從春生，李永祥，李春輝，石云素，宋燕春，張登峰，黎 裕，王天宇

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，北京 100081）

分子標(biāo)記輔助選擇玉米雜種后代創(chuàng)新種質(zhì)方法研究

從春生，李永祥，李春輝，石云素，宋燕春，張登峰，黎 裕，王天宇

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，北京 100081）

【目的】目前，玉米生產(chǎn)上利用的雜交種95%以上是單交種。利用分子標(biāo)記輔助選擇手段探索從雜交種后代中高效發(fā)掘分別適合作父本和母本材料的方法，對(duì)于提高雜交種類(lèi)資源的利用效率，推動(dòng)玉米育種發(fā)展進(jìn)程具有重要意義?！痉椒ā恳员延衩纂s交種JB1的F1代種子作為試驗(yàn)材料，首先利用玉米全基因組范圍內(nèi)SSR分子標(biāo)記，經(jīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增，非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）對(duì)雜交種種皮和胚進(jìn)行基因型檢測(cè)，篩選多態(tài)性SSR分子標(biāo)記，明確相應(yīng)父、母本的基因型。在此基礎(chǔ)上，選取10條染色體上均勻分布的多態(tài)性SSR分子標(biāo)記對(duì)F2及后續(xù)2個(gè)世代的分離群體進(jìn)行逐代分子標(biāo)記輔助選擇，獲得的后代材料可分為3組，即類(lèi)父本材料、類(lèi)母本材料和中間型材料。為了進(jìn)一步評(píng)估所選材料的雜種優(yōu)勢(shì)恢復(fù)程度及在育種工作中的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，在F4代對(duì)類(lèi)父本和類(lèi)母本兩組材料配制了組內(nèi)、組間雜交組合；同時(shí)，利用3個(gè)測(cè)驗(yàn)種與基于分子標(biāo)記選擇獲得的類(lèi)父本材料、類(lèi)母本材料以及在早代通過(guò)育種經(jīng)驗(yàn)選取的優(yōu)異材料進(jìn)行測(cè)交試驗(yàn)，對(duì)最終獲得的2 780個(gè)各種類(lèi)型組合在北京順義和河北蔚縣2個(gè)不同環(huán)境下進(jìn)行產(chǎn)量鑒定及綜合評(píng)價(jià)?！窘Y(jié)果】分子標(biāo)記輔助選擇顯著提高了分離后代中材料的選擇效率，F(xiàn)4代輔助選擇材料中，類(lèi)父本材料與父本的相似度最高可達(dá)79.5%，類(lèi)母本材料與母本的相似度最高可達(dá)73.7%，顯著高于隨機(jī)選擇條件下的親本相似度均值。不同類(lèi)型輔助選擇材料間保持了較大的遺傳距離，最大可達(dá)86%。F4代材料相互組配，不同親本類(lèi)型輔助選擇材料組配的雜交種小區(qū)產(chǎn)量顯著高于同類(lèi)型輔助選擇材料組配的雜交種。測(cè)驗(yàn)種組配的測(cè)交組合鑒定結(jié)果顯示，本研究中與類(lèi)父本材料組配的雜交種表現(xiàn)出較強(qiáng)的雜種優(yōu)勢(shì)，產(chǎn)量顯著高于與類(lèi)母本材料及早代通過(guò)育種經(jīng)驗(yàn)選取的優(yōu)異材料組配的測(cè)交組合，且存在產(chǎn)量超過(guò)原雜交種最大值的組合。【結(jié)論】利用分子標(biāo)記技術(shù)作為輔助選擇手段，從雜交種資源中發(fā)掘優(yōu)異育種材料、開(kāi)展種質(zhì)創(chuàng)新的方法，可有效提高雜交種資源的利用效率。

