閃伊紅 王進(jìn)產(chǎn) 郭麗霞 閔亞杰 孫進(jìn)忠

（普萊柯生物工程股份有限公司，河南 洛陽 471300）

豬圓環(huán)病毒2型培養(yǎng)工藝研究

閃伊紅 王進(jìn)產(chǎn) 郭麗霞 閔亞杰 孫進(jìn)忠*

（普萊柯生物工程股份有限公司，河南 洛陽 471300）

本文在豬圓環(huán)病毒2型轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)工藝基礎(chǔ)上，利用NBS生物反應(yīng)器和無血清培養(yǎng)基進(jìn)行PK15-B1細(xì)胞培養(yǎng)，增殖豬圓環(huán)病毒2型病毒液，探索簡化PCV2病毒液生產(chǎn)工藝、降低生產(chǎn)成本的方法，為今后用生物反應(yīng)器微載體系統(tǒng)生產(chǎn)PCV2病毒液提供了科學(xué)依據(jù)。

PCV2生物反應(yīng)器 微載體 無血清培養(yǎng)基 低血清培養(yǎng)基

豬圓環(huán)病毒2型（Porcine Circovirus Type 2，PCV2）感染可引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（PMWS）、豬呼吸疾病綜合征（PRDC）、豬皮膚和腎病綜合征（PDNS）等多種疾?。偡Q為豬圓環(huán)病毒病，PCVDs），其臨床特征為體重逐漸減輕，呼吸急促、呼吸困難和黃疸。病理學(xué)主要表現(xiàn)為淋巴細(xì)胞浸潤，淋巴結(jié)病以及較罕見的肝炎和淋巴細(xì)胞或肉芽腫性腎炎。感染PCV2的豬死亡率增高、飼料報(bào)酬降低，也給我國的養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

傳統(tǒng)的PCV2疫苗生產(chǎn)方式大多是用轉(zhuǎn)瓶為細(xì)胞提供貼附表面，每個(gè)轉(zhuǎn)瓶都是一個(gè)獨(dú)立的細(xì)胞培養(yǎng)單元，其細(xì)胞質(zhì)量、病毒產(chǎn)量和滴度均不同，導(dǎo)致疫苗批間差異大、操作勞動(dòng)強(qiáng)度高，隱性污染也會(huì)引起高內(nèi)毒素。微載體系統(tǒng)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)自1967年被用于動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)，使動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)入高密度培養(yǎng)階段，經(jīng)過幾十年的發(fā)展，該技術(shù)已日漸完善和成熟，正逐漸取代轉(zhuǎn)瓶的生產(chǎn)模式。生物反應(yīng)器技術(shù)雖然在一定程度上解決了轉(zhuǎn)瓶技術(shù)的部分缺陷，但仍不能擺脫轉(zhuǎn)瓶生產(chǎn)過程中所需要添加血清的缺點(diǎn)，朱文靜［1］等指出無血清培養(yǎng)基是不需要添加血清就可以維持細(xì)胞在體外正常生長繁殖的合成培養(yǎng)基，其克服了含血清培養(yǎng)存在潛在污染源及不利于下游分離純化等缺點(diǎn)；因此，在微載體細(xì)胞培養(yǎng)中采用不添加血清的培養(yǎng)基，成為細(xì)胞培養(yǎng)的研究熱點(diǎn)。微載體生物反應(yīng)器培養(yǎng)PCV2在接毒后需要培養(yǎng)4～7天進(jìn)行病毒收獲，且收獲1次，生產(chǎn)成本較高［2］。為此，本試驗(yàn)研究并探討利用生物反應(yīng)器獲得一種豬圓環(huán)病毒2型大規(guī)模培養(yǎng)的方法，以克服上述缺陷，用于制備低成本、高質(zhì)量的豬圓環(huán)病毒2型疫苗。

1 試驗(yàn)材料

1.1 細(xì)胞

PK15-B1為PK15細(xì)胞的克隆株，由普萊柯生物工程股份有限公司繁殖、鑒定和保存。

1.2 種毒

豬圓環(huán)病毒2型SH株（Porcine Circovirus Type 2，SH strain），由普萊柯生物工程股份有限公司繁殖、鑒定和保存。

1.3 培養(yǎng)基

Invitrus VP6培養(yǎng)基為瑞士CCT公司產(chǎn)品，OptiMEM培養(yǎng)基為Gibco公司產(chǎn)品，LSM-204培養(yǎng)基為北京賽百泰公司產(chǎn)品。

