袁 鑫，夏 露，孫文強(qiáng)，王繼文，*

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，四川 成都　625014； 2.成都農(nóng)業(yè)科技職業(yè)學(xué)院，四川 成都　611130）

鵝顆粒細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子GATA結(jié)合蛋白4（GATA4）真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

袁 鑫1，2*，夏 露1，孫文強(qiáng)1，王繼文1，*

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，四川 成都625014； 2.成都農(nóng)業(yè)科技職業(yè)學(xué)院，四川 成都611130）

【目的】本研究旨在構(gòu)建鵝顆粒細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子GATA結(jié)合蛋白4（GATA4）綠色熒光蛋白表達(dá)載體pEGFP-N1/GATA4，為研究GATA4在鵝顆粒細(xì)胞中功能作用奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。【方法】原代培養(yǎng)鵝顆粒細(xì)胞，取細(xì)胞總RNA，RT-PCR擴(kuò)增出GATA4 cDNA基因片段，克隆連接至載體PMD19-T，用限制性內(nèi)切酶EcoRI及BanHI酶切，鑒定克隆產(chǎn)物為所需的目的基因片段后，膠回收目的基因，并進(jìn)行序列測定，然后將上述膠回收產(chǎn)物與載體pEGFP-N1連接，導(dǎo)入感受態(tài)DH5α，菌液涂于含卡那霉素瓊脂糖平板上，挑取抗性單菌落，進(jìn)行質(zhì)粒DNA擴(kuò)增，酶切及測序鑒定，證實(shí)均為陽性克隆，即GATA4與pEGFP-N1體外重組成功?！窘Y(jié)論】采用體外重組技術(shù)，成功將鵝GATA4 cDNA插入熒光蛋白表達(dá)載體pEGFP-N1中。

GATA4；真核表達(dá)載體；質(zhì)粒pEGFP-N1；克隆

GATA家族能與核酸共同序列（A/T）GATA（A/G）相結(jié)合的一類轉(zhuǎn)錄因子，包括6個成員，即GATA1、2、3、4、5和6。其中，只有GATA4和GATA6在卵巢顆粒細(xì)胞中共同表達(dá)，GATA4與小鼠、豬、人等的卵巢顆粒細(xì)胞分化、增殖、凋亡以及卵泡閉鎖等功能關(guān)系密切；而GATA6在卵巢顆粒細(xì)胞中功能尚不清楚。目前有關(guān)探討GATA4和GATA6在鵝卵巢顆粒細(xì)胞中的功能研究報(bào)道較少，本實(shí)驗(yàn)以天府肉鵝母系為試驗(yàn)材料，構(gòu)建GATA4真核表達(dá)載體，從而為進(jìn)一步研究GATA4對下游靶基因、類固醇激素合成、顆粒細(xì)胞增殖凋亡等奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

異丙醇、氯仿、無水乙醇和氯化鈉等試劑均為國產(chǎn)；DNA Marker 2000、 Master Mix等均從北京天根公司購買；胰蛋白胨（Tryptone）、酵母提取物（Yeast Extract）、瓊脂粉、PMD19-T 載體試劑盒購自大連寶生物工程有限公司；提取總RNA所用TRIzol Reagent為Invitrogen 公司產(chǎn)品；Plasmid mini Preparation Kit（200）質(zhì)粒提取試劑盒購于碧云天生物技術(shù)研究所。引物的合成和序列測定由上海生工完成。

1.1.2質(zhì)粒與菌株質(zhì)粒pEGFP-N1由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物遺傳育種研究所提供，DH5α感受態(tài)細(xì)胞購自天根生化科技（北京）。

1.2方法

1.2.1鵝原代顆粒細(xì)胞培養(yǎng)

取高產(chǎn)期四川白鵝卵巢，分離卵泡的顆粒層，接種于含有10 %胎牛血清、青霉素100 U/mL及鏈霉素100 U/mL的DMEM培養(yǎng)液中，于37 ℃、5 %CO2、飽和溫濕度下培養(yǎng)，每兩天換液1次。

1.2.2細(xì)胞總RNA的提取

培養(yǎng)的鵝顆粒細(xì)胞，1 000 rpm離心6 min，收集細(xì)胞。以TRIzol試劑盒抽提細(xì)胞總RNA，紫外分光光度法測定A260/A280，使用的標(biāo)本符合A260/A280介于1.8～2.0

削弱社會大眾由于“楊麗娟事件”的“污名化”運(yùn)動對粉絲群體形成的刻板認(rèn)知，讓更多人看到粉絲形象積極的一面。

1.2.3鵝GATA-4基因擴(kuò)增片段的引物設(shè)計(jì)及合成

根據(jù)GATA4基因序列（登陸號：KC454275）設(shè)計(jì)引物T1、T2擴(kuò)增全長GATA4，上下游引物分別在5’端引入EcoRI及BanHI酶切位點(diǎn)，上游引物T1為：5’-CCGGAATTCATGTACCAGAGCTTAGCCA-3’；下游引物T2為：5’-CGCGGATCCTTATGCCGTTATGA TGTCCC-3’。產(chǎn)物長度1 236 bp。

1.2.4RT-PCR體外擴(kuò)增目的基因片段

參照上述提取RNA步驟提取鵝顆粒細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA。PCR擴(kuò)增目的基因，擴(kuò)增的反應(yīng)體系，反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變形30 s，49 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，40個反應(yīng)循環(huán)，72 ℃最后延伸5 min。

