫補腎陽的中藥,其在《神農(nóng)本草經(jīng)》中被列為中品,性溫,味辛、甘,歸肝、腎經(jīng),具有溫補腎陽、驅(qū)風(fēng)除濕之功。應(yīng)用淫羊藿治療腎陽虛證安全、無毒[13]。在現(xiàn)代治療卵巢早衰的使用頻率最高的前10名中藥中,補腎陽藥淫羊藿排名第6位[14],因此本文以其為陽性對照藥。

        本實驗通過長時間、大劑量給予外源性糖皮質(zhì)激素,抑制垂體促腎上腺皮質(zhì)激素釋放,使腎上腺皮質(zhì)分泌類固醇激素減少,從而使大鼠出現(xiàn)一系列耗竭現(xiàn)象,形成腎陽虛證POF模型,影響動情周期。卵巢分泌的雌激素中E2是最重要的一種,卵巢分泌的性激素逆向影響下丘腦-垂體產(chǎn)生和釋放內(nèi)分泌激素,發(fā)生正反饋和負反饋作用,間接影響卵巢的形態(tài)和功能,影響卵巢發(fā)育[15]。腎陽虛證POF雌激素分泌減少會影響卵巢正常生長。中醫(yī)理論中月經(jīng)周期同時受“腎-天癸-沖任-胞宮”軸調(diào)控,功能與“下丘腦-垂體-卵巢-子宮”環(huán)路逐級對應(yīng)。腎陽虛證影響腎氣生發(fā)與天癸生成,進而影響沖任和胞宮的功能,最終表現(xiàn)為腎陽虛癥狀和動情周期紊亂或消失。不孕癥卵巢體積(MOV)及基礎(chǔ)竇卵泡數(shù)(AFC)與年齡成反比[16],MOV與卵巢指數(shù)相關(guān),能反映卵巢功能。本實驗中,造模后大鼠的卵巢指數(shù)明顯降低,給予瑪咖粉后卵巢指數(shù)又升高,這說明瑪咖對腎陽虛證大鼠卵巢有較好的促進生長和修復(fù)作用。造模2周后,因沒有持續(xù)刺激,大鼠攝食量略有增多、體質(zhì)量緩慢恢復(fù)增長,腎陽虛證得到改善。

        FSH、LH是垂體分泌的促性腺激素,F(xiàn)SH、LH水平升高是POF的早期變化,F(xiàn)SH/LH比值升高說明卵巢功能下降,基礎(chǔ)FSH/LH比值能敏感反映卵巢儲備功能狀態(tài)[1,17]。POF患者卵巢分泌的雌激素下降,對垂體的負反饋減弱或消失,導(dǎo)致FSH、LH水平升高。卵巢顆粒細胞分泌抑制素(Inhibin,分為InhibinA和Inhibin B)對垂體的FSH合成和分泌有反饋抑制作用,Inhibin B水平與FSH、LH水平以及FSH/LH比值呈負相關(guān)[18]。POF的卵巢功能下降,Inhibin分泌減少,從而對FSH分泌的抑制減弱,F(xiàn)SH水平升高比LH快,導(dǎo)致FSH/LH比值的升高。本實驗相關(guān)指標的變化均符合腎陽虛證POF模型特征,表明造模成功。在給藥后,與模型組比較,瑪咖粉高劑量組和淫羊藿組大鼠血清中E2水平明顯升高、LH水平和FSH/LH比值明顯降低,而瑪咖粉低劑量組大鼠血清中僅LH明顯降低,說明高劑量瑪咖粉和淫羊藿養(yǎng)護卵巢、補腎陽的功效優(yōu)于低劑量瑪咖粉。從FSH水平來看,瑪咖粉高劑量組略優(yōu)于淫羊藿組,但瑪咖粉改善腎陽虛狀態(tài)、養(yǎng)護卵巢的療效與最佳劑量尚需進一步探討。在造模和給藥期間,模型組大鼠的體質(zhì)量和攝食量均低于正常組,說明腎陽虛影響脾陽虛、脾主肌肉四肢,從而影響了脾胃功能,表現(xiàn)為攝食量和體質(zhì)量減少。淫羊藿組和瑪咖粉低、高劑量組大鼠的體質(zhì)量和攝食量雖從數(shù)值上略優(yōu)于模型組,但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。這可能與給藥時間不夠長,雖有一定藥效改善脾腎陽狀態(tài),但灌胃液占據(jù)一定胃部空間影響進食量,以及大鼠有較強的自愈能力相關(guān)。

