虎春艷 趙聲蘭 劉海鷗 林玉萍

云南中醫(yī)學院中藥學院，云南 昆明 650500

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紫色胡蘿卜中花青素的提取、分離及抗氧化活性研究

虎春艷 趙聲蘭 劉海鷗 林玉萍*

云南中醫(yī)學院中藥學院，云南 昆明 650500

目的：從紫色胡蘿卜中提取、分離花青素，并對提取所得的花青素進行體外抗氧化活性研究。方法：以維生素C作為陽性對照，研究不同濃度的花青素對·OH 、H2O2、O2-·的清除效果。結果：從紫色胡蘿卜提取所得的花青素對·OH 、H2O2、O2-·均有較好的清除率。結論：紫色胡蘿卜中分離提取的花青素有較好的抗氧化活性。

紫色胡蘿卜；花青素；抗氧化；提取分離

紫色胡蘿卜(Purple Carrot)為十字花科蘿卜屬植物，成熟于秋冬季節(jié)。紫色胡蘿卜富含多酚，維生素和β-胡蘿卜素等物質(zhì)外，還含有豐富的花青素(Anthocyanins)。花青素又稱花色素，是一類廣泛存在于植物中的水溶性天然色素， 屬黃酮類化合物[1]，多以糖苷的形式存在，也稱花色苷。從紅葡萄渣中提取的葡萄皮紅是最早且最豐富的花青素， 它于1879年在意大利上市[2]。花青素作為一種天然食用色素，安全、無毒、資源豐富，而且具有一定營養(yǎng)和藥理作用，在食品、 化妝品和醫(yī)藥等方面有著巨大的應用潛力。

研究發(fā)現(xiàn)，紫色胡蘿卜中所含的花青素主要為穩(wěn)定性較高且生物活性較好的?；ㄇ嗨?，其含量占總花青素的70%以上[3]?；ㄇ嗨啬軠p少動脈粥樣硬化[4-5]，具有抗腫瘤[7]，抗菌消炎[7]，以及清除自由基的抗氧化作用[4,6,8]。在機體的新陳代謝過程中會產(chǎn)生超氧自由基、羥自由基等基團都是很多生理和病理的積極參與者[9]。國內(nèi)對紫色胡蘿卜的研究較少，導致營養(yǎng)價值極高的紫色胡蘿卜一直沒有被大眾所認識[10]。而歐美等國將紫色胡蘿卜作為一種保健食品被大量種植，紫色胡蘿卜汁也深受大眾喜愛[3-7]。本研究系統(tǒng)研究了紫色胡蘿卜中花青素的提取、分離及體外抗氧化活性，為紫色胡蘿卜的深度開發(fā)研究奠定一定的基礎。

1 儀器與材料

1.1 儀器 UV-2450型紫外可見分光光度計(島津企業(yè)管理(中國)有限公司)；CP214型號電子天平(奧豪斯儀器(上海)有限公司)； TG16-WS高速臺式離心機(長沙湘儀離心機儀器有限公司)；H.H.S11-4R型電熱恒溫水浴鍋(上海醫(yī)療器械五廠)。

1.2 材料 硫酸亞鐵、鄰二氮菲、過氧化氫30%、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、鄰苯三酚、三(羥甲基)氨基甲烷(Tris)、硫酸亞鐵、無水乙醇、濃硫酸、濃鹽酸等均為國產(chǎn)分析純，為汕頭市達濠精細化學品有限公司產(chǎn)品；紫色胡蘿卜購買自云南滇東北地區(qū)。

2 方法

2.1 花青素的提取 取一定量的新鮮紫色胡蘿卜，去芯、充分搗碎后稱量放入燒瓶內(nèi)，加入80%的乙醇(料液比為1∶2)，調(diào)節(jié)pH為3～4，在50℃水浴下回流提取1h，趁熱抽濾，濾渣再用80%的乙醇回流提取30min，趁熱抽濾。合并提取液，并將其旋轉蒸發(fā)至無醇味，真空冷凍干燥得粗品。

2.2 花青素的分離、純化 采用AB-8型大孔樹脂對粗提的花青素進行純化。其純化流程為：花青素粗體物→AB-8型大孔樹脂吸附1 h→用蒸餾水洗脫糖類、色素等→10%的乙醇(pH=4)洗脫雜質(zhì)→30%乙醇洗脫雜質(zhì)(pH=3～4)→80%乙醇洗脫(pH=3～4)→旋蒸(40℃、30r/min)→花青素純化液→真空冷凍干燥→樣品低溫(4℃以下較好)保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 不同濃度的待測液對·OH的清除率 羥自由基清除率的測定方法參考文獻[11-12]，10mL具塞試管中加不同濃度的待測液1mL，依次加入1mL 0.75mmol/L FeSO4，1mL 0.75mmol/L鄰二氮菲，最后加入0.01% H2O21mL，37℃保溫1h，4mL蒸餾水調(diào)零，在536nm下測定吸光度?？瞻坠苡?mL蒸餾水代替花青素，1mL蒸餾水代替0.01% H2O2，損傷管用1mL蒸餾水代替花青素，樣品空白管用1mL蒸餾水代替0.01% H2O2。

