陳少玫韋啟志奚勝艷李世勇

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬廈門市中醫(yī)院，福建 廈門 361009；2.廈門大學(xué)，福建 廈門 361000）

三蟲半夏白術(shù)天麻湯對偏頭痛大鼠腦組織5-HT1B/1D受體表達(dá)影響的實(shí)驗(yàn)研究*

陳少玫1△韋啟志1奚勝艷2李世勇1

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬廈門市中醫(yī)院，福建 廈門 361009；2.廈門大學(xué)，福建 廈門 361000）

目的 探索三蟲半夏白術(shù)天麻湯治療偏頭痛的作用機(jī)制。方法 建立硝酸甘油致大鼠偏頭痛模型，給予半夏白術(shù)天麻湯高、中、低劑量灌胃干預(yù)7 d，以苯甲酸利扎曲普坦為西藥陽性對照藥物，并予空白組、模型組進(jìn)行對照。運(yùn)用RT-PCR檢測5羥色胺1B、1D（5-HT1B/1D）受體的基因表達(dá)。結(jié)果 1）對5-HT1B受體表達(dá)的影響:與空白組相比，模型組顯著低于空白組（P＜0.01）；中藥低劑量組與空白組無顯著差異（P＞0.05），中藥中劑量組、中藥高劑量組、西藥組及聯(lián)合用藥組顯著低于空白組（P＜0.01）；中藥低、中、高劑量組、西藥組及聯(lián)合用藥組較模型組升高，但不具有顯著差異（P＞0.05）。2）對5-HT1D受體表達(dá)的影響:與空白組相比，中藥中劑量組顯著降低（P＜0.05），其余各組，與空白組相比較無顯著差異（P＞0.05）；與模型組相比，各組無顯著差異（P＞0.05）；與中藥中劑量組相比，空白組、中藥低劑量組、西藥組、聯(lián)合用藥組較中藥中劑量組顯著升高（P＜0.05），中藥高劑量組與中藥中劑量組相比無明顯差異（P＞0.05）。結(jié)論 5-HT1B/1D受體調(diào)節(jié)異常為偏頭痛的發(fā)病環(huán)節(jié)之一。三蟲半夏白術(shù)天麻湯可以提高偏頭痛大鼠腦組織5-HT1B受體的基因表達(dá)，對5-HT1D受體的基因表達(dá)具有雙向調(diào)節(jié)作用，臨床運(yùn)用，劑量不宜過大。

5-HT1B/1D受體激動劑 利扎曲普坦 偏頭痛 中醫(yī)藥 三蟲半夏白術(shù)天麻湯

偏頭痛是一種常見的神經(jīng)血管功能紊亂性疾病，臨床以反復(fù)發(fā)作的一側(cè)或雙側(cè)搏動性頭痛為特征。發(fā)作時伴有自主神經(jīng)功能紊亂，面色蒼白、心率加快、惡心、嘔吐、畏光等；間歇期一切如常人。本病反復(fù)發(fā)作，發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，可能與遺傳、內(nèi)分泌、血管、神經(jīng)遞質(zhì)、免疫等因素相關(guān)。2010年中國原發(fā)性頭痛流行病學(xué)調(diào)查顯示，偏頭痛發(fā)病率為9.3%，治療費(fèi)用高達(dá)873.6億元/年［1-2］。三蟲半夏白術(shù)天麻湯［3-5］為陳少玫教授所創(chuàng)制的臨床驗(yàn)方，運(yùn)用此方治療原發(fā)性頭痛可獲得較好效果［6-7］。本實(shí)驗(yàn)擬通過硝酸甘油致大鼠偏頭痛模型，探討該方對大鼠腦組織5羥色胺1B（5-HT1B）、5羥色胺1D（5-HT1D）受體表達(dá)的影響，為本方的臨床運(yùn)用提供科學(xué)依據(jù)?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)動物 清潔雄性SD大鼠，6～8周齡，體質(zhì)量（180～220）g，由上海新萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司生產(chǎn)，生產(chǎn)許可證號:SCXK（滬）2012-0002。實(shí)驗(yàn)動物質(zhì)量合格證:2015000505392。使用許可證號:SYXK（閩）2013-0006。

