許力偉，應(yīng)雄，李茗菊，賴文芳，洪桂祝，張小琴

（福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建福州350122）

紅景天苷對局灶性腦缺血／再灌注大鼠腦組織Ephb3、Ephb6 mRNA表達的影響

許力偉，應(yīng)雄，李茗菊，賴文芳，洪桂祝，張小琴

（福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建福州350122）

目的研究紅景天苷對局灶性腦缺血／再灌注大鼠的保護作用及對Ephb3、Ephb6mRNA的影響。方法SD大鼠36只，隨機分為假手術(shù)組、模型對照組、紅景天苷給藥組，用線栓法建立大鼠大腦中動脈閉塞模型（MCAO），用Zea-Longa標(biāo)準(zhǔn)評分法評價大鼠神經(jīng)功能損傷，TTC染色檢測大鼠腦梗塞體積，RT-PCR法檢測紅景天苷對大鼠缺血側(cè)腦組織的Ephb3、Ephb6 mRNA表達。結(jié)果與MCAO組比較，紅景天苷能明顯改善大鼠的神經(jīng)功能損傷，降低腦梗塞體積，促進Ephb3、Ephb6m RNA的表達。結(jié)論紅景天苷能降低MCAO模型大鼠的神經(jīng)功能評分，減少腦梗塞體積，通過調(diào)節(jié)Eph受體介導(dǎo)神經(jīng)元突觸活動，對MCAO模型大鼠起神經(jīng)保護作用。

紅景天苷；腦缺血；再灌注；Ephb3；Ephb6；m RNA；神經(jīng)保護

紅景天苷是景天科植物紅景天的主要有效成分，具有增強免疫、抗疲勞、耐缺氧、抗輻射、抗自由基損傷等多種藥理作用［1］。我們課題組前期研究［2-5］發(fā)現(xiàn)紅景天苷能降低缺血再灌注損傷大鼠的腦梗死體積和神經(jīng)功能損傷，本研究旨在觀察紅景天苷對MCAO模型大鼠腦組織內(nèi)促紅細(xì)胞生成素產(chǎn)生肝細(xì)胞受體（erythropoie-tin-producing hepatocyte receptor，Eph）中Ephb3、Ephb6基因水平的影響，探討紅景天苷對MCAO模型大鼠的神經(jīng)保護作用機制。

1　材料

1.1藥品與試劑紅景天苷（福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院生物醫(yī)藥研發(fā)中心，純度＞98%）；2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）（美國Sigma公司）；SYBR Select Master Mix（美國Applied Biosystems公司）；RNeasy? Mini Kit（德國Qiagen公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Thermo公司）。

1.2PCR引物PCR引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，參照Gen Bank中大鼠Ephb3、Ephb6、GAPDH的引物序列：

Ephb3引物上游序列5'-TCTCCCAAATCGTCAACACGC-3'；下游序列5'-CCACCGTCGTGAAGGTCGTAT-3'，PCR擴增片段長度為138 bp。

Ephb6引物上游序列5'-CGCCTTTGCCTCTTTTCCTG-3'；下游序列5'-TACGCCATCCTCCTCGGGTT-3'，PCR擴增片段長度為109 bp。

GAPDH引物上游序列5'-CAACGGGAAACCCATCACCA-3'；下游序列5'-ACGCCAGTAGACTCCACGACAT-3'，PCR擴增片段長度為96 bp。

1.3實驗動物SD大鼠36只，雄性，SPF級，體質(zhì)量（260±20）g，購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司［實驗動物合格證號：SCXK（滬）2012-0002］，由福建中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心飼養(yǎng)［許可證號：SYXK（閩）2009-0001］，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后用于實驗。

1.4儀器7900HT熒光定量PCR儀（美國Applied Biosystems公司）；DHP-9052電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；SK-1快速混勻器（常州國華電器有限公司）；PrimoR高速臺式冷凍離心機（美國Thermo Fisher公司）；C1000 PCR儀（美國Bio-rad公司）。

2　方法

2.1分組及給藥方法實驗大鼠隨機分成3組：假手術(shù)組、模型對照組（MCAO組）、紅景天苷給藥組（MCAO+Sal組），每組12只。同時，在缺血后分別腹腔注射生理鹽水和紅景天苷（100 mg／kg），連續(xù)給藥6 d，末次給藥2 h后，取腦，用于實驗。

2.2造模大鼠腹腔注射10%水合氯醛（3.5 mL／kg體質(zhì)量），沿頸部正中切開皮膚，暴露右頸總動脈、頸外動脈和頸內(nèi)動脈，結(jié)扎頸總動脈、頸外動脈。利用動脈夾夾閉頸內(nèi)動脈，利用眼科剪將頸總動脈剪個小口，插入線栓，插入深度距動脈分叉2 mm，結(jié)扎頸內(nèi)動脈。栓塞1.5 h后，將線栓絲拔出。假手術(shù)動物進行相同的操作，除了不栓塞中腦動脈。

2.3大鼠神經(jīng)功能評分按照Zea-Longa神經(jīng)行為缺損評分標(biāo)準(zhǔn)對大鼠進行評價。0分：無神經(jīng)功能缺損；1分：提尾時右前肢內(nèi)收，不能完全伸展；2分：自發(fā)行走時向右側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分：行走時身體向右側(cè)傾倒；4分：不能自發(fā)行走，意識喪失。神經(jīng)功能缺損評分在1～3分為模型成功，評分至少由2人參與完成。