玉米；雜交種；種質(zhì)資源；分子標(biāo)記輔助選擇；種質(zhì)創(chuàng)新

0 引言

【研究意義】發(fā)掘優(yōu)異種質(zhì)資源、獲得突破性育種材料是選育優(yōu)良品種的基礎(chǔ)與前提。由于中國(guó)不是玉米的起源地和多樣性中心，不斷引進(jìn)國(guó)外自交系、群體及雜交種等并加以改良應(yīng)用十分重要［1］。其中，生產(chǎn)上大面積利用的不同類(lèi)型雜交種，多數(shù)是經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期自然選擇與人工選育不斷積累人類(lèi)所需特性的種質(zhì)結(jié)晶，以雜交種為基礎(chǔ)材料發(fā)掘種質(zhì)資源在以往的玉米育種實(shí)踐中發(fā)揮了重要的作用，特別是引進(jìn)的國(guó)外雜交種是中國(guó)玉米種質(zhì)資源擴(kuò)充的重要來(lái)源之一［2］。目前，世界上玉米生產(chǎn)95%以上利用的是單交種，而單交種是由兩個(gè)親本配制的雜交組合，具備強(qiáng)雜種優(yōu)勢(shì)對(duì)于提高產(chǎn)量至關(guān)重要，因而育種家對(duì)基礎(chǔ)材料所屬的雜種優(yōu)勢(shì)群十分重視。盡管不同的育種家將育種材料分成不同的優(yōu)勢(shì)群［3-6］，但是不變的總是一類(lèi)材料適合作母本，而另一類(lèi)材料相應(yīng)適合作父本。大量研究與實(shí)踐表明，分子標(biāo)記可以較真實(shí)地反映材料間遺傳關(guān)系，服務(wù)于劃分雜種優(yōu)勢(shì)類(lèi)群［7-9］。因此，利用分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)，依據(jù)雙親遺傳信息，研究基于雜交種資源建立高效實(shí)用的種質(zhì)資源創(chuàng)新方法體系，對(duì)于提高該類(lèi)資源的利用效率，推動(dòng)玉米育種發(fā)展進(jìn)程具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】生產(chǎn)上利用的雜交種是一類(lèi)重要的種質(zhì)資源。事實(shí)上，20世紀(jì)70年代末從美國(guó)、東歐引入中國(guó)的一批雜交種，不同程度地含有Reid種質(zhì)，株型緊湊，莖稈堅(jiān)韌，籽粒偏馬齒，以其作為基礎(chǔ)材料，育成了一批優(yōu)良自交系并逐步形成了中國(guó)的改良Reid類(lèi)群［10］，組配出的雜交種在中國(guó)玉米生產(chǎn)上發(fā)揮了巨大作用，如沈單7號(hào)、掖單12、鄭單958等［11-12］；20世紀(jì)80年代末，美國(guó)先鋒公司的78599等雜交種引入中國(guó)，由于遺傳基礎(chǔ)豐富，具有抗病、抗倒、保綠度好、活稈成熟等優(yōu)點(diǎn)，以其作為基礎(chǔ)材料，經(jīng)過(guò)多代自交和群體選擇，成功選育出了一批多抗性材料［13-14］，形成了中國(guó)另外一個(gè)重要優(yōu)勢(shì)群類(lèi)型——P群［15］，并育成了魯單50、農(nóng)大108等一批在生產(chǎn)上發(fā)揮了重要作用的優(yōu)良雜交種。這些基于雜交種選育出的自交系在中國(guó)玉米育種種質(zhì)基礎(chǔ)與骨干親本的形成上發(fā)揮了重要的作用［16］，同時(shí)這些工作也是成千上萬(wàn)玉米育種工作者成功的典范。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，借助分子標(biāo)記輔助選擇策略從一個(gè)親本信息未知的雜交種中快速選出相對(duì)適合作父本和母本的材料在理論上成為可能，由于玉米種皮組織與母本在遺傳信息上是一致的，胚具有雙親的遺傳信息［17］，通過(guò)玉米雜交種F1可成功推斷獲得相應(yīng)父母本基因型［18-19］。而育種實(shí)踐也同樣證明這是可行的，GUAN等［20］利用SNP標(biāo)記開(kāi)展了基于雜交種的反向分子育種研究，并取得了成功?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】利用雜交種這類(lèi)種質(zhì)資源有多種策略，其中，最普遍的是創(chuàng)制二環(huán)系。但應(yīng)用常規(guī)方法或加倍單倍體技術(shù)選育出的二環(huán)系往往利用方向欠明確，育成的自交系需要進(jìn)行大量的測(cè)配和田間鑒定判定所屬的雜種優(yōu)勢(shì)群，耗時(shí)費(fèi)力，選育效率較低，難以符合現(xiàn)代玉米育種的需求。利用分子標(biāo)記技術(shù)摸索高效發(fā)掘雜交種后代中分別適合作母本和父本材料的方法對(duì)有效利用雜交種資源、提高玉米育種效率是十分有必要的?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究以爆裂玉米雜交種JB1構(gòu)建的各世代群體為試驗(yàn)材料，通過(guò)經(jīng)濟(jì)適用、可靈活組合的全基因組SSR分子標(biāo)記進(jìn)行輔助選擇，篩選類(lèi)父、類(lèi)母本材料，進(jìn)一步摸索建立基于分子標(biāo)記輔助選擇和雜交種資源開(kāi)展種質(zhì)資源創(chuàng)新的實(shí)用方法，旨在通過(guò)SSR分子標(biāo)記輔助選擇的方法提高開(kāi)發(fā)利用雜交種類(lèi)資源創(chuàng)新種質(zhì)的效率，為快速發(fā)掘優(yōu)異種質(zhì)資源、推動(dòng)遺傳改良進(jìn)程提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以爆裂玉米雜交種JB1為試驗(yàn)材料，與其他普通玉米雜交種相比，爆裂玉米品種通常雙親植株性狀及籽粒性狀差異不大，僅從表型選擇雜交種后代優(yōu)良個(gè)體比較困難。2013年先后于北京順義和海南三亞試驗(yàn)基地種植雜種F1和F2分離群體。2014年夏于北京順義試驗(yàn)基地種植380個(gè)F2:3家系，進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇。2014年冬于海南三亞試驗(yàn)基地種植通過(guò)分子標(biāo)記輔助選擇獲得的類(lèi)父本、類(lèi)母本材料及通過(guò)育種經(jīng)驗(yàn)選取的優(yōu)異代表性材料，同時(shí)種植庫(kù)存資源爆裂玉米自交系5007、5027和5087，用于組配測(cè)交組合，為評(píng)估基于分子標(biāo)記輔助選擇創(chuàng)新種質(zhì)的配合力及育種應(yīng)用價(jià)值做準(zhǔn)備。

