鄭良樸，曹治云，陳旭征，林薇

（1.福建省中西醫(yī)結(jié)合老年性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建福州350122；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建福州350122）

片仔癀對(duì)小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞增殖及肝轉(zhuǎn)移的抑制作用

鄭良樸1，2，曹治云2，陳旭征2，林薇1，2

（1.福建省中西醫(yī)結(jié)合老年性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建福州350122；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建福州350122）

目的觀察片仔癀對(duì)小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞（CT26）增殖及肝轉(zhuǎn)移的抑制作用。方法用MTT法觀察片仔癀對(duì)CT26的增殖抑制作用，以BALB／c小鼠為研究對(duì)象，用脾臟注射法建立結(jié)腸癌CT26小鼠肝臟轉(zhuǎn)移瘤模型，隨機(jī)分為對(duì)照組、片仔癀組，觀察各組小鼠的生存狀態(tài)等一般情況，分析脾臟、肝臟成瘤情況，計(jì)算成瘤率。結(jié)果片仔癀對(duì)CT26增殖有明顯的抑制作用，并呈劑量依賴關(guān)系；脾臟注射法成功建立CT26肝轉(zhuǎn)移的動(dòng)物模型，成瘤率100%，1周內(nèi)對(duì)小鼠一般情況沒有明顯影響；片仔癀能抑制CT 26肝轉(zhuǎn)移作用。結(jié)論脾臟注射法建立的CT26肝轉(zhuǎn)移小鼠模型可用于結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移的研究，片仔癀對(duì)CT26增殖及肝轉(zhuǎn)移有明顯的抑制作用。

結(jié)腸癌；肝轉(zhuǎn)移；片仔癀；細(xì)胞增殖；小鼠模型

為觀察片仔癀對(duì)小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞增殖及肝轉(zhuǎn)移的抑制作用，我們做體外實(shí)驗(yàn)觀察片仔癀對(duì)小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞增殖抑制作用。用脾臟注射法制作結(jié)腸癌細(xì)胞肝轉(zhuǎn)移的小鼠模型，觀察片仔癀對(duì)小鼠結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移的抑制作用。片仔癀是有著400多年歷史的中成藥，由三七、麝香、牛黃、蛇膽等組成，具有清熱解毒、散瘀止血、消腫定痛的功效，現(xiàn)已在消化道腫瘤等方面應(yīng)用，有較好的療效［1］，希望通過本實(shí)驗(yàn)為其臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　實(shí)驗(yàn)材料

1.1實(shí)驗(yàn)儀器超凈工作臺(tái)（江蘇省蘇州凈化設(shè)備公司）；CO2培養(yǎng)箱（德國Heraeus公司）；IX70倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司）；SXP-1C手術(shù)顯微鏡（上海醫(yī)光儀器有限公司）；Elx808酶聯(lián)免疫分析儀（美國Bio-Tek公司）；ME204E電子天平（瑞士梅特勒-托利多儀器公司）。

1.2藥品與試劑片仔癀片劑（漳州片仔癀藥業(yè)股份有限公司，規(guī)格：3 g／粒，批號(hào)：1203005）；5／0手術(shù)縫線（上海浦東金環(huán)醫(yī)療用品有限公司）；培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板（美國Coming公司）；0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液、DMEM高糖培養(yǎng)液、胎牛血清（FBS）、磷酸鹽緩沖液（PBS）（美國Hyclone公司）；四甲基偶氮唑藍(lán)（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）干粉、二甲基亞砜（DMSO）（美國Sigma公司）。

1.3細(xì)胞株與動(dòng)物小鼠結(jié)腸腺癌（CT26）細(xì)胞（中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫）。SPF級(jí)BALB／c雄性小鼠14只，體質(zhì)量20～22 g，上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供，合格證號(hào)：SCXK（滬）2012-0002。

2　實(shí)驗(yàn)方法

2.1藥物制備片仔癀片劑用研缽研成細(xì)粉，稱取1 000 mg片仔癀粉末，用50%DMSO配制成濃度為50 mg／mL的20 mL，高壓滅菌，4℃保存，待用于體外實(shí)驗(yàn)；稱取3 000 mg片仔癀粉末，用雙蒸水配制成濃度為30 mg／mL的100 mL，高壓滅菌，4℃保存，待用于小鼠灌胃給藥。

2.2細(xì)胞培養(yǎng)CT26用含1O%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在倒置相差顯微鏡下對(duì)細(xì)胞形態(tài)變化進(jìn)行觀察。

2.3CT26增殖抑制實(shí)驗(yàn)取處于對(duì)數(shù)生長期的CT26細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度接種于96孔培養(yǎng)板，每孔加入100 μL細(xì)胞懸液，細(xì)胞密度為5 000／孔。孵育16 h后，使細(xì)胞同步化，加入不同濃度的50%DMSO溶解片仔癀，4組給藥濃度為0、0.25、0.5、1 mg／mL，每組設(shè)8個(gè)復(fù)孔，以確保在培養(yǎng)體系中DMSO終濃度小于0.5%。繼續(xù)孵育24 h，倒置顯微鏡下觀察。小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入100μLMTT溶液，MTT溶液濃度為0.5 mg／mL，繼續(xù)培養(yǎng)2 h。棄去MTT溶液，小心用PBS沖洗2遍后，每孔加入100μL DMSO，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。用酶聯(lián)免疫分析儀在570 nm處測(cè)量各孔的吸光度值（OD），計(jì)算抑制率。