1.2.5目的基因片段PCR產(chǎn)物的純化、克隆

PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5 %瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定，膠回收PCR產(chǎn)物，克隆連接至PMD19-T，將克隆有目的基因GATA4的重組質(zhì)粒PMD19-T/GATA4進(jìn)行酶切驗(yàn)證，并進(jìn)行序列測定，以檢測其核苷酸序列與GATA4基因序列的編碼區(qū)是否完全一致。EcoRⅠ和BamH I酶切位點(diǎn)已事先添加在目的基因GATA4上下游。

1.2.6重組載體pEGFP-N1/TNFR 1的構(gòu)建、篩選與鑒定

將上述酶切產(chǎn)物與載體pEGFP-N1連接，連接產(chǎn)物室溫下過夜，然后將新質(zhì)粒導(dǎo)入感受態(tài)DH5α，菌液涂于含卡那霉素瓊脂糖平板上，37 ℃過夜培養(yǎng)，挑取抗性單菌落，進(jìn)行質(zhì)粒DNA擴(kuò)增，應(yīng)用質(zhì)粒提取試劑盒抽提質(zhì)粒DNA，用EcoR I和

BamH I限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，1.5 %瓊脂糖凝膠電泳篩選，最終篩選出質(zhì)粒并再次進(jìn)行目的基因的測序驗(yàn)證。

2　結(jié)果

2.1卵巢RNA提取結(jié)果

本試驗(yàn)采用Trizol法進(jìn)行鵝顆粒細(xì)胞總RNA提取，經(jīng)1.5 %瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示（圖1），18S和28S條帶清晰，5S條帶較弱，表示得到的RNA無降解，無DNA污染，可以進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

2.2質(zhì)粒的鑒定

所有產(chǎn)物在1.5 %瓊脂糖上進(jìn)行檢測（圖2），GATA4 cDNA全1 236 bp（1.2 kb），之后連接到pMD19-T載體上，通過EcoR I和BamH I進(jìn)行雙酶切，電泳圖如圖2B所示，產(chǎn)生2條帶，一條1.2 kb左右的目的帶，一條2.7 kb左右的載體帶。酶切后進(jìn)一步的連接到pEGFP-N1載體上，雙酶切后電泳檢測，圖2C所示，一條目的帶（1.2 kb）和一條載體帶（4.7 kb）。挑選陽性克隆并測序，與之前獲得并提交的GATA-4序列完全一致。

2.4重組質(zhì)粒pEGFP-N1/GATA4插入GATA4基

因核苷酸序列的測定。

測序結(jié)果顯示重組質(zhì)粒pEGFP-N1/GATA4中插入基因長1 236 bp，為一開放閱讀框架，與Genebank中公布的鵝GATA4 mRNA基因完全相符，且方向正確。

3　討論

在前期實(shí)驗(yàn)中，我們已經(jīng)報(bào)道了GATA4基因完整編碼區(qū)序列、分子結(jié)構(gòu)，以及在鵝卵泡發(fā)育過程中的表達(dá)模式［1］。研究已證實(shí)GATA4在類固醇生成、性別分化和細(xì)胞凋亡方面具有重要的作用［2］，其在卵巢方面的功能作用就是調(diào)節(jié)GATA依賴性的靶基因的翻譯后修飾［3］，GATA4磷酸化水平是由cAMP通過PKA途徑進(jìn)行調(diào)節(jié)的［4］，磷酸化增加了GATA4的DNA結(jié)合能力并且反式激活下游多個靶基因的啟動子，包括STAR［5］、CYP19A1［6］、CYP11A1［7］、BCL2［8］、INHA［9］、GnRHR［10］等與卵泡發(fā)育有重要作用的基因。

此外，GATA4表達(dá)的上調(diào)伴隨著人和小鼠初級卵泡顆粒細(xì)胞的快速增殖［11］，下調(diào)GATA4表達(dá)則與鼠的顆粒細(xì)胞凋亡有關(guān)，并且伴隨著成年小鼠卵巢的閉鎖［12］。促性腺激素（PMSG、FSH）也對GATA4的表達(dá)具有上調(diào)作用［12］。這些都表明GATA4是多種類固醇激素合成基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控者，通過激活器目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄，介導(dǎo)和調(diào)節(jié)類固醇激素正常分泌與表達(dá)過程，間接參與顆粒細(xì)胞分化及凋亡調(diào)節(jié)，從而調(diào)節(jié)卵泡的發(fā)育。

本試驗(yàn)欲為了深入研究GATA4調(diào)節(jié)鵝卵巢顆粒細(xì)胞中重要的GATA依賴性的靶基因的翻譯后修飾的功能，首次成功構(gòu)建了GATA4真核表達(dá)載體pEGFP-N1/GATA4，為后續(xù)研究GATA4基因怎樣通過翻譯后修飾調(diào)控靶基因的功能以及對顆粒細(xì)胞增值凋亡，卵泡發(fā)育的影響等奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

S835

A

1001-0769（2016）10-0058-03

袁袁鑫（1990- ），男，漢族，碩士研究生。助教，從事禽類育種與研究工作。

**通信作者：王繼文（1964- ），男，博士研究生，教授，從事禽類育種與研究工作。