1.2 雙親指紋圖譜的構(gòu)建

取5粒JB1的F1代種子，利用堿泡法［21］分解種皮與胚乳間的外胚乳層，手工剝離獲得無(wú)胚乳污染的籽粒種皮，然后利用植物基因組DNA提取試劑盒PlantZol（北京全式金生物技術(shù)有限公司）提取種皮DNA樣品（玉米種皮實(shí)際是果皮和種皮的復(fù)合物，果皮和種皮分別由子房壁和胚珠的珠被發(fā)育而來(lái)，與母本具有相同的基因組組成）。同時(shí)，切取雜交種的胚組織，通過(guò)堿煮法［22］快速提取DNA樣品（由于胚由受精卵發(fā)育而來(lái)，因此具有雙親的遺傳信息）。利用玉米基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.maizegdb.org/data_ center/map）公布的標(biāo)記序列信息合成SSR引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增，8.0%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，0.1% AgNO3染色，甲醛和NaOH顯色，在全基因組范圍內(nèi)進(jìn)行多態(tài)性SSR分子標(biāo)記篩選。鑒于SSR分子標(biāo)記為共顯性標(biāo)記，親本一般出現(xiàn)一條擴(kuò)增帶，雜交種一般出現(xiàn)雙親互補(bǔ)型兩條擴(kuò)增帶［23］，通過(guò)比對(duì)可推測(cè)出另一親本擴(kuò)增帶型。本研究中根據(jù)種皮和胚的擴(kuò)增帶型差異，推測(cè)出父本擴(kuò)增帶型，建立雙親分子指紋圖譜。

1.3 分離后代基因型鑒定及材料選擇

當(dāng)玉米幼苗生長(zhǎng)至5片葉時(shí)，取幼嫩葉片，采用CTAB法［24］提取DNA并純化。根據(jù)構(gòu)建的指紋圖譜信息及IBM2 2008 Neighbors圖譜公布的標(biāo)記遺傳位置，從中選取均勻分布的多態(tài)性標(biāo)記對(duì)各世代群體進(jìn)行基因型鑒定。對(duì)于F2:3家系及F3單株，利用基于全基因組篩選獲得的多態(tài)性SSR分子標(biāo)記進(jìn)行基因型鑒定，對(duì)于F4單株，在排除純合位點(diǎn)的基礎(chǔ)上，對(duì)材料雜合位點(diǎn)進(jìn)行進(jìn)一步基因型鑒定。利用Microsoft Excel 2010對(duì)各世代基因型數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，分別計(jì)算所選材料與父本或母本的相似度和純合程度。計(jì)算公式如下：

其中，PS（%）為親本相似度，X為與父本或母本相同的基因型數(shù)，Hy為雜合基因型數(shù)，N為有效基因型數(shù)；Ho（%）為純合程度，M和F分別對(duì)應(yīng)父本類(lèi)型基因型數(shù)和母本類(lèi)型基因型數(shù)，N為有效基因型數(shù)。

以PS（%）作為分子標(biāo)記輔助選擇依據(jù)，選取類(lèi)父本、母本材料。同時(shí)，依據(jù)育種經(jīng)驗(yàn)，對(duì)相應(yīng)世代單株進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，從中篩選優(yōu)異材料，并同分子標(biāo)記輔助選擇獲得的類(lèi)父、母本材料一同種植，用于后續(xù)研究工作。