1.4 硅化劑

購自sigma公司，貨號(hào)SL-2。

1.5 CelliGen生物反應(yīng)器

購自NBS公司，型號(hào)：Celligen115，工作體積1L；型號(hào)：CelliGen310，工作體積10L。

1.6 PBS緩沖液配制方法

NaCl 8.0g，KCl 0.2g，KH2PO40.24g，Na2HPO4·12H2O 3.628g，溶于800ml蒸餾水中，用鹽酸調(diào)pH值為7.4，蒸餾水定容至1000ml，121℃高壓滅菌20min，室溫保存。

1.7 球狀微載體

Cytodex-1，購自GE公司。Cytodex-1球狀微載體使用前處理：Cytodex-1經(jīng)無Ca2+、Mg2+離子的PBS緩沖液清洗并浸泡3h，所用浸泡的玻璃容器應(yīng)提前用硅化劑處理，經(jīng)121℃ 25min高壓滅菌后，4℃密封保存?zhèn)溆?，使用前?7℃的細(xì)胞培養(yǎng)液清洗3遍。

1.8 轉(zhuǎn)瓶

3000ml轉(zhuǎn)瓶，工作體積300ml。

2 試驗(yàn)方法

2.1 方瓶中培養(yǎng)基篩選

復(fù)蘇PK15-B1細(xì)胞，用瑞士CCT、Gibco、北京賽百泰等三種無血清或低血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，以常規(guī)基礎(chǔ)培養(yǎng)基MEM（Gibco公司，使用時(shí)加入5%胎牛血清）作為對(duì)照組。采用直接適應(yīng)法篩選培養(yǎng)基：將細(xì)胞直接從添加5%血清的MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基轉(zhuǎn)換到上述3種無血清或低血清培養(yǎng)基中，細(xì)胞初始接種量在0.3×106個(gè)/ml，T-75方瓶 20ml體積，37℃ 5% CO2培養(yǎng)。每種培養(yǎng)基接種7瓶細(xì)胞，培養(yǎng)7天觀察細(xì)胞適應(yīng)情況，期間每隔24h取1瓶細(xì)胞，胰酶消化后計(jì)數(shù)。培養(yǎng)72h-96h，細(xì)胞密度達(dá)到2.0×106個(gè)/ml，細(xì)胞活率在95%時(shí)，表明細(xì)胞已完全適應(yīng)了該無血清或低血清培養(yǎng)基。

2.2 微載體生物反應(yīng)器培養(yǎng)種子細(xì)胞制備

PK15-B1細(xì)胞在3000ml轉(zhuǎn)瓶中用OptiMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)形成良好致密單層，胰蛋白酶消化后制備成單個(gè)細(xì)胞懸液，為生物反應(yīng)器培養(yǎng)提供種子細(xì)胞；生物反應(yīng)器安裝好后，進(jìn)行pH電極校正。在罐體內(nèi)加入PBS，夾套內(nèi)加入純水，高壓蒸汽滅菌30min。冷卻后安裝到反應(yīng)器控制系統(tǒng)上，連接Air、N2、O2和CO2四種氣路，校正DO電極后，將罐內(nèi)PBS壓出，加入適量的微載體和細(xì)胞種子，參數(shù)設(shè)定：DO為50%的空氣飽和度，攪拌速度65r/min，溫度37℃，pH值7.2。

（1）Celligen115中微載體培養(yǎng)初始細(xì)胞密度優(yōu)化Celligen115，工作體積1L，接種細(xì)胞懸液到已硅化處理過的含微載體接入量10g/L的生物反應(yīng)器中，細(xì)胞初始接入密度分別為：0.25×106個(gè)/ml、0.5×106個(gè)/ml、0.75×106個(gè)/ml，使用篩選出的OptiMEM培養(yǎng)基（不添加血清）培養(yǎng)，比較不同細(xì)胞密度在微載體培養(yǎng)時(shí)維持最長時(shí)間及培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞所能達(dá)到的最高細(xì)胞密度。

（2）Celligen115中微載體接入量優(yōu)化Celligen115，工作體積1L，按細(xì)胞初始密度0.5×106個(gè)/ml接種細(xì)胞懸液到已硅化處理過的含微載體接入量分別為3g/L、5g/L、10g/L的生物反應(yīng)器中。同步接種圓環(huán)病毒PCV-SH株，接毒劑量按M.O.I.=0.2，補(bǔ)加300ml OptiMEM培養(yǎng)基。接毒后采用攪拌30min，停止15min的方法周期間歇性的攪拌維持2h促進(jìn)細(xì)胞貼壁與病毒結(jié)合，2h后補(bǔ)加OptiMEM培養(yǎng)基至生物反應(yīng)器工作體積1L。生物反應(yīng)器設(shè)置參數(shù)為DO為50%，攪拌轉(zhuǎn)速 65rpm，pH值7.2，采用壓縮Air、O2、N2和CO2四氣模式條件培養(yǎng)。比較不同微載體接入量對(duì)PCV2病毒的影響。