1．2 實(shí)驗(yàn)藥物 三蟲半夏白術(shù)天麻湯（由全蝎3 g，蜈蚣10 g，僵蠶10 g，法半夏10 g，天麻10 g，鉤藤15 g，川芎15 g，生蒲黃10 g，炒白術(shù)10 g，茯苓20 g，白芍30 g，甘草6 g組成），所用藥材為全成分顆粒，由廈門市中醫(yī)院全成分顆粒藥房提供，由北京康仁堂藥業(yè)生產(chǎn)。苯甲酸利扎曲普坦片（歐立停），規(guī)格:5 mg/片，歐立制藥有限公司，批號:150702。

1．3 試劑與儀器 硝酸甘油注射液，規(guī)格5 mg/mL，批號1401232，北京益民藥業(yè)有限公司；TaqDNA聚合酶、10×PCR Buffer［without Mg2+:100 mmol/L Tris-HCl pH 8.8 at 25℃；500 mmol/L KCl，0.8%（v/v）Nonidet］、MgCl2（25 mmol/L）、dNTP（10 mmol/L）、Marker、6×DNA Loading Dye（sangon）；10×TAE（400 mmol/L Tris-acetate and 10 mM EDTA，pH8.0）（sangon）；pMD 18-T Vector（寶生物）；引物（sangon）；Trizol提取試劑盒；第一鏈cDNA合成試劑盒 （AMV First Strand cDNA Synthesis Kit）（SK2445）；溴化乙錠；瓊脂糖.柱式DNA膠回收試劑盒（sangon SK8131）；一步法快速感受態(tài)細(xì)胞制備試劑盒（SK9307 sangon）；SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒（SK8191 sangon）。PCR反應(yīng)擴(kuò)增儀（美國ABI公司）；DYY-8型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（上海琪特分析儀器有限公司）；YXJ-2離心機(jī) （湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；H6-1微型電泳槽（上海精益有機(jī)玻璃制品儀器廠）；凝膠成像系統(tǒng) （上海復(fù)日科技有限公司）；TU-1901紫外分光光度計 （北京普析通用儀器有限公司）；移液器（范圍100～1000 μL，20～200 μL，0.5～10 μL）（加拿大BBI公司）；3730XL測序儀（美國ABI）；LightCycler480 Software Setup（Roche羅氏）。

1.4 分組及造模 清潔級雄性SD大鼠適應(yīng)環(huán)境3d后，10只皮下注射0.9%氯化鈉注射液2 mL/kg，每日1次，連續(xù)7 d，作為空白組；120只雄性SD大鼠分別皮下注射硝酸甘油注射劑10 mg/kg，每日1次，連續(xù)7 d，后隨機(jī)分為6組，即中藥低劑量組、中藥中劑量組、中藥高劑量組、西藥組、聯(lián)合用藥組、模型組。每組20只。

1.5 給藥方法 空白組每日給予蒸餾水10 mL/kg灌胃，其余6組造模成功后每日將相應(yīng)藥物用蒸餾水稀釋至10 mL/kg灌胃，連續(xù)7 d。中藥低、中、高劑量組分別按15、22.5、30 g/kg（相當(dāng)于60 kg成人日用量的6倍、9倍、12倍）予三蟲半夏白術(shù)天麻湯；西藥組按0.498 mg/kg（相當(dāng)于60 kg成人日用量的6倍）予苯甲酸利扎曲普坦片；聯(lián)合用藥組予三蟲半夏白術(shù)天麻湯22.5 g/kg+苯甲酸利扎曲普坦片0.498 mg/kg。模型組予蒸餾水10 mL/kg。

1.6 標(biāo)本采集與檢測 末次給藥結(jié)束后，用1.5%戊巴比妥鈉溶液（45 mg/kg）將存活大鼠采用腹腔注射法麻醉，斷頭處死，迅速取出腦組織，用濾紙吸盡腦組織表面的血液，在冰盤上快速去除腦膜和血管，在解剖顯微鏡下迅速分離包含有基底節(jié)區(qū)、紋狀體及三叉神經(jīng)尾核相應(yīng)的低位腦干區(qū)域的腦組織，用0.9%氯化鈉注射液沖洗血跡，稱質(zhì)量，置液氮速凍后-80℃凍存，送生工生物有限責(zé)任公司（上海）運(yùn)用RT-PCR檢測5-HT1B受體、5-HT1D受體基因含量。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件處理。計量資料以（±s）表示。各組間進(jìn)行單因素方差分析下的多重比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠腦組織5-HT1B受體表達(dá)比較 見表1。大鼠經(jīng)腹腔注射硝酸甘油致偏頭痛模型后，模型組5-HT1B受體表達(dá)顯著低于空白組（P＜0.01）。造模并干預(yù)后，給藥各組5-HT1B受體表達(dá)水平仍低于空白組，其中中藥低劑量組與空白組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），中藥中劑量組、中藥高劑量組、西藥組及聯(lián)合用藥組5-HT1B受體表達(dá)顯著低于空白組（P＜0.01）。造模并給藥后，中藥低、中、高劑量組、西藥組及聯(lián)合用藥組5-HT1B受體表達(dá)較模型組升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 各組大鼠腦組織5-HT1B、5-HT1D受體平均拷貝數(shù)（±s）