式中，A0為空白管的吸光值；A1為損傷管的吸光值；A2為樣品空白管的吸光值；A3為樣品對照管的吸光值。

2.4 不同濃度的待測液對H2O2的清除率 測定方法參考文獻[12-13]，25mL具塞試管中加不同濃度的待測液1mL，加入40mmol/LH2O22.5mL，加入6.5mL蒸餾水，室溫反應10min后在230nm下測定吸光度?？瞻坠苡?mL蒸餾水代替花青素，樣品空白管用2.5mL蒸餾水代替H2O2。

式中， A0為不加花青素的吸光度；A1為樣品對照組的吸光度即加花青素又加40mmol/LH2O2；A2為不加40mmol/LH2O2的吸光度。

2.5 不同濃度的待測液對O2-·的清除率 采用鄰苯三酚自氧化法產(chǎn)生O2-·，加不同濃度待測液進行清除，測定方法參考文獻[8-12]，并略做修改。10mL具塞試管中加入1.5mL0.05mol/LTris-HCl緩沖溶液(pH=8.2)，1.5mL蒸餾水，搖勻，25℃水浴中保溫20min，取出后立即加入25℃預熱過的3mmol/L鄰苯三酚0.5mL(以10mmol/L的HCl配制，空白管用10mmol/L的HCl代替鄰苯三酚)迅速搖勻后倒入比色杯中，在325nm處測定吸光度，計算線性范圍內(nèi)每1min吸光度的增加值，即為鄰苯三酚的自氧化速率ΔA對照。測定待測樣品時加入鄰苯三酚前先加入一定量(1.5mL)的待測物(不同濃度的花青素)，同時減少同體積的蒸餾水，其余操作同上，測出ΔA樣品。

按上式計算出超氧陰離子的清除率。

3 結果與討論

3.1 花青素的提取、分離 提取液制備過程中需操作迅速，減少花青素的氧化，提高提取率。先處理好樹脂備用，花青素提取液制備好后立即上樣。質(zhì)量濃度為3g/mL上樣速率為2mL/min，洗脫速率為2mL/min，洗脫體積隨上樣體積增大而增大，可根據(jù)顏色變化進行下樣，即顏色由暗紫色變?yōu)闇\紫色，紫色部分即為有效的花青素。240 g新鮮的紫色胡蘿卜用乙醇提取，經(jīng)大孔樹脂洗脫純化后，再經(jīng)旋蒸冷凍干燥可得花青素樣品約0.3g。由此可知花青素的提取率為0.125%。

由圖1可知，紫色胡蘿卜提取物最大吸收波長在526nm，而520～530nm為花色苷類物質(zhì)的特征吸收峰，與文獻報道花青素的紫外-可見吸收光譜一致[14]。

3.2 不同濃度的待測液對·OH的清除率 由圖2知，隨著花青素和Vc濃度的增大，其對·OH的清除率逐漸增大，并且在同濃度下，Vc對·OH的清除率要稍高于紫色胡蘿卜中花青素對·OH的清除率?；ㄇ嗨貪舛葹?.5mg/mL時，其清除率達到了50%以上；花青素濃度為3.0mg/mL時，其對·OH的清除率為87%，由此可以知道從紫色胡蘿卜中提取的花青素具有較強的抗氧化活性。Vc在0.6mg/mL時清除率就已經(jīng)達到50%以上，3.0mg/mL時對·OH的清除率能達到94%。在較高濃度下，花青素和Vc對·OH的清除率比較接近。

3.3 不同濃度的待測液對H2O2的清除率 由圖3可知，隨著花青素和Vc的濃度不斷增大，其對H2O2的清除率也不斷增大，花青素的清除率呈現(xiàn)出良好的線性關系。在花青素濃度為1.5mg/mL時，花青素對H2O2的清除率就能到達50%，但Vc在其濃度為2.0mg/mL時，對H2O2的清除率才能達到50%以上； 當濃度低于2.0mg/mL時，花青素對H2O2的清除率高于Vc對H2O2的清除率；當濃度大于2.0mg/mL時，花青素對H2O2的清除率低于Vc對H2O2的清除率。

3.4 不同濃度的待測液對O2-·的清除率 由圖4、5可知，花青素對O2-·的清除率隨濃度的增大而增大，當花青素的濃度為為1.5mg/mL時達到50%以上，在濃度為2.0mg/mL時，其對O2-·的清除率達到90%。濃度越大，對O2-·的清除效果越好。當濃度為0.08mg/mL時，Vc對O2-·的清除率達到了96.67%，在0.04mg/mL時達到50%以上。花青素濃度為1.41mg/mL對O2-·的清除率相當于0.04mg/mL的Vc對O2-·的清除率。從數(shù)據(jù)可看出，Vc對O2-·清除率高于紫色胡蘿卜中的花青素對O2-·清除率。