1.4 田間試驗(yàn)及產(chǎn)量測(cè)定

經(jīng)過(guò)分子標(biāo)記輔助選擇，2014年冬，將入選的F2:3家系相應(yīng)F3單株全部種植于海南三亞試驗(yàn)基地，在此期間，繼續(xù)對(duì)F3單株及進(jìn)一步入選F3單株相應(yīng)后代進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇。對(duì)基于F3單株基因型數(shù)據(jù)入選的F3:4家系，采用不完全雙列雜交方法，構(gòu)建雜交組合（類(lèi)母本×類(lèi)父本，類(lèi)父本×類(lèi)母本）。同時(shí)，將入選以外的家系與入選家系材料隨機(jī)組配（類(lèi)母本×類(lèi)父本，類(lèi)父本×類(lèi)母本，類(lèi)父本×類(lèi)父本，類(lèi)母本×類(lèi)母本），獲得不同遺傳距離組合，用于探討通過(guò)分子標(biāo)記輔助選擇獲得不同類(lèi)型材料在分離后代之間的雜種優(yōu)勢(shì)程度。此外，種植優(yōu)良測(cè)驗(yàn)種5007、5027和5087為父本，與所有材料構(gòu)建測(cè)交組合（類(lèi)父本×測(cè)驗(yàn)種，類(lèi)母本×測(cè)驗(yàn)種，育種經(jīng)驗(yàn)選取材料×測(cè)驗(yàn)種），以評(píng)估經(jīng)分子標(biāo)記輔助選擇創(chuàng)新種質(zhì)資源的育種應(yīng)用價(jià)值。2015年夏，于北京順義（40.2° N，116.6° E）及河北蔚縣（39.8° N，114.6° E）2個(gè)環(huán)境下種植雜交組合，田間試驗(yàn)采用間比法設(shè)計(jì)，2行小區(qū)，行長(zhǎng)3 m，行距0.6 m，株距0.3 m，每30小區(qū)種植對(duì)照品種JB1。全部田間試驗(yàn)中的施肥、灌溉、防蟲(chóng)和除草同當(dāng)?shù)卮筇锕芾硪恢?。成熟后，按組合收獲，果穗風(fēng)干至恒重，小區(qū)果穗混合脫粒，稱(chēng)量小區(qū)產(chǎn)量。

1.5 數(shù)據(jù)分析

利用GGT軟件［25］，采用Allele sharing/SM相似系數(shù)算法，依據(jù)輔助選擇材料基因型數(shù)據(jù)，計(jì)算兩兩間遺傳距離。在此基礎(chǔ)上，利用MEGA 6軟件［26］，采用UPGMA法（unweighted pair group method using arithmetic average）進(jìn)行聚類(lèi)分析。利用Microsoft Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，利用SAS 9.2軟件對(duì)不同類(lèi)型遺傳距離組合產(chǎn)量數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較分析。

2 結(jié)果

2.1 指紋圖譜構(gòu)建及輔助選擇標(biāo)記的確定

利用玉米全基因組范圍內(nèi)的1 515對(duì)SSR引物對(duì)試驗(yàn)材料種皮及胚的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增、電泳，篩選獲得167對(duì)擴(kuò)增清晰的多態(tài)性SSR分子標(biāo)記，用于推測(cè)雙親指紋圖譜（圖1）。最終，根據(jù)玉米基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.maizegdb.org/data_center/map）公布的遺傳位置，從中選取均勻分布于10條染色體的多態(tài)性標(biāo)記97對(duì)，用于各世代分離群體的分子標(biāo)記輔助選擇（圖2）。

圖1 基于第1染色體入選SSR分子標(biāo)記擴(kuò)增JB1種皮及胚圖譜Fig. 1 DNA footprints of JB1’s pericarp and embryo using SSR markers on Chromosome 1

2.2 分子標(biāo)記輔助選擇材料基因型變化情況

利用93對(duì)多態(tài)性引物對(duì)380個(gè)F2:3家系進(jìn)行基因型鑒定，從中篩選出了最具典型性的類(lèi)父、母本家系各10個(gè)。其中，篩選的類(lèi)父本家系中，父本相似度介于64.8%—68.8%，平均為66.5%，純合程度介于45.1%—63.0%，平均為54.7%；篩選的類(lèi)母本家系中，母本相似度介于58.2%—63.6%，平均為60.0%，純合程度介于43.5%—58.2%，平均為51.4%。利用97對(duì)（新增4對(duì)，分別為umc2363、umc1117、umc2041和umc1101）多態(tài)性引物對(duì)來(lái)源于上述20個(gè)家系的285個(gè)F3單株進(jìn)行基因型鑒定，篩選獲得了類(lèi)父、母本F3單株各12個(gè)。入選的類(lèi)父本F3單株中，父本相似度介于70.3%—79.6%，平均為73.3%，純合程度介于69.8%—87.1%，平均為79.0%；入選的類(lèi)母本F3單株中，母本相似度介于63.7%—70.2%，平均為66.9%，純合程度為73.7%—81.0%，平均為76.4%。在排除純合位點(diǎn)的基礎(chǔ)上，對(duì)不同類(lèi)群內(nèi)的總計(jì)384個(gè)F4單株的雜合位點(diǎn)進(jìn)行進(jìn)一步基因型鑒定，從中分別篩選出10個(gè)極端類(lèi)父本單株和10個(gè)極端類(lèi)母本單株。其類(lèi)父本F4單株與父本相似度介于78.4%—79.5%，平均為78.8%，純合程度介于87.2%—96.8%，平均為92.0%；類(lèi)母本F4單株與母本相似度介于71.6%— 73.7%，平均為72.7%，純合程度介于85.3%—95.8%，平均為88.9%（表1）。