表1 各組大鼠腦組織5-HT1B、5-HT1D受體平均拷貝數(shù)（±s）

與中藥中劑量組比較，*P＜0.05；與空白組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

組別 n β-actin空白組 10 2780260±298895.22中藥低劑量組 20 2758834±294363.52中藥中劑量組 20 2600477±256208.42中藥高劑量組 20 2776595±165308.14西藥組 20 2582900±307774.15聯(lián)合用藥組 20 2674082±250260.05模型組 20 2769097±244673.62 5-HT1B受體拷貝數(shù) 5-HT1B受體拷貝數(shù)6121.99±1061.57 2100.06±350.35*5458.47±1225.55 2244.02±766.87*4707.14±675.55△△1316.50±195.29△4746.46±785.82△△1787.67±559.70 4980.25±910.72△△2049.12±376.43*4841.22±978.94△△2047.90±737.88*4664.85±897.62△△1824.98±1060.88

2.2 對偏頭痛大鼠腦組織5-HT1D受體表達(dá)的影響見表1。大鼠經(jīng)腹腔注射硝酸甘油致偏頭痛模型后，干預(yù)各組5-HT1D受體表達(dá)部分升高，部分降低。其中，與空白組相比，中藥中劑量組5-HT1D受體表達(dá)顯著降低（P＜0.05），其余各組與空白組相比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與模型組相比，各組差異差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與中藥中劑量組相比，空白組、中藥低劑量組、西藥組、聯(lián)合用藥組較中藥中劑量組5-HT1D受體基因表達(dá)顯著升高（P＜0.05），中藥高劑量組與中藥中劑量組相比差異差異無統(tǒng)計學(xué)意義 （P＞0.05）。

3 討 論

偏頭痛屬于嚴(yán)重危害人類健康的重大疾病，發(fā)病率及患病率較高。發(fā)病機(jī)制主要有血管源學(xué)說［8］、皮層擴(kuò)散性抑制、三叉神經(jīng)血管學(xué)說。其中，三叉神經(jīng)血管學(xué)說將神經(jīng)、血管、神經(jīng)遞質(zhì)三者相結(jié)合，統(tǒng)一于三叉神經(jīng)血管系統(tǒng)（受5-HT1B/1D受體調(diào)節(jié)），較好地解釋了偏頭痛的一些臨床表現(xiàn)及動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果［9］，也為偏頭痛藥物的作用機(jī)制提供了合理的解釋，成為目前的主流學(xué)說［10］。該學(xué)說認(rèn)為偏頭痛是由于三叉神經(jīng)血管系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)源性痛覺調(diào)節(jié)系統(tǒng)功能缺陷（與遺傳有關(guān)）加之過多的內(nèi)外刺激引起。

5-HT是偏頭痛發(fā)作中重要的神經(jīng)遞質(zhì)［11］，是中樞內(nèi)源性鎮(zhèn)痛系統(tǒng)中重要神經(jīng)活性物質(zhì)之一。近年來，將5-HT1B/1D受體激動劑開發(fā)為治療偏頭痛的新藥［12］，其代表藥物為利扎曲普坦［13］、夫羅曲坦、舒馬曲坦等?，F(xiàn)有研究者證實(shí)5-HT1B/1D受體激動劑不僅能夠影響外周5-HT系統(tǒng)的代謝狀態(tài)，提高偏頭痛大鼠頭痛發(fā)作期外周血中5-HT含量，而且還能抑制偏頭痛發(fā)作時三叉神經(jīng)節(jié)降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）的表達(dá)［14］，從而減輕CGRP引發(fā)的神經(jīng)源性炎癥［15-16］。