4 結論

本實驗研究了紫色胡蘿卜中花青素的提取、分離，并對所得花青素進行抗氧化活性的研究。結果表明，紫色胡蘿卜中提取所得的花青素有很好的抗氧化活性，但其抗氧化活性沒有同濃度的維生素C的活性高，這可能是在花青素的提取分離過程中的部分環(huán)節(jié)，導致部分花青素聚集體解離、失去了活性。通過該研究，增加了花青素的來源，提高紫色胡蘿卜的利用價值；使花青素在醫(yī)藥和保健等領域能夠得到更好的應用；此外紫色胡蘿卜物美價廉，含有豐富的糖類物質(zhì)，本身具有很好的口感，可以作為很好的保健飲品在日常飲食和市場中推廣。

[1]Anna R, Renato C N, Daniela V, et al. Modification of glass transition temperature through carbohydrates addition and anthocyanin and soluble phenol stability of frozen blueberry juices[J]. J Food Eng, 2003，56(2-3) :229 -231.

[2]Joao R.M. A, Eleonora D’A, Anja P, et al. Characterization of major enzymes and genes involved in flavonoid and proanthocyanidin biosynthesis during fruit development in strawberry (Fragaria×ananassa)[J]. Arch Biochem Biophys, 2007, 465(1) :61 -71.

[3]Anne C K, Beverly A C, Steven J B, et al. Plasma and Urine Responses Are Lower for Acylated vs Nonacylated Anthocyanins from Raw and Cooked Purple Carrots [J]. Agric. Food Chem，2005，53: 6537-6542.

[4]Ghiselli A, Nardini M, Baldi A, et al. Antioxidant activity of different phenolic fractions separated from an Italian red wine[J]. Agric. Food Chem，1998, 46: 361-367.[5]Kaplan M, Hayek T, Raz A, et al. Pomegranate juice supplementation to atheroscleroticmice reduces macrophage lipid peroxidation, cellular cholesterol accumulation and development of atherosclerosis[J]. Nutr，2001, 131: 2082-2089.

[6]Katsube N, Iwashita K, Tsushida T, et al. Induction of apoptosis in cancer cells by Bilberry (Vaccinium myrtillus) and the anthocyanins[J].Agric.Food Chem，2003, 51: 68-75.

[7]Youdim K A, McDonald J, Kalt W, et al. Potential role of dietary flavonoids in reducing microvascular endothelium vulnerability to oxidative and inflammatory insults (small star, filled)[J]. Nutr. Biochem，2002, 13: 282-288.

[8]張鏡，刁樹平. 海南蒲桃果實原花青素的體外抗氧化活性[J]. 食品科學，2012, 33(17):101-105.

[9]Gelvan D, Saltman P, Powell S R. Cardiac reperfusion damage prevented by a nitroxide free radical [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1991, 88: 4680-4684.

[10]Randi S, Gjermund V, Elisabeth O, et al. Influence of Field Attack by Carrot Psyllid (Trioza apicalis Fo rster) on Sensory Quality, Antioxidant Capacity and Content of Terpenes, Falcarindiol and 6 Methoxymellein of Carrots (Daucus carota L.) [J]. Agric.Food Chem，2013, 61:2831-2838.

[11]趙聲蘭，陳進偉，劉芳，等.豬牙皂多糖提取工藝及體外抗氧化活性的研究[J]. 云南中醫(yī)學院學報， 2010，33(4): 15-18.

[12]虎春艷，林玉萍，魯瑞,等.紫色胡蘿卜汁體外抗氧化活性的研究[J].中國釀造，2015，34(1):85-88.

[13]張春梅，陳朝銀，趙聲蘭，等. 核桃內(nèi)種皮多酚提取工藝及體外抗氧化活性的初步研究[J]. 中國釀造， 2014，33(7) : 130-134.

[14]韓文斌. 紫甘薯花色苷提取工藝與組分分析及其穩(wěn)定性和氧化性研究[D].南京：南京農(nóng)業(yè)大學食品科技學院，2007.

(編輯：程鵬飛)

Extraction,Sseparation and Antioxidant Activities in Vitro of Anthocyanins from Purple Carrot

HU Chunyan ZHAO Shenglan LIU haiou LIN Yuping*

College of Traditional Chinese Medicine, Yunnan University of Traditional Chinese Medicine, Kunming 650500, China

Objective To research the extraction, separation and antioxidant activities in vitro of anthocyanins in purple carrot.Methods Vitamin C as positive control, the study aimed to discuss The removing ability on ·OH, H2O2andO2-·of different concentration anthocyanins.Results The anthocyanins of purple carrot have clearance rate on ·OH, H2O2and O2-·.Conclusion The anthocyanins of purple carrot have good antioxidant activities.

Purple Carrot;Anthocyanins;Antioxidant;Extraction and Separation

2016-08-01

云南省教育廳重點項目(2014z119)。

虎春艷(1979-)，女，講師，碩士，主要從事天然產(chǎn)物活性成分及藥物化學研究。E-mail: 77461952@qq.com

林玉萍(1975-)女，副教授，碩士，主要從事天然藥物活性成分研究。E-mail: 11217005@qq.com

R284.2

A

1007-8517(2016)20-0033-03