圖2 用于各世代群體輔助選擇的多態(tài)性SSR分子標(biāo)記在10條染色體上的遺傳位置分布圖Fig. 2 Chromosomal distribution of the polymorphic SSR markers used in progeny selection

對(duì)各世代類(lèi)父、母本材料基因型數(shù)據(jù)匯總分析可以看出（表1，圖3），通過(guò)3次分子標(biāo)記輔助選擇，所選材料與親本相似度整體上不斷提高，但隨著世代的推進(jìn)，提高幅度逐漸減小。通過(guò)F2代挑選偏雙親基因型的材料，經(jīng)過(guò)進(jìn)一步的選擇，在F4世代，類(lèi)父本材料與父本的相似度最高可達(dá)79.5%，類(lèi)母本材料與母本的相似度最高可達(dá)73.7%。若對(duì)試驗(yàn)材料不加以分子標(biāo)記輔助選擇，各世代分離群體親本相似度均值應(yīng)圍繞50%上下波動(dòng)，純合程度從F2代至F4代分別應(yīng)為50%、75%和87.5%。通過(guò)分子標(biāo)記輔助選擇后，從F2代開(kāi)始親本相似度顯著高于50%，純合程度均高于其理論均值（圖4）。

圖3 各世代材料分子標(biāo)記輔助選擇進(jìn)度Fig. 3 Progess of marker-assisted selection of materials from F2to F4

2.3 遺傳距離及聚類(lèi)分析

對(duì)收獲的雜交種，根據(jù)雙親基因型數(shù)據(jù)進(jìn)行遺傳距離分析，統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，F(xiàn)4代類(lèi)父本材料與類(lèi)母本材料間平均遺傳距離為0.68，最大值為0.86。經(jīng)過(guò)3次輔助選擇，類(lèi)父、母本材料間保持了較大的遺傳距離。根據(jù)試驗(yàn)材料基因型數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類(lèi)分析（圖5），結(jié)果顯示，24個(gè)F3輔助選擇材料后代（384個(gè)F4單株）被劃分為兩大類(lèi)群，親緣關(guān)系較近材料均被劃為同一類(lèi)群。

2.4 產(chǎn)量數(shù)據(jù)分析

2.4.1 類(lèi)父、母本材料組間及組內(nèi)測(cè)交組合產(chǎn)量結(jié)果總體看來(lái)，在2個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)中，類(lèi)父、母本材料間組配組合（類(lèi)母本×類(lèi)父本或類(lèi)父本×類(lèi)母本）小區(qū)產(chǎn)量均高于同類(lèi)材料組配的組合（類(lèi)父本×類(lèi)父本，類(lèi)母本×類(lèi)母本）（α=0.05），但未發(fā)現(xiàn)高于原始雜交種最大值的組合（表2）。

圖4 通過(guò)輔助選擇獲得的不同類(lèi)型材料在各世代中親本相似度及純合度分析Fig. 4 Parental similarity and homozygosity of different groups of materials by assisted selection in F2and two subsequent generations

表2 不同地點(diǎn)的各類(lèi)型組合及對(duì)照的小區(qū)產(chǎn)量Table2 Plot yields of all hybrid combinations and the control at differernt locations

圖5 F3代輔助選擇材料后代的UPGMA聚類(lèi)分析Fig. 5 Cluster analysis of the progenies of selected plants in F3generation via UPGMA method

以雜交組合雙親間遺傳距離作為分類(lèi)依據(jù)，可將組配的雜交種劃分為三大類(lèi)，即遺傳距離＜60%，遺傳距離介于60%—70%，遺傳距離＞70%?？傮w而言，隨著遺傳距離的增加，相應(yīng)的小區(qū)產(chǎn)量呈現(xiàn)出增加趨勢(shì)，但增加幅度較緩，結(jié)果表明，通過(guò)分子標(biāo)記輔助選擇獲取的類(lèi)父、母本材料間可在一定程度上恢復(fù)原有雜種優(yōu)勢(shì)（圖6）。