三蟲半夏白術(shù)天麻湯治療偏頭痛的療效已在前期臨床工作及研究中證實(shí)。本實(shí)驗(yàn)采用硝酸甘油制造偏頭痛大鼠模型，研究發(fā)現(xiàn)造模成功后偏頭痛大鼠腦組織內(nèi)5-HT1B/1D受體表達(dá)下降，這是造模成功的重要標(biāo)志。經(jīng)三蟲半夏白術(shù)天麻湯干預(yù)后，各組5-HT1B受體表達(dá)都有一定程度升高，以中藥低劑量組升高幅度最大，但不具有顯著差異，表明三蟲半夏白術(shù)天麻湯具有類似5-HT1B受體激動劑的作用，且效果與劑量相關(guān)。

大鼠經(jīng)腹腔注射硝酸甘油致偏頭痛模型后，中藥低劑量組5-HT1D受體表達(dá)升高，其余各組表達(dá)降低，其中以中藥中劑量組5-HT1D受體表達(dá)降低幅度最明顯。結(jié)果表明本方對5-HT1D受體的表達(dá)具有雙向調(diào)節(jié)的作用，臨床用于治療偏頭痛，劑量不宜偏大。

通過本實(shí)驗(yàn)研究，證實(shí)了5-HT1B/1D受體調(diào)節(jié)異常為偏頭痛的發(fā)病環(huán)節(jié)之一。三蟲半夏白術(shù)天麻湯可以提高偏頭痛大鼠腦組織5-HT1B受體的基因表達(dá)，對5-HT1D受體的基因表達(dá)具有雙向調(diào)節(jié)作用。臨床運(yùn)用，本方劑量不宜過大。研究為本方的臨床運(yùn)用提供了確切的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Experimental Study on the Effect of Sanchong Banxia Baizhu Tianma Decoction on the Expression of 5-HT1B/1D Receptor in the Brain of Rats with Migraine

CHEN Shaomei，WEI Qizhi，XI Shengyan，et al. Xiamen Hospital Affiliated to Fujian University of TCM，F(xiàn)ujian，Xiamen 361009，China.

Objective:To explore the mechanism of Sanchong Banxia Baizhu Tianma Decoction in the treatment of migraine.Methods:Migraine model of SD rats were set up with nitroglycerin，given Banxiabaizhutianma decoction of high，medium and low-dose intervention respectively for 7 days，taking Rizatriptan Monobenzoate as a positive control drug medicine，compared with the blank control group and the model group.RT-PCR was used to test the genetic expression of the 5-HT1B receptor and the 5-HT1D receptor.Results:The influence on the expression of the 5-HT1B receptor:compared with the blank control group，the model group was significantly lower than the control group（P＜0.01）；there was no significant difference between traditional Chinese medicine lowdose group and the blank group（P＞0.05）；traditional Chinese medicine medium dose group，high dose group，western medicine group and the combination group were significantly lower than the blank control group（P＜0.01）；after creating the model and finishing the administration，the expression rose high in low，medium and high dose groups of traditional Chinese medicine，western medicine group and the combination group，compared with the model group，without significant difference（P＞0.05）.The influence on the expression of 5-HT1D receptor: compared with the blank control group，traditional Chinese medicine medium dose group decreased significantly（P＜0.05）；other groups had no significant differences，compared with the control blank group（P＞0.05）；compared with the model group，there was no significant difference among them （P＞0.05）；compared with the traditional Chinese medicine medium dose group，the blank control group，traditional Chinese medicine low dose group，western medicine group and combination group were significantly higher（P＜0.05）；there was no difference between traditional Chinese medicine high-dose group and the traditional Chinese medium-dose group（P＞0.05）.Conclusion:5-HT1B/1D receptor dysregulation is one cause of the pathogenesis of migraine.Sanchong banxia baizhutianma decoction can improve the genetic expression of 5-HT1B receptors in migraine rats′brains，and has a dual-direction regulation on genetic expression of the 5-HT1D receptors.In the field of clinical application，the dose should not be too large.

5-HT1B/1D receptor agonist；Rizatriptan Monobenzoate；Migraine；Traditional Chinese medicine；Sanchong Banxia Baizhu Tianma Decoction

·研究報告·

R285.5

A

1004-745X（2016）10-1874-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.10.012

2012福建省中醫(yī)藥科研課題（wst201211）

△（電子郵箱：csmxm79@126.com）

（2016-05-06）