2.4腦梗塞體積檢測采用2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染色法，取大鼠腦組織，用大鼠腦模具在大鼠腦組織視交叉處做冠狀切片，厚度為2 mm，置于2%TTC的磷酸鹽緩沖液中，避光37℃孵育30min。正常組織染成玫瑰紅色，梗死體積則呈蒼白色。染色后對組織進行拍照，利用Image-pro plus 6.0分析軟件計算梗死體積。

2.5大鼠腦組織Ephb3、Ephb6基因檢測根據(jù)trizol法提取大腦組織總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板，通過熒光定量PCR檢測各基因的表達。PCR擴增反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性10 min，95℃變性15 s，退火60℃15 s，40個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，計算2-ΔΔCt值。

2.6統(tǒng)計學(xué)處理數(shù)據(jù)用x±s表示，用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行分析，神經(jīng)損傷評分分析用非參數(shù)檢驗，其余各組間數(shù)據(jù)比較用單因素方差分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3　結(jié)果

實驗結(jié)果，見表1～表3。

表1　紅景天苷對MCAO模型大鼠神經(jīng)功能缺損評分的影響（x±s）

表2　紅景天苷對MCAO模型大鼠腦梗死體積的影響（x±s）

4　討論

4.1缺血性腦卒中是由于血栓或栓塞導(dǎo)致供血區(qū)域腦組織壞死，造成一系列神經(jīng)功能缺損的疾病。突觸是神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)進行信息傳遞的關(guān)鍵部位，其可塑性在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育、成熟及學(xué)習(xí)記憶等生理功能中扮演著重要角色。Eph是受體酪氨酸激酶中最大的家族，主要分布在興奮性突觸。通過改變Eph／ephrin可以調(diào)節(jié)損傷后的突觸功能，可以達到修復(fù)梗死灶、改善神經(jīng)缺失功能。Ephb是Eph受體的亞類之一，其亞族包含Ephb1-6，能夠與其配體Ephrin結(jié)合，調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育，可直接參與細(xì)胞與細(xì)胞間的聯(lián)系，介導(dǎo)軸突路徑的引導(dǎo)、神經(jīng)突觸功能和可塑性的調(diào)節(jié)［6-7］。電針對腦缺血再灌注的神經(jīng)損傷具有明顯的改善作用［8－9］。

4.2紅景天苷能夠改善神經(jīng)行為損傷，減少腦梗死體積，促進Ephb3、Ephb6基因的表達，提示紅景天苷對缺血性腦損傷大鼠具有一定的神經(jīng)保護作用，其保護作用與調(diào)節(jié)神經(jīng)元突觸活動有關(guān)。

表3　紅景天苷對MCAO模型大鼠Ephb3、Ephb6m RNA的影響（x±s）

［1］賀景宏，任秀紅.補腎益氣活血化瘀法治療缺血性腦卒中60例療效觀察［J］.中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2003，1（2）：121-122.

［2］FAN X，QIU J，YU Z，et al.A ratmodel of studying tissue-type plasminogen activator thrombolysis in ischemic stroke with diabetes［J］.Stroke，2011，43（2）：567-70.

［3］LO E H，DALKARA T，MOSKOWITZ M A.Mechanisms，challenges and opportunities in stroke［J］.Nature Reviews Neuroscience，2003，4（5）：399-415.

［4］鄭鈞豐，陳潔，顧艷艷，等.紅景天苷的研究進展［J］.西南國防醫(yī)藥，2013，23（12）：1386-1388.

［5］張小琴，賴文芳，褚克丹，等.紅景天苷對局灶性腦缺血大鼠腦組織MAPK信號通路的影響［J］.福建中醫(yī)藥，2015，46（3）：42-44.

［6］賴文芳，張小琴，洪海棉，等.紅景天苷對大鼠局灶性腦缺血／再灌注損傷的神經(jīng)保護作用［J］.中國藥理學(xué)通報，2015，31（6）：775-780.

［7］謝秀利，洪海棉，賴文芳，等.紅景天苷對大腦中動脈閉塞模型大鼠的神經(jīng)保護作用［J］.中國藥理學(xué)通報，2015，31（10）：1452-1457.

［8］陶靜，柳維林，黃佳，等.基于Notch1信號通路觀察電針對腦缺血再灌注損傷大鼠缺血周邊皮質(zhì)與SVZ區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞增殖的影響［J］.康復(fù)學(xué)報，2015，25（3）：23-34.

［9］趙從快，柳維林，林如輝，等.電針百會、神庭穴對腦缺血再灌注大鼠學(xué)習(xí)記憶影響的小動物磁共振波譜研究［J］.康復(fù)學(xué)報，2016，26（2）：21-27.

R285.5

B

1000-338X（2016）05-0009-02

2015-07-07

國家自然科學(xué)基金資助課題（81473382），福建省科技廳重點項目資助課題（2014Y4004），福建省自然科學(xué)基金資助課題（2015J01685），福建中醫(yī)藥大學(xué)校管-科研創(chuàng)新平臺專項資助課題（X2015009-平臺）。

許力偉（1991—），男，2014級藥理學(xué)專業(yè)碩士研究生，主要從事藥理學(xué)研究。

張小琴（1986—），女，助理研究員。E-mail：582990886@qq. com