        綜上所述,采用氫化可的松造模后大鼠出現(xiàn)腎陽虛證,且動情周期消失或紊亂,卵巢指數(shù)降低,血清性激素水平明顯改變,表現(xiàn)為POF特征。瑪咖粉組和淫羊藿組ig給藥后大鼠腎陽虛證得到較明顯改善,卵巢指數(shù)提高、血清性激素水平改善、動情周期明顯恢復(fù)。這說明瑪咖粉對腎陽虛證POF模型大鼠有較好的改善作用,以高劑量組療效略優(yōu),療效與劑量可能呈一定的正相關(guān),值得進一步研究。

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        (編輯:林靜)

        Maintenance Effects of Lepidium meyenii Powder on Ovary of Premature Ovarian Failure Model Rats with Kidney-Yang Deficiency Pattern

        WANG Kai1,2,3,LIU Shuaishuai1,GUO Qiyue4,LIN Jiwei1,WU Zhifan1,SUN Xiaosheng1(1.Guangzhou University of TCM,Guangzhou 510006,China;2.Institute of Liu Minru’TCM Gynecology,Guangdong Shenzhen 518000,China;3.Shenzhen San-jiu Outpatient Department,Guangdong Shenzhen 518000,China;4.Guangdong Medical Laboratory Animal Center,Guangdong Foshan 528248,China)

        OBJECTIVE:To investigate the maintenance effects of Lepidium meyenii powder on ovary of premature ovarian failure(POF)model rats with Kidney-Yang deficiency pattern.METHODS:40 sexually mature rats(♀)were randomly divided to normal group,model group,epimedium group[positive drug,1 g/(kg·d)],L.meyenii powder low-dose and high-dose groups [2.5,5 g/(kg·d)]with 8 rats in each group.Except for normal group,those groups were given hydrocortisone[32 mg/(kg·d)]intramuscularly every day,for consecutive 12 d to induce Kidney-Yang deficiency pattern POF model.After modeling,treatment groups were given relevant drugs intragastrically,and normal group and model group were given purified water intragastrically,twice a day,morning and afternoon,for consecutive 14 d.The changes of body weight,food consumption,ovary index,uterus index,estrous cycle and serum reproductive hormone(E2,F(xiàn)SH,LH)were observed in each group.RESULTS:At the end of administration,compared with normal group,body weight,ovary index and serum level of E2decreased and estrous cycle disturbance was found in model group;while the levels of FSH and LH in serum,F(xiàn)SH/LH ratio increased(P<0.05 or P<0.01).Compared with model group,estrous cycle disturbance,ovary index and serum reproductive hormone level were improved significantly in epimedium group and L.meyenii powder high-dose group(P<0.05).Only ovary index and serum level of LH were improved significantly in L.meyenii powder low-dose group(P<0.05),there was no statistical significance in other index(P>0.05).CONCLUSIONS:High-dose L.meyenii powder could promote the recovery of ovary function and the estrous cycle,and improve the ovary index and serum reproductive hormone level in POF model rats with Kidney-Yang deficiency pattern.It shows certain effect on the maintenance of ovarium.

        Lepidium meyenii powder;Kidney-Yang deficiency pattern;Premature ovarian failure;Maintenance;Rats

        R285

        A

        1001-0408(2016)28-3929-04

        10.6039/j.issn.1001-0408.2016.28.12

        廣東省教育部產(chǎn)學(xué)研結(jié)合基金項目(No.2012B091-100485)

        *博士。研究方向:中醫(yī)養(yǎng)生學(xué)。E-mail:160940860@qq.com

        教授,博士生導(dǎo)師。研究方向:中醫(yī)養(yǎng)生學(xué)。E-mail:sunxiaosheng@gzucm.edu.cn

        (2016-03-02

        2016-07-27)

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