2.4制作結(jié)腸癌細(xì)胞肝轉(zhuǎn)移的動(dòng)物模型BALB／c雄性小鼠稱重，50 mg／kg體質(zhì)量用1%的戊巴比妥鈉進(jìn)行腹腔內(nèi)注射麻醉。麻醉成功后，用膠布固定小鼠于手術(shù)臺(tái)上，安爾碘皮膚消毒，左側(cè)腋后線肋緣下縱行切口，切口長1 cm，進(jìn)腹后于腹外側(cè)找到柳葉狀脾臟，用無齒鑷牽出腹腔外，用1 mL注射器從脾下極進(jìn)針，注入指數(shù)生長期的CT26細(xì)胞液0.2 mL（約200 000個(gè)細(xì)胞），隨后拔出針，用酒精棉球按壓針眼，輕輕按揉脾臟5 min，使瘤細(xì)胞經(jīng)脾靜脈進(jìn)入肝臟。注射區(qū)蒼白隆起消失后，依次連續(xù)縫合肌肉、皮膚，關(guān)腹。術(shù)后在2級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)、觀察。

2.5肝轉(zhuǎn)移的抑制實(shí)驗(yàn)14只小鼠術(shù)后隨機(jī)分為對(duì)照組和片仔癀組，每組7只。術(shù)后第2天，用灌胃方式給藥，片仔癀組每只小鼠給片仔癀溶液每日1次，每次0.25 mL；空白組灌胃給等體積的飲用水。每日對(duì)小鼠毛發(fā)、大小便、活動(dòng)等一般情況進(jìn)行觀察，連續(xù)給藥7 d后，脫頸椎處死小鼠，剖腹觀察腫瘤生長以及肝轉(zhuǎn)移情況。

2.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理計(jì)量數(shù)據(jù)用x±s表示，用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，采用單因素方差分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3　實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1、表2。

表1　片仔癀對(duì)CT26增殖抑制作用（x±s）

表2　片仔癀對(duì)脾臟注射CT26肝轉(zhuǎn)移的作用

片仔癀對(duì)小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞CT26有明顯抑制作用，抑制率隨著藥物濃度增大而增大，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2組小鼠的脾臟均有腫瘤形成，但腹腔未見腫大淋巴結(jié)。對(duì)照組6只小鼠肝臟中發(fā)現(xiàn)腫瘤結(jié)節(jié)，轉(zhuǎn)移率為100%。片仔癀組中有2只小鼠肝臟中發(fā)現(xiàn)腫瘤結(jié)節(jié)，轉(zhuǎn)移率為28.6%。

3.2一般觀察動(dòng)物造模后，隨機(jī)分為對(duì)照組和片仔癀組，手術(shù)當(dāng)日對(duì)照組小鼠死亡1只，解剖小鼠，分析死亡原因，屬麻醉異常致小鼠死亡。后7天實(shí)驗(yàn)中，2組大鼠未見明顯異常，飲食、活動(dòng)等狀況良好。

4　討論

4.1結(jié)直腸癌是最常見的惡性腫瘤之一，全世界每年超過100萬人診斷為結(jié)直腸癌，我國的結(jié)直腸癌發(fā)病率也呈逐年上升趨勢(shì)［2-3］。結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移途徑主要有血行轉(zhuǎn)移、腹膜轉(zhuǎn)移和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等，最常轉(zhuǎn)移的器官是肝臟，而結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者預(yù)后極差。因此，建立轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌動(dòng)物模型是研究結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移機(jī)制及抗腫瘤藥物篩選的重要工具［4］。在結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型的研究中，由于人癌細(xì)胞難以在普通小鼠中生長，對(duì)模型動(dòng)物及瘤源選擇是作為重要因素進(jìn)行選擇。癌細(xì)胞脾臟內(nèi)種植是目前研究腫瘤肝臟轉(zhuǎn)移的最佳模式之一，CT26細(xì)胞具有較強(qiáng)侵襲能力，BALB／c小鼠常作為研究腫瘤肝臟轉(zhuǎn)移的模型動(dòng)物。本實(shí)驗(yàn)選用BALB／c小鼠作為模型動(dòng)物，用具有轉(zhuǎn)移高潛力CT26細(xì)胞作為瘤源細(xì)胞株進(jìn)行脾臟注射方式造模，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，脾臟注射法建立CT26肝轉(zhuǎn)移的動(dòng)物模型成瘤率達(dá)100%，可作為轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌的理想動(dòng)物模型。

4.2中草藥具有明顯的腫瘤抑制作用［5－7］。本實(shí)驗(yàn)用MTT法觀察片仔癀對(duì)CT26增殖抑制作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，片仔癀對(duì)CT26有明顯抑制作用，抑制率隨著藥物濃度增大而增大，呈劑量依賴關(guān)系；同時(shí)在片仔癀抑制CT26肝轉(zhuǎn)移的實(shí)驗(yàn)中，片仔癀組明顯低于對(duì)照組，轉(zhuǎn)移率僅為28.6%。相關(guān)研究也表明，片仔癀對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞生長和增殖有明顯抑制作用。抑制腫瘤細(xì)胞生長和增殖是抑制腫瘤轉(zhuǎn)移作用機(jī)制之一，片仔癀如何通過抑制腫瘤細(xì)胞生長和增殖達(dá)到抑制CT26肝轉(zhuǎn)移，還有待進(jìn)一步研究。

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R285.5

B

1000-338X（2016）05-0016-02

2016-06-28

福建省自然科學(xué)基金資助課題（2014J013959、2015J01336）

鄭良樸（1974—），男，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，主要從事中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)研究。

林薇（1974—），女，副研究員。E-mail：linwei3116@126.com