2.4.2 測(cè)驗(yàn)種組配的組合產(chǎn)量結(jié)果及育種價(jià)值分析對(duì)2個(gè)環(huán)境下共同種植的測(cè)交組合產(chǎn)量數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析表明，分子標(biāo)記輔助選擇材料與3個(gè)測(cè)驗(yàn)種5007、527和5087測(cè)交表現(xiàn)出較高的一般配合力（表3），其平均產(chǎn)量明顯高于分子標(biāo)記輔助選擇獲得材料之間組配的組合。盡管與3個(gè)測(cè)驗(yàn)種組配組合的產(chǎn)量平均水平低于原始對(duì)照雜交種，但在北京順義和河北蔚縣2個(gè)環(huán)境均存在優(yōu)于對(duì)照的組合（表3）。此外，本研究中通過(guò)育種經(jīng)驗(yàn)選取的756個(gè)優(yōu)異材料與3個(gè)測(cè)驗(yàn)種測(cè)交獲得了1 344個(gè)組合，其一般配合力平均水平低于分子標(biāo)記輔助選擇獲得的材料（圖7）。

表3 2個(gè)環(huán)境下不同測(cè)驗(yàn)種組配測(cè)交組合及對(duì)照小區(qū)的產(chǎn)量Table3 Plot yields of the testcrosses by three testers and the control in two locations

圖6 不同遺傳距離親本配制的組合小區(qū)產(chǎn)量分析Fig. 6 Plots yield of combinations with parents which had different genetic distance

圖7 不同類(lèi)型輔助選擇材料與3種測(cè)驗(yàn)種組配的測(cè)交組合小區(qū)產(chǎn)量Fig. 7 Plot yield performance of testcrosses between the three groups of materials obtained by assisted selection and three testers

3 討論

3.1 利用分子標(biāo)記技術(shù)可以提高基于雜交種資源種質(zhì)創(chuàng)新的選育效率

目前，中國(guó)對(duì)雜交種類(lèi)資源的利用大部分采取常規(guī)的育種方法，直接進(jìn)行二環(huán)系選育或是通過(guò)與其他材料構(gòu)建三交后進(jìn)行自交系的選育。在進(jìn)行常規(guī)選系的過(guò)程中，育種家除了選擇具有優(yōu)良農(nóng)藝性狀、抗性好個(gè)體或群體的同時(shí)，還需要進(jìn)行大量的測(cè)交試驗(yàn)，以便選育特定雜種優(yōu)勢(shì)群內(nèi)的材料，尤其是對(duì)于一些遺傳信息未知的雜交種，不但耗時(shí)費(fèi)力，而且測(cè)配結(jié)果受到環(huán)境因素影響很不穩(wěn)定。而分子標(biāo)記可較好地反映材料間遺傳關(guān)系，以分子標(biāo)記輔助選擇手段進(jìn)行基于雜交種資源的種質(zhì)創(chuàng)新工作，以基因型作為重要的選擇標(biāo)準(zhǔn)，具有較強(qiáng)的預(yù)見(jiàn)性，受外界因素影響較小，并且輔助選擇后代表型加以基因型判斷容易進(jìn)行雜種優(yōu)勢(shì)類(lèi)群歸類(lèi)。GUAN等［20］利用SNP芯片開(kāi)展玉米反向育種，以覆蓋全基因組的192個(gè)SNP位點(diǎn)作為選擇依據(jù)，對(duì)雜交種后代進(jìn)行逐代輔助選擇，F(xiàn)4代當(dāng)選材料中，父本基因型最高可恢復(fù)76%，母本基因型最高可恢復(fù)73%，F(xiàn)4代自交兩代純合后，重新組配雜交種，表現(xiàn)出雜種優(yōu)勢(shì)。本研究中，利用97對(duì)廣泛分布的SSR分子標(biāo)記開(kāi)展雜交種類(lèi)資源種質(zhì)創(chuàng)新研究，F(xiàn)4代輔助選擇材料父本相似度最高可達(dá)79.5%，母本相似度最高可達(dá)73.7%，F(xiàn)4代相互組配，不同類(lèi)型輔助選擇材料組配的雜交種小區(qū)產(chǎn)量顯著高于同類(lèi)型輔助選擇材料組配的雜交種。雖然與GUAN等［20］研究所采用的分子標(biāo)記類(lèi)型不同，數(shù)量有異，但輔助選擇結(jié)果相似，通過(guò)分子標(biāo)記輔助選擇均大大提高了雜交種后代的選育效率。同時(shí)，由于SSR分子標(biāo)記應(yīng)用簡(jiǎn)單，不需要過(guò)多投入，可在實(shí)驗(yàn)室獨(dú)立完成，并且對(duì)于不同基礎(chǔ)材料可重復(fù)篩選利用，因此，節(jié)約了試驗(yàn)成本，并且提高了試驗(yàn)靈活性。如果在選擇過(guò)程中結(jié)合南繁或溫室加代，一年推進(jìn)3—4個(gè)世代，可大大縮短選育時(shí)間。