2.3 微載體生物反應(yīng)器增值PCV2病毒

生物反應(yīng)器工作體積為10L，微載體濃度10g/L。PK15-B1細(xì)胞在3000ml轉(zhuǎn)瓶中用OptiMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)形成良好致密單層，胰蛋白酶消化后制備成單個(gè)細(xì)胞懸液，為生物反應(yīng)器培養(yǎng)提供種子細(xì)胞。

接種細(xì)胞懸液到已硅化處理過的含微載體的生物反應(yīng)器中，接種初始細(xì)胞密度0.5×106個(gè)/ml。同步接種圓環(huán)病毒PCV-SH株，接毒劑量按M.O.I.=0.2，補(bǔ)加3000ml OptiMEM培養(yǎng)基。接毒后采用攪拌30min，停止15min的方法周期間歇性的攪拌維持2h促進(jìn)細(xì)胞貼壁與病毒結(jié)合，2h后補(bǔ)加OptiMEM培養(yǎng)基至生物反應(yīng)器工作體積10L。生物反應(yīng)器設(shè)置參數(shù)為DO為50%，攪拌轉(zhuǎn)速 65rpm，采用壓縮Air、O2、N2和CO2四氣模式條件培養(yǎng)。在CelliGen310接種PCV2病毒連續(xù)試驗(yàn)2批，控制參數(shù)一致。

2.4 病毒收獲

本試驗(yàn)研究采用連續(xù)收獲法：接毒后72h、96h、120h、144h、168h各收獲1個(gè)體積病毒液，每次收獲時(shí)設(shè)定自動(dòng)補(bǔ)料程序，一邊補(bǔ)料（補(bǔ)加等體積的OptiMEM培養(yǎng)基）一邊收獲，收獲的病毒液-20℃保存。每次收毒時(shí)取樣測定病毒含量。

2.5 病毒滴度測定

對(duì)收獲的病毒液分別采用間接免疫熒光法［3］測定病毒含量：取待測病毒液做十倍系列稀釋，接入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，100μL/孔，同時(shí)接種PK15-B1細(xì)胞2.0×104/孔細(xì)胞培養(yǎng)板置于37℃，5% CO2培養(yǎng)5日，進(jìn)行熒光染色判定。出現(xiàn)熒光的即判定該孔細(xì)胞感染，按Reed-Muench法計(jì)算病毒半數(shù)感染量（TCID50）。

3 結(jié)果

3.1 PK15-B1細(xì)胞培養(yǎng)基篩選

VP-6、OptiMEM、LSM-20三種培養(yǎng)基及添加血請(qǐng)的MEM培養(yǎng)培養(yǎng)PK15-B1細(xì)胞的密度及活率見圖1，由圖1看出，同樣的初始接種密度，在VP-6和LSM-204培養(yǎng)基中，細(xì)胞分別可維持120h和96h，不加血清的OptiMEM培養(yǎng)基中，細(xì)胞可維持168h，且細(xì)胞活率在90%以上，細(xì)胞密度達(dá)到2.64×106個(gè)/ml，與添加血清的MEM培養(yǎng)基相當(dāng)。選用OptiMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)PK15-B1細(xì)胞，每隔72h傳代一次，連續(xù)傳8代，細(xì)胞狀態(tài)良好且能穩(wěn)定增殖見圖2。

圖2 OptiMEM培養(yǎng)基 72h（10×）

3.2 Celligen115中微載體培養(yǎng)初始細(xì)胞密度優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

不同接種細(xì)胞密度在生物反應(yīng)器中用OptiMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)PK15-B1細(xì)胞，結(jié)果表明：初始細(xì)胞密度0.25×106個(gè)/ml，培養(yǎng)至第10天時(shí)，細(xì)胞密度達(dá)到最高3.0×106個(gè)/ml；初始細(xì)胞密度0.5×106個(gè)/ml，培養(yǎng)至第8天時(shí)，細(xì)胞密度達(dá)到最高3.52×106個(gè)/ ml；初始細(xì)胞密度0.75×106個(gè)/ml，培養(yǎng)至第6天時(shí)，細(xì)胞密度達(dá)到最高3.80×106個(gè)/ml。由于病毒含量的高低與細(xì)胞密度有關(guān)，因此在生物反應(yīng)器中增值PCV2以接種細(xì)胞密度0.5～0.75×106個(gè)/ml為宜，見圖3A和B。