3.2 結(jié)合常規(guī)測(cè)交試驗(yàn)進(jìn)一步快速明確選擇材料的育種應(yīng)用價(jià)值

育種材料的配合力是玉米育種家選擇后代的重要指標(biāo)，也是育種材料應(yīng)用價(jià)值的體現(xiàn)［27］。在種質(zhì)創(chuàng)新與育種方面，科研人員一直在摸索不同的途徑實(shí)現(xiàn)創(chuàng)新工作效益的最大化，有人提出反向育種思路，比如通過(guò)轉(zhuǎn)基因沉默技術(shù)，干擾控制減數(shù)分裂重組過(guò)程中的部分基因，得到未發(fā)生過(guò)重組的純合單倍體植物，再通過(guò)多倍化技術(shù)形成雙單倍體（double haploid，DH）植株，進(jìn)而獲得原雜交組合［28-30］，目前該方法仍處于研究階段，還未應(yīng)用于實(shí)際育種當(dāng)中［31-32］。本研究有別于上述情況，通過(guò)連續(xù)地分子標(biāo)記輔助選擇，獲得與原雙親基因型相近的材料，并對(duì)分子標(biāo)記輔助選擇材料進(jìn)行遺傳關(guān)系及配合力分析，研究如何更快、更好地從雜交種類(lèi)基礎(chǔ)種質(zhì)資源中分離出分別適合作父本、作母本的優(yōu)良新材料，提高選擇與利用效率。為了驗(yàn)證選擇效果，本研究中選取了3個(gè)爆裂玉米自交系作為測(cè)驗(yàn)種進(jìn)行早代測(cè)配，評(píng)估輔助選擇材料的育種應(yīng)用價(jià)值。對(duì)這3個(gè)測(cè)驗(yàn)種分子檢測(cè)結(jié)果顯示，測(cè)驗(yàn)種5007與5027基因型相對(duì)接近母本，而測(cè)驗(yàn)種5087基因型與供試品種雙親比較均有較大差異。測(cè)交驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明，整體上通過(guò)分子標(biāo)記輔助選擇獲得的材料表現(xiàn)出較高的一般配合力，其中測(cè)驗(yàn)種5007與5027與類(lèi)父本材料之間測(cè)配組合的產(chǎn)量在北京順義和河北蔚縣2個(gè)環(huán)境條件下均較高；而測(cè)驗(yàn)種5087在2個(gè)環(huán)境條件下均出現(xiàn)較多的優(yōu)異組合。此外，對(duì)于本研究所獲得的優(yōu)異組合，正在進(jìn)行進(jìn)一步的培育，有望育成有實(shí)用價(jià)值的新品種。

3.3 分子標(biāo)記輔助選擇雜交種后代創(chuàng)新種質(zhì)資源的一些建議

利用分子標(biāo)記作為輔助選擇手段通過(guò)優(yōu)異雜交種后代發(fā)掘分別適合作父本和母本的種質(zhì)資源，在不久的將來(lái)很有可能對(duì)推動(dòng)中國(guó)玉米育種工作發(fā)揮越來(lái)越重要的作用。根據(jù)本試驗(yàn)的研究結(jié)果及試驗(yàn)過(guò)程中存在的問(wèn)題，提出的建議有：一是從經(jīng)濟(jì)與效率方面考慮，使用分子標(biāo)記數(shù)量不需過(guò)多，可選擇一些功能標(biāo)記作為輔助選擇依據(jù)。GUAN等［20］利用50K高密度芯片選取的192個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇與本研究中以均勻分布的97對(duì)SSR分子標(biāo)記進(jìn)行輔助選擇獲得了相近似的結(jié)果。當(dāng)然，在標(biāo)記的選擇過(guò)程中，選擇一些重要育種性狀相關(guān)標(biāo)記，對(duì)于發(fā)掘攜帶目標(biāo)性狀的種質(zhì)資源具有重要的意義；二是應(yīng)注意擴(kuò)大早代分離群體，提高早代輔助選擇材料基數(shù)。大群體有利于增加在早期挖掘偏向于母本或父本的極端材料的可能性，同時(shí)也有利于選出打破不利基因連鎖的個(gè)體，獲得更好的材料。隨著世代增加，變異趨于穩(wěn)定，可結(jié)合表型減少選擇材料所占比例；三是應(yīng)注意分子標(biāo)記輔助選擇與常規(guī)育種相結(jié)合，從親緣關(guān)系未知玉米雜交種后代中創(chuàng)新優(yōu)異種質(zhì)資源，要在早代對(duì)選擇材料進(jìn)行常規(guī)測(cè)交試驗(yàn)，建議在F4代或更早世代，有的放矢地與其他來(lái)源和方法獲得的創(chuàng)新種質(zhì)組配測(cè)交組合，盡早檢測(cè)輔助選擇材料配合力情況，可以極大地提高育種效率。同時(shí)需要指出的是，除了特殊的需要，開(kāi)展種質(zhì)資源創(chuàng)新不提倡對(duì)某一品種親本自交系進(jìn)行“還原”，而是獲得屬于母本或父本群的新型“二環(huán)系”或通過(guò)進(jìn)一步復(fù)交、綜合應(yīng)用不同手段獲得新型改良系。在選擇過(guò)程中，多種策略相結(jié)合，使得基于雜交種為基礎(chǔ)材料進(jìn)行種質(zhì)創(chuàng)新所獲得選系的配合力特性得以保持，提高種質(zhì)資源創(chuàng)新效果與利用效率。

4 結(jié)論

利用分子標(biāo)記輔助選擇策略，建立基于雜交種資源的玉米種質(zhì)創(chuàng)新方法，可提高雜交種后代選擇效率，并且所選材料可保持原有雜種優(yōu)勢(shì)屬性。利用不同來(lái)源的測(cè)驗(yàn)種進(jìn)行早代測(cè)交，可快速評(píng)估輔助選擇材料的育種應(yīng)用價(jià)值，提高基于雜交種資源創(chuàng)新種質(zhì)的效率。

致謝：李平教授在研究過(guò)程中給予的指導(dǎo)與幫助，王巖文、付發(fā)林、靳長(zhǎng)再等負(fù)責(zé)試驗(yàn)的同志，在材料種植、田間記載、收獲后考種給予的有力支持，在此表示感謝。

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（責(zé)任編輯 李莉）

Research on Methodology of Maize Germplasm Development with Source of Hybrids by Using Marker-Assisted Selection

CONG Chun-sheng， LI Yong-xiang， LI Chun-hui， SHI Yun-su， SONG Yan-chun， ZHANG Deng-feng，LI Yu， WANG Tian-yu
（Institute of Crop Sciences， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100081）

【Objective】 Research on marker-assisted methodology of developing germplasm suited as female and male parents was of practical importance in improving utilization efficiency of this source and promoting the development of maize breeding，since single-cross hybrids are over 95% in maize production.【Method】 A popcorn hybrid， "JB1"， was used as the initial entry in the present study to obtain polymorphic simple sequence repeat （SSR） markers and determine the parents’ genotype by performing polymerase chain reaction （PCR） amplification with genome-wide SSR markers and native polyacrylamide gel electrophoresis（PAGE）. Subsequently， marker-assisted selection was performed in progenies of F2and two later subsequent generations using the polymorphic markers distributed evenly on the ten chromosomes of maize. As a result， three groups of progenies were obtained， i.e. male parent-like， female parent-like and middle type. To evaluate the heterosis and the breeding value of these selected progenies，hybrid combinations were made in F4among the progenies from the male-like and female-like group which selected by marker-assisted selection. Testcrosses were also made between three testers and the materials selected by marker-assisted selection and breeding experience in early generation， respectively. Yield experiments and comprehensive evaluation of 2 780 hybrids were then conducted in Shunyi of Beijing and Yuxian of Hebei. 【Result】 Marker-assisted selection significantly improved the selection efficiency in the separate communities. In the F4generation， the similarity to the male parent and the female parent of selected materials could be as high as 79.5% and 73.7%， respectively. The similarity to the parents was much higher than that under the condition of random selection. Genetic distance between the materials from the male-like group and the female-like group was large and the maximum was 86%. Phenotypic analysis showed that the average plot yield of hybrid combinations between the male-like group and the female-like group was higher than that of hybrid combinations within each of the two groups， and there were no combinations whose yield exceeded the control （the original hybrid， JB1）. Meanwhile， in this study， the testcrosses generated from the male-like materials displayed stronger heterosis and had higher plot yields than those generated from the female-like materials and the materials selected by breeding experience. There also existed some hybrid combinations whose yields exceeded the control.【Conclusion】The study proposed a technical route of SSR marker-assisted germplasm development based on maize hybrids which could be useful in promoting use efficiency of maize hybrids.

maize； hybrids； germplasm resources； marker-assisted selection； germplasm development

2016-04-26；接受日期：2016-07-21

國(guó)家“十二五”科技支撐計(jì)劃（2013BAD01B02-3）、農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專(zhuān)項(xiàng)、作物種質(zhì)資源保護(hù)與利用專(zhuān)項(xiàng)（201303007；2015NWB030-04）、中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院創(chuàng)新工程

聯(lián)系方式：從春生，E-mail：congchunsheng@126.com。通信作者黎裕，E-mail：liyu03@caas.cn。通信作者王天宇，E-mail：wangtianyu@263.net