圖3 A初始密度0.5×106個(gè)/ml-培養(yǎng)3天（10×）圖3 B初始密度0.5×106個(gè)/ml-培養(yǎng)8天（10×）

3.3 Celligen115中微載體接入量優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

接種PK15-B1細(xì)胞0.5×106個(gè)/ml，同步接種圓環(huán)病毒PCVSH株，接毒劑量M.O.I.=0.2，接毒后72h第一次收獲病毒液，之后每天收獲1個(gè)體積（1L）連續(xù)收獲5天。收獲后病毒液-20℃保存；結(jié)果表明：微載體接入量3g/L時(shí)，PCV2病毒含量最低，為106.2TCID50/ml；5g/L時(shí)，PCV2病毒含量為107.0TCID50/ml；10g/L時(shí)，PCV2病毒含量最高，為107.4TCID50/ml以上。為此在生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)時(shí)微載體接入量為10g/L。具體結(jié)果見表1。

表1 不同微載體接入量對(duì)PCV2病毒的影響（10xTCID50/mL）

3.4 PK15-B1細(xì)胞微載體生物反應(yīng)器中增殖PCV2病毒連續(xù)收獲

生物反應(yīng)器工作體積為10L，微載體濃度為10g/L，使用OptiMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)PK15-B1細(xì)胞增殖PCV2病毒（不加血清）；初始接種細(xì)胞密度為0.5×106個(gè)/ml，同步接種圓環(huán)病毒PCV-SH株，接毒劑量M.O.I.=0.2，接毒后72h第一次收獲，之后每天收獲1個(gè)體積（10L）連續(xù)收獲5天。收獲后病毒液-20℃保存；連續(xù)培養(yǎng)2批，其病毒滴度均不低于107.4TCID50/ml，病毒滴度測定結(jié)果見圖4。

圖4 生物反應(yīng)器2批試驗(yàn)收獲5天PCV2病毒含量結(jié)果（10-×TCID50/ml）

4 討論

目前，國內(nèi)用PK15或PK15-B1細(xì)胞培養(yǎng)豬圓環(huán)病毒2型，均需要添加血清來維持細(xì)胞生長和病毒增殖［4-5］，生物反應(yīng)器培養(yǎng)時(shí)，血清的添加會(huì)產(chǎn)生大量氣泡，增加對(duì)細(xì)胞的剪切力［6］，本研究篩選出一種OptiMEM低血清培養(yǎng)基，不需添加血清，攪拌時(shí)可大量減少氣泡的生成，降低細(xì)胞剪切力，細(xì)胞可高密度快速繁殖；另一方面，在工藝上簡化操作流程，減少污染，降低生產(chǎn)成本，同時(shí)由于培養(yǎng)過程中不含血清避免血清中外源蛋白對(duì)動(dòng)物機(jī)體的副反應(yīng)，提升疫苗本身的安全性。

國內(nèi)生產(chǎn)的豬圓環(huán)病毒2型疫苗在細(xì)胞培養(yǎng)和病毒增值過程中，不能達(dá)到高細(xì)胞密度和高病毒滴度。本研究通過在生物反應(yīng)器微載體培養(yǎng)時(shí)的初始接種密度和微載體接入量的優(yōu)化，使該懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)所培養(yǎng)的PK15-B1細(xì)胞能達(dá)到高細(xì)胞密度3.52～3.80×106個(gè)/ml；利用NBS生物反應(yīng)器自動(dòng)補(bǔ)料程序收獲病毒液，實(shí)現(xiàn)了連續(xù)收獲5d，病毒滴度均不低于107.4TCID50/ml，提高了病毒收獲率，為規(guī)?；a(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

綜上所述，本研究探索了一種豬圓環(huán)病毒2型無血清大規(guī)模培養(yǎng)的方法，并對(duì)提高病毒收獲率進(jìn)行了初步探討，為進(jìn)行百升級(jí)體積的微載體在生物反應(yīng)器內(nèi)增殖PCV2病毒的放大培養(yǎng)研究提供了重要信息。

［1］ 王林山，尹燕博.PCR和IFA測定豬圓環(huán)病毒2型半數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)感染量的比較［J］.上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2013，29（1）：34-38.

［2］ 何錫忠，李春華，倪建平等：用微載體系統(tǒng)培養(yǎng)PK15細(xì)胞生產(chǎn)豬圓環(huán)病毒2型［J］.上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào) 2010.26（4）：149-151

［3］ 李智力，易小萍.細(xì)胞微載體懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)豬細(xì)小病毒的工藝研究［J］.中國生物工程雜志China Biotechnology，2015，35（7）：62-67.

公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)（201303046）資助

閃伊紅（1986-），女，河南伊川人，大專，主要從事生物反應(yīng)器的應(yīng)用與動(dòng)物疫苗的開發(fā)。

孫進